يوضح هذا البحث نهجا جديدا لدراسة علاجات سرطان الزائدة الدودية وعلم الأمراض في بيئة ما قبل السريرية. قد تكون هذه الطرق قابلة للتطبيق على نطاق أوسع لدراسة الأورام الخبيثة الأخرى. من الصعب دراسة سرطان الزائدة الدودية نظرا لانخفاض معدل حدوثه في حالة عدم وجود ملحق في الفئران لنمذجة المرض.
تسمح هذه التقنية بدراسة تفاعلات الخلايا داخل البيئة المكروية للورم. يمكن تطبيق هذه الطريقة لدراسة بيولوجيا أنواع متعددة من السرطانات التي لديها ميل للانتقال إلى الثرب ، مثل سرطان القولون والمستقيم والمبيض. ابدأ بإعداد وسائل النقل والثقافة.
عند وصول الأنسجة ، انقل أنسجة ورم الورم المخاطي الصفاق الكاذب إلى 35 DMEM كاملة تحتوي على أطباق قطرها ستة سنتيمترات. بالإضافة إلى إزالة أي موسين مسال ، أو مناطق أنسجة شديدة المخاطية ، قم بإزالة أي نسيج يصعب قطعه بمشرط. قطع عقيدات أنسجة الورم تقريبا إلى قطع مكعبة واحدة أصغر سنتيمترا.
لتحضير الأغاروز وتضمين الأنسجة ، قم بإعداد محلول 5٪ من الأغاروز منخفض الذوبان في برنامج تلفزيوني بدون مصل بقري جنيني أو FBS في نفس اليوم في حالة وصول الأنسجة. أضف محلول الأغاروز السائل 5٪ إلى أطباق الستة سنتيمترات التي تحتوي على عينتين إلى ثلاث عينات ورم أصغر حتى تغطي العينة. ضع المناديل المدمجة في ثلاجة أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.
قم بفك عينات الأنسجة على الاهتزاز ، وأزل البريمة الصلبة من الثلاجة ، وقطع مكعبات الأغاروز أكبر قليلا من عرض الأنسجة باستخدام مشرط. ضع الغراء الفائق على مرحلة الاهتزاز وضع مكعب الأغاروز برفق على الغراء الفائق لمدة دقيقة إلى دقيقتين للتثبيت. ثبت الشفرة على الاهتزاز ، واضبط سمك قسم الأنسجة على ما يقرب من 150 إلى 250 ميكرون للحصول على تصوير مثالي في اتجاه مجرى النهر.
لزراعة شرائح الأنسجة ، قم بإعداد لوحة إدخال قابلة للنفاذ عن طريق إضافة ملليلتر من وسائط DMEM الكاملة فوق الغشاء القابل للنفاذ وثلاثة ملليلتر أسفل الغشاء القابل للاختراق. بعد ذلك ، ارفع شرائح الأنسجة برفق من غرفة القطع في الاهتزاز باستخدام فرشاة رسم رقيقة ، وضع شريحتين إلى أربع شرائح في أطباق استزراع قابلة للاختراق تحتوي على DMEM كامل. استزرع الشرائح لمدة تصل إلى سبعة أيام عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
أثناء استبدال الوسائط ، كل 24 ساعة ، أضف بورتيزوميب كضوابط لقتل الخلايا ، والعلاجات الكيميائية القابلة للاختبار 5-فلورويوراسيل ، أو 5-فو ، إلى وسائط الثقافة لإجراء التدخل الدوائي. ضع شرائح الورم لتحليل التصوير متحد البؤر في بئر واحد من طبق مكون من 12 بئرا يحتوي على برنامج تلفزيوني مع 1٪ FBS. لتجارب تصوير الكالسيوم ، بدلا من PBS ، احتضان الشرائح في محلول الكالسيوم الخلوي الإضافي.
عينات البقع مع أصباغ التصوير لتحديد صلاحية شرائح الأنسجة. احتضان لمدة 10 دقائق إلى ساعة واحدة بعد إضافة صبغة البقاء. بعد الحضانة ، انقل الشرائح إلى طبق بتري زجاجي شفاف بصريا يحتوي على PBS مع 1٪ FBS لاستخدامه في التصوير على جهاز تصوير متحد البؤر.
اقطع قطعة صغيرة من نهاية طرف ماصة سعة ملليلتر واحد لتوسيع الفتحة ، مما يسمح بتفكك ميكانيكي قوي عن طريق الماصة. احتضان الشرائح عند 37 درجة مئوية مع الدوران لمدة خمس إلى 15 دقيقة في ملليلتر واحد من محلول الهضم ، مع اضطراب الأنسجة القوي مرتين إلى ثلاث مرات أثناء الحضانة باستخدام التفكك الميكانيكي. بمجرد هضم الأنسجة ، انقل الأنسجة المعطلة باستخدام وسائط الهضم على مرشح 70 ميكرومتر يوضع فوق أنبوب مخروطي 50 ملليلتر.
اختر قطعا أكبر باستخدام ملقط معقم أو ماصة. باستخدام الواجهة الخلفية الحادة لحقنة بلاستيكية سعة خمسة ملليلتر ، اهرس أي شرائح أكبر غير منفصلة واغسلها بأربعة ملليلتر من PBS تحتوي على 2٪ FBS. خذ طاف الخلية المنفصل وأجهزة الطرد المركزي عند 300 جرام لمدة خمس إلى 10 دقائق.
قم بإزالة المادة الطافية واغسل الحبيبات بمليلتر واحد من PBS يحتوي على 2٪ FBS. لتحضير العينة لقياس التدفق الخلوي ، أضف المخزن المؤقت المانع الذي يحتوي على 50 ميكرولترا من كتلة FC البشرية ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. قم بإجراء تلطيخ خلوي إضافي باستخدام الأجسام المضادة المعنية في 50 ميكرولتر من PBS تحتوي على 2٪ FBS.
Aliquot خمسة ملليلتر من الوسائط الكاملة للتحكم وظروف العلاج. على شريحتين إلى أربع شرائح مطلية على الأطباق القابلة للنفاذ ، أضف الوسائط من حصص علاج التحكم والعلاجات المركبة الإضافية لاستخدامها في الجدوى النهائية ، وتحليل الموتى الأحياء. اترك شرائح الأنسجة في مزرعة تحتوي على DMEM كاملة لمدة يومين إلى خمسة أيام ، وقم بتغيير الوسائط أيضا bortezomib و 5-FU كل يوم.
لتحليل جدوى الإنارة ، أضف 500 ميكرولتر من PBS إلى طبق مكون من 12 بئرا ، وانقل شرائح الأنسجة المتطابقة بالتتابع إلى محلول PBS باستخدام فرشاة رسم أو ماصة سعة ملليلتر واحد. قم بإزالة برنامج تلفزيوني من الشرائح. أضف 500 ميكرولتر من محلول صلاحية الإنارة لكل حالة واحتضانها مع دوران بطيء على شاكر في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة قبل قراءة التلألؤ باستخدام قارئ لوحة التلألؤ.
تم تصوير تلطيخ الميوسين في شرائح الأنسجة باستخدام تلطيخ التحول الحمضي الدوري والأجسام المضادة الخاصة بالموسين. الحضانة في الكالسيين AM ويوديد البروبيديوم تحدد الصحة والحيوية. تداخلت النوى مع الخلايا التي تكاثرت أثناء الثقافة.
تم تحديد هذه النتائج لتحديد عدد الخلايا المتكاثرة داخل شريحة الورم. الشرائح المحتضنة في CD11b PE الأجسام المضادة المترافقة و Fluo-4 AM ، المسمى الخلايا المناعية المحلية في CTU. سمحت الصور ذات الألوان الزائفة التي تظهر مستويات الكالسيوم داخل الخلايا بتصور المستويات التفاضلية للكالسيوم داخل الخلايا.
يظهر هنا النشاط التلقائي الذي تم تتبعه والوقت المنقضي قبل وأثناء وبعد استجابة الكالسيوم بين الخلايا داخل الخلية المناعية الإيجابية CD11b المميزة. تم تحديد الآثار الخام لاستجابات الكالسيوم في الخلية المناعية CD11b ، إلى جانب الخلايا الأخرى المستجيبة وغير المستجيبة. يتم عرض النتائج التمثيلية للتنميط المناعي لعينة ورم مريض مصاب بالورم المخاطي الصفاق الكاذب هنا.
أظهر القياس الكمي للملف المناعي للورم أن عينة المتبرع 337 لديها مستويات عالية من الضامة M2 ، مما يشير إلى أن استخدام شرائح الأنسجة المشتقة من الورم المخاطي الصفاق الكاذب سمح باستجواب المشهد الخلوي الفريد للمتبرع لعينات ورم المريض. أظهر التنميط الدوائي وتحليل المصب لشرائح الأنسجة من الأنسجة البشرية الميكروبية الصفاقية الكاذبة قتل الخلايا في شرائح الورم كما أكد تحليل السمية الخلوية والتصوير النفقي متحد البؤر. استجابة للدواء السام للخلايا ، بورتيزوميب و 5-فلورويوراسيل.
تم إجراء تحليل جدوى الإنارة باستخدام شرائح متطابقة بالتتابع. يتطلب الإنتاج الناجح للشرائح من الأورام المخاطية تشريحا دقيقا وإزالة مكونات الأنسجة الخلوية وغير الخلوية مثل الدهون وأنسجة جدار البطن الكثيفة. يمكن أن تسمح هذه التقنية بنمذجة التفاعلات بين الخلايا السرطانية وأنواع الخلايا المتعددة في البيئة المكروية للورم ، مثل تفاعلات الخلايا الدهنية والأوعية الدموية والخلايا المناعية.
