التحول بوساطة البكتيريا الزراعية هو وسيلة سهلة لإنتاج نباتات البطاطا المعدلة وراثيا. من أجل فهم وظائف الجينات محددة ومساهمتها في فسيولوجيا الجهاز. التحول بواسطة رهيزوجنات البكتيريا الزراعية هو أداة قوية لتقييم الجذور التي تعمل الجينات بسرعة، كما يمكن الحصول على نتائج مماثلة عن طريق التحول الزراعية tumefaciens.
إثبات هذا الإجراء سيكون ساندرا فرنانديز بينان، وهي ما بعد الطبيب، وجنيفر لوبيز، طالبة maste5r من مختبرنا. تبدأ من خلال زراعة مستعمرة واحدة البكتيريا الزراعية بين عشية وضحاها في خمسة ملليلتر من مرق استخراج الخميرة، أو YEB المتوسطة، وتستكمل مع المضادات الحيوية في أنبوب الطرد المركزي 50 ملليلتر في 28 درجة مئوية، في 200 التناوب في الدقيقة الواحدة. لتحويل tumefaciens، وقياس الكثافة البصرية في صباح اليوم التالي.
عندما تصل الكثافة البصرية في 600 نانومتر، أو OD 600 0.6 إلى واحد، الطرد المركزي ملليلتر واحد من ثقافة البكتيريا الزراعية وإعادة تثبيت بيليه في ملليلتر واحد من YEB المتوسطة الطازجة دون المضادات الحيوية. بعد الغسيل الثاني، resuspend بيليه في YEB المتوسطة الطازجة دون المضادات الحيوية، إلى التركيز المناسب للحصول على OD النهائي 600 من 0.8، ووضع الخلايا البكتيرية على الجليد. لتحويل النباتات باستخدام A.rhizogenes، نقل بعناية نبات المانحة من ثقافة متوسطة 2MS إلى 120 في 120 ملليمتر لوحة مربعة، واستخدام إبرة جراحية لحقن ثلاثة ميكرولترات من ثقافة A.rhyzogenes إلى معتقلين الجذعية المختلفة ممكن.
ثم نقل فورا المصنع بأكمله إلى لوحة مربعة جديدة تحتوي على صلبة MS المتوسطة، تستكمل مع acetosyringone 0.1 ميليمولار. بعد وضع مصنع ثان على نفس لوحة، تحولت في نفس الطريقة، وختم لوحة مع الشريط الجراحي، ووضع لوحة عموديا داخل خزانة النمو لمدة أربعة أيام. نقل النبات إلى لوحة مربعة مع MS المتوسطة تكملها الصوديوم cefotaxime لقتل A.rhizogenes ووضع لوحة مختومة عموديا داخل مجلس الوزراء النمو لمدة أربعة أيام.
بعد 10 إلى 12 يوما، سوف تظهر جذور جديدة مشعر. ويمكن تأكيد تحولها عن طريق المجهر ستيريو الفلورسنت. في هذا الوقت، مكوس الجذور الأصلية لكل نبات، ونقل النباتات إلى لوحة مربعة جديدة مع المتوسطة MS، تستكمل مع الصوديوم cefotaxime لقتل A.rhizogenes.
للحصول على نبات مركب، والسماح للجذور المشعرة المعدلة وراثيا تنمو لمدة ثلاثة إلى أربعة أسابيع أخرى في المتوسط MS، تستكمل مع الصوديوم سيفوتاكسيم. لتحويل النباتات باستخدام A.tumefaciens. قطع ووضع ورقة من نبات من ثلاثة إلى أربعة أسابيع القديمة في طبق بتري، واستخدام مشرط لجعل واحد إلى ثلاثة تخفيضات عرضية من وسط ورقة إلى حواف دون قطع قطع من ورقة.
واستبعاد petiole. ضع على الفور ورقة في طبق بتري تحتوي على 10 ملليلتر من 2MS السائلة الطازجة المتوسطة، الجانب abaxial حتى، وتغطية لوحة. بسرعة إضافة 80 ميكرولتررس من ثقافة A.tumefaciens إلى المتوسطة السائلة وتحريك بلطف المتوسطة لمدة دقيقة واحدة لتوزيع المحلول البكتيري بشكل متجانس.
ثم ختم بعناية وتغطية لوحة مع رقائق الألومنيوم لاحتضان لمدة يومين في غرفة 24 درجة مئوية. في نهاية فترة التحول، نقل الأوراق abaxial الجانب حتى، إلى المتوسطة القاسية المحفزة، كشط مع ملاقط لاحتضان لمدة أسبوع واحد في مجلس الوزراء النمو. في نهاية الحضانة، ونقل الأوراق، و abaxial الجانب حتى، على تبادل لاطلاق النار الملتزر كشط الحث المتوسطة، واحتضان الأوراق في مجلس الوزراء النمو.
عندما تكون الزلقان ظهرت حوالي سنتيمترين، وقطع ثلاثة المزالق الناشئة من كل قاسية. ضع ما يصل إلى خمسة أحداث تحويل مظلة مختلفة في قارورة الثقافة الفردية التي تحتوي على قارورة MG المتوسطة المكملة مع الصوديوم cefotaxime للسماح بالتأصيل ، وتسمية المجموعة الفرعية حسب الاقتضاء لاحتضان لمدة ثلاثة إلى أربعة أسابيع في مجلس الوزراء النمو حتى تصبح المزلق قوية. في نهاية الحضانة، حدد المصنع الأكثر قوة من كل حدث، وقطع شرائح من المزلقة مع ثلاثة إلى أربعة internodes من كل مصنع.
ضع الأجزاء في قارورة ثقافية تحتوي على 2MS المتوسطة المكملة مع الصوديوم cefotaxime وتنمو النباتات حتى أنها تطوير المزالق القوية والجذور. لأداء بيتا جلوكرونيديز أو GUS مقايسة الجينات مراسل الهيستوكيميائية, إصلاح الجذور من اثنين إلى ثلاثة أسابيع في زرع النبات في المختبر مع 90٪ الأسيتون المبردة لمدة 20 دقيقة على الجليد. في نهاية التثبيت، وغسل جذور مرتين في الماء المقطر وعلاج الجذور مع حل تلطيخ GUS الطازجة تحت فراغ لمدة 20 دقيقة.
في نهاية العلاج الفراغي، ضع الجذور عند 37 درجة مئوية في الظلام لمدة أربع ساعات. عندما يكون اللون الأزرق مرئيًا، قم بغسل الجذور مرتين بنسبة 70٪ من الإيثانول، وتصور تلطيخ تحت مجهر ميداني مشرق. تظهر الجذور المشعرة المتحولة فلورانس أحمر عندما تضاء بالضوء الأخضر ، في حين أن السيطرة السلبية على البكتيريا الزراعية غير المُنقلة لا تظهر أي فلورانس من هذا القبيل ، مما يشير إلى ملاءمة علامة التحول الحمراء DS لتحديد الجذور المشعرة المعدلة وراثيا.
هنا ، يتم عرض تلطيخ GUS في جذور النباتات المعدلة وراثيا التي تم الحصول عليها من قبل A.tumefaciens والجذور المشعرة المعدلة وراثيا التي حصلت عليها A.rhizogenes. كما لوحظ، والجذور تحولت مع A، tumefaciens ونمت في المختبر، وإظهار تلطيخ الأزرق في endodermis، طبقة الخلية بين القشرة و stele. في جذور أكثر تطورا، ووضع العلامات الزرقاء غير مكتمل في الطبقة الخارجية، المقابلة ل exodermis.
في جذور مشعر متحولة التي حصلت عليها A.rhizogenes، ونمت في الزراعة المائية، وتقع علامة GUS على وجه التحديد داخل endodermis في ظهور جذور جانبية في المناطق الجرحى وفي exodermis. بالإضافة إلى كونها طريقة سريعة ، فإن الجذور المعدلة وراثيا التي تم الحصول عليها مع ريزوجينيات البكتيريا الزراعية حملت أيضًا الحمض النووي من البلازميد المسبب للجذور ، والتي قد تحرر بعض العمليات التي يتم التحكم فيها مباشرة. ويمكن الحفاظ على جذور الشعر المعدلة وراثيا التي تم الحصول عليها مع رهيزوجنات البكتيريا الزراعية أثناء تبادل لاطلاق النار، ولكن بدلا من ذلك يمكن أن تكون في الموقع حتى نشرها في المختبر لإنتاج العبور ضخمة.
ويوفر تحول البطاطا أداة جيدة للتحقق من وظيفة الجينات وتنشيط المروج، وكذلك لإنتاج قواعد منهجية في نوع من الاهتمام الزراعي العالي. وينبغي التخلص من الكائن المحور وراثياً بأمان بعد استخدامه لتجنب التلوث البيئي. أيضا، يحتوي محلول الغاز على مشتق السيانيد السام، لذلك ارتداء الحماية والتخلص من الحل بأمان.
