Coltura e imaging di fette tumorali ex vivo di pseudomixoma peritonei organotipico da campioni tumorali umani resecati

Riepilogo

Descriviamo un protocollo per la produzione, la coltura e la visualizzazione dei tumori umani, che hanno metastatizzato alle superfici peritoneali. I campioni tumorali resecati vengono tagliati utilizzando un vibratomo e coltivati su inserti permeabili per una maggiore ossigenazione e vitalità, seguiti da imaging e analisi a valle utilizzando microscopia confocale e citometria a flusso.

Abstract

Lo pseudomixoma peritonei (PMP) è una condizione rara che deriva dalla diffusione di un tumore primario mucinoso e dal conseguente accumulo di cellule tumorali che secernono mucina nella cavità peritoneale. La PMP può derivare da vari tipi di tumori, tra cui appendicolare, ovarico e colon-retto, sebbene le neoplasie appendicolari siano di gran lunga l'eziologia più comune. La PMP è difficile da studiare a causa della sua (1) rarità, (2) modelli murini limitati e (3) istologia mucinosa e acellulare. Il metodo qui presentato consente la visualizzazione e l'interrogazione in tempo reale di questi tipi di tumore utilizzando fette organotipiche ex vivo derivate dal paziente in una preparazione in cui il microambiente tumorale (TME) rimane intatto. In questo protocollo, descriviamo prima la preparazione delle fette tumorali usando un vibratomo e la successiva coltura a lungo termine. In secondo luogo, descriviamo l'imaging confocale delle fette tumorali e come monitorare le letture funzionali della vitalità, l'imaging del calcio e la proliferazione locale. In breve, le fette vengono caricate con coloranti di imaging e vengono poste in una camera di imaging che può essere montata su un microscopio confocale. I video time-lapse e le immagini confocali vengono utilizzati per valutare la fattibilità iniziale e la funzionalità cellulare. Questa procedura esplora anche il movimento cellulare traslazionale e le interazioni di segnalazione paracrina nella TME. Infine, descriviamo un protocollo di dissociazione per fette tumorali da utilizzare per l'analisi della citometria a flusso. L'analisi quantitativa della citometria a flusso può essere utilizzata per test terapeutici da banco a letto per determinare i cambiamenti che si verificano all'interno del panorama immunitario e del contenuto delle cellule epiteliali.

Introduzione

Lo pseudomixoma peritonei (PMP) è una sindrome rara con un tasso di incidenza di 1 per milione di persone all'anno¹. La maggior parte dei casi di PMP sono causati da metastasi da neoplasie appendicolari. Dato che i topi non hanno un'appendice simile a quella umana, modellare questo tipo di cancro rimane estremamente impegnativo. Mentre la malattia primaria è spesso curabile con la resezione chirurgica, le opzioni di trattamento per la malattia metastatica sono limitate. Pertanto, il razionale per lo sviluppo di questo nuovo modello di fetta organotipica è quello di studiare la patobiologia della PMP. Ad oggi, non esistono modelli di organoidi appendicolari che possano essere coltivati perpetuamente; Tuttavia, un modello recente si è dimostrato utile per la sperimentazione farmacologica di agenti terapeutici e immunoterapia². Come tale, abbiamo adattato un sistema di coltura a fetta organotipica, che è stato utilizzato in altri tipi di tumori umani, come cervello, seno, pancreas, polmone, ovaio e altri 3,4,5,6.

Oltre alle neoplasie appendicolari, la PMP occasionalmente deriva da altri tipi di tumore, compresi i tumori ovarici⁷ e, in rare circostanze, neoplasie mucinose papillari intraduttali⁸ e cancro del colon⁹. Inoltre, questi tumori tendono a crescere lentamente, con bassi tassi di innesto nei modelli di xenotrapianto derivato dal paziente (PDX)^10,11. Date queste sfide, c'è un bisogno insoddisfatto di sviluppare modelli per studiare questa malattia per iniziare a capire la patobiologia della PMP e come queste cellule tumorali: vengono reclutate sulle superfici peritoneali, proliferano e sfuggono alla sorveglianza immunitaria.

Mentre tagliate dalla circolazione vascolare sistemica, le fette tumorali contengono componenti cellulari e acellulari, tra cui la matrice extracellulare, le cellule stromali, le cellule immunitarie, le cellule tumorali, le cellule endoteliali e i nervi. Questo microambiente semi-intatto consente l'indagine funzionale di questi tipi di cellule, che è unicamente vantaggioso rispetto alle colture organoidi 3D, che consistono solo di cellule tumorali¹². Mentre le colture organotipiche a fette sono vantaggiose sotto alcuni aspetti, sono anche intrinsecamente un approccio basato su basse entrate, rispetto agli organoidi 3D, che possono essere ampliati e sono adatti per lo screening terapeutico sperimentale multiplex^13,14,15. Nel caso del PMP, non ci sono state segnalazioni che documentassero l'istituzione affidabile e il passaggio perpetuo di organoidi derivati da PMP¹⁶. Ciò è probabilmente dovuto alla natura a crescita lenta delle cellule tumorali derivate da PMP, nonché al basso numero di cellule epiteliali maligne presenti all'interno di questi tumori mucinosi. Data la necessità di sviluppare modelli per studiare la PMP, le fette organotipiche sono particolarmente adatte a studiare questa malattia. Presentiamo un protocollo per la preparazione, l'imaging e l'analisi di PMP da campioni umani.