توجد أيضا العديد من القنوات الأيونية ومستقبلات الناقلات العصبية الموجودة في أطراف الخلايا العصبية الواردة السمعية والدهليزية في أجسامها الخلوية. يمكن دراسة مزارع أجسام الخلايا المعزولة في المختبر لفهم كيفية تأثير هذه القنوات والمستقبلات الأيونية على استجابات الخلايا العصبية. يسمح التشكل المضغوط لأجسام الخلايا بتسجيلات كهربائية عالية الجودة لتوصيف الخصائص المعتمدة على الجهد للقنوات الأيونية ومستقبلات الناقل العصبي.
علاوة على ذلك ، فإن سهولة الوصول إلى مجموعة واسعة من أنواع الخلايا تسمح بإنتاجية عالية من خلال التحليل المادي لتنوع الخلايا. سيتم عرض الإجراءات من قبل طالبة الدراسات العليا كاثرين ريجالادو ، جنبا إلى جنب مع زملاء ما بعد الدكتوراه ، الدكتور دانيال برونسون وناثانيال نوفاك من مختبري. للبدء ، أمسك ماصة مرعى زجاجية بلهب موقد بنسن لتحضير ماصات التثليث لتفكك الخلية.
بمجرد أن يبدأ الطرف الزجاجي في الذوبان ، قم بتمديد الزجاج للخارج إلى قطر الطرف المطلوب. اسحب أحد طرفي الماصة بعيدا عن اللهب لإنشاء انحناء صغير. ضع الماصة المنحنية تحت المجهر.
باستخدام بلاط التهديف ، سجل وكسر الزجاج بالقطر المطلوب. مرر طرف الماصة فوق الجزء العلوي من لهب الموقد. سيؤدي ذلك إلى تلميع الحواف الخشنة بالقرب من الحافة بسرعة.
استخرج دماغ الفأر الرحيم باستخدام مقص جراحي مغلق. قطع وإزالة العصب القحفي لفصل الدماغ تماما عن الجمجمة. بدءا من الجزء الخلفي من الرأس ، اسحب المادة الغشائية الشفافة بالملقط ، ثم اقطع الجزء العلوي من الجمجمة باستخدام مقص جراحي.
قم بإزالة الأنسجة الزائدة من الجزء الخلفي من الرأس والرقبة لجعل منطقة التشريح والكبسولة الأذنية أنظف ويسهل الوصول إليها. نقل الأنسجة إلى طبق بتري الثاني مع محلول L-15 الطازج. ثم حدد موقع الكبسولة الأذنية والأعصاب الدهليزية السمعية والعلوية والدهليزية والسفلية.
افصل العقد العلوية والسفلية باستخدام مقص زنبركي صغير وقطع العصب السمعي. باستخدام مشرط ، احلق بلطف من الحافة العظمية لإضعاف المنطقة العظمية التي يغوص العصب تحتها في الكبسولة العظمية. قم بإزالة الحطام بعناية باستخدام مشرط ، وفضح الجزء المتورم بالكامل من العقدة.
استخدم مقص الزنبرك الناعم لقطع العقدة وفصلها عن فرع العصب المحيطي الذي يغوص نحو الرحم. قم بإزالة العقدة العلوية باستخدام ملقط ناعم وانقلها إلى طبق بتري 35 ملم بمحلول L-15 طازج. بعد التسخين المسبق لمحلول الإنزيم ، صب خليط الإنزيم في طبق بتري 35 ملم وضعه في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 10 إلى 15 دقيقة.
نظف العقدة باستخدام ملقط ناعم ومقص زنبركي صغير عن طريق إزالة العظام والأنسجة الزائدة والألياف العصبية وأي هياكل أخرى غير ضرورية. احرص على تقليل إزالة أي نسيج عقدي. انقل العقد التي تم تنظيفها إلى محلول الإنزيم المسخن مسبقا وضعها مرة أخرى في الحاضنة لمدة 10 إلى 40 دقيقة.
ثم نقل العقد إلى طبق بتري 35 ملم مع محلول L-15 الطازج. بعد دقيقتين إلى ثلاث دقائق ، انقل العقد إلى طبق بتري آخر 35 ملم مملوء بوسائط الثقافة المفلترة. انقل ما يقرب من 150 ميكرولترا من وسائط الاستزراع المفلترة إلى طبق زجاجي مطلي.
ثم قم بنقل العدد المطلوب من العقد إلى قسيمة الغطاء. ارسم كمية صغيرة من وسائط الاستزراع من طبق الاستزراع واشطف ماصة التثليث بوسط لمنع الأنسجة من الالتصاق بجوانب الماصة الزجاجية. سحن عن طريق تمرير الأنسجة بلطف وبشكل متكرر من خلال ماصة حتى يتم فصل العقد بما فيه الكفاية.
بعد خمس دقائق ، تحقق تحت المجهر الضوئي لمعرفة ما إذا كانت الخلايا قد استقرت على قسيمة الغطاء. ضع طبق الثقافة بعناية في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 12 إلى 24 ساعة. بعد ذلك ، حدد موقع الكبسولة الأذنية بعد تقسيم الرأس واستخراجها من الجمجمة عن طريق تقطيع الحواف باستخدام الملقط.
يضم الجزء الحلزوني من الكبسولة الأذنية القوقعة مع عضو كورتي. قم بتقطيع العظم بعيدا ، وتغطي المنعطفات القوقعة بملقط رفيع مواز لمنحنى العظم. استخدم مقصا زنبركيا صغيرا لقطع الموديولوس في قاعدة القوقعة لتحريره من بقية الكبسولة الأذنية.
قطع عضو كورتي إلى دورتين أو ثلاث دورات باستخدام مقص زنبركي صغير بحيث يكون مسطحا ، واستأصل الموديولوس من كل منعطف. إزالة الأوعية الدموية السطور عن طريق الضغط على السطور في القاعدة مع ملقط غرامة. استرخ حول اللولب وحتى القمة لتقشيره من عضو كورتي.
أزل العقدة الحلزونية عن طريق القطع عند حافة المكان الذي تبرز فيه المسالك العصبية العقدية الحلزونية نحو خلايا الشعر، ثم نظف العقدة كما هو موضح سابقا. بعد المعالجة الأنزيمية للعقدة الحلزونية ، قم بمعايرة العقدة الحلزونية في وسط الاستزراع المكمل ب N2 و B27. ضع طبق الاستزراع الذي يحتوي على العقد المنفصلة في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة 12 إلى 24 ساعة.
اغمس طرف الماصة في المحلول النظيف لطبق الاستزراع لملئه بمحلول نظيف لا يحتوي على الأمفوتريسين. املأ الجزء الخلفي من الماصة بالمحلول الداخلي الذي يحتوي على الأمفوتريسين. اغمس طرف الماصة مرة أخرى في المحلول النظيف لطبق الاستزراع بينما يدخل الأمفوتريسين ببطء إلى الطرف من الجزء الخلفي من الماصة.
بعد ذلك ، قم بإنهاء ملء الماصة بمحلول الأمفوتريسين حتى ثلثي الماصة. اخفض الماصة في حمام غرفة التسجيل وحدد موقع طرف الماصة في منتصف مجال الرؤية. تأكد من خلو الطرف من فقاعات الهواء أو غيرها من الحطام.
ضع الماصة بالقرب من الغشاء واهبط بإحكام على وسط الخلية. تطبيق الضغط السلبي أو الشفط باستخدام حقنة أو ماصة الفم. قم بتشغيل إمكانات الاحتفاظ البالغة سالب 60 مللي فولت.
يجب أن تزداد مقاومة الختم حتى تمر جيجا أوم. بمجرد أن يتشكل ختم جيجا أوم ، حرر الضغط السلبي. قبل أن يبدأ التيروزين في العمل ، تنخفض مقاومة الإدخال ببطء ، ويزداد التيار المتدفق استجابة لخطوة الجهد خمسة مللي فولت تدريجيا مع دخول الأمفوتريسين إلى الغشاء.
يوضح هذا الشكل الأمثلة التمثيلية لتيارات الخلايا الكاملة المستثارة من خلية عصبية عقدية دهليزية. يتم تحديد تيارات الصوديوم الداخلية الصافية هنا من خلال تنشيطها العابر وتعطيلها. تحمل أيونات البوتاسيوم التيارات الخارجية الصافية إلى حد كبير، ولها حركية تنشيط وتعطيل أبطأ بكثير من تيارات الصوديوم.
يتم تنشيط التيارات ذات البوابات النوكليوتيدات الحلقية المنشطة فرط الاستقطاب ، أو تيارات HCN ، بواسطة عائلة من الفولتية شديدة الاستقطاب طويلة الأمد. يظهر في هذا الشكل استقرار توصيف القناة الأيونية في الرقعة المثقبة في نقاط زمنية مختلفة أثناء التسجيل. تم قياس منحنيات التنشيط المعتمدة على الجهد لتيارات HCN في تكوين رقعة مثقبة.
المنحنى له شكل سيني وكان مستقرا طوال التسجيل الطويل. يتضح عدم الاستقرار النسبي لوضع التصحيح الممزق من خلال منحنيات سينية غير متداخلة من نقاط زمنية مختلفة. يتم عرض منحنيات تنشيط تيارات HCN أثناء تكوين التصحيح الممزق هنا.
أنماط الحرق في خمس خلايا عصبية عقدية دهليزية، وخمس خلايا عصبية عقدية حلزونية، وخطوات التيار المناظرة موضحة هنا. يعكس عدم التجانس في أنماط إطلاق النار تنوعا أساسيا في تكوين قنوات الصوديوم والبوتاسيوم الأساسية في كل من الخلايا العصبية العقدية الدهليزية والخلايا العصبية العقدية الحلزونية. لزيادة بقاء الخلايا أثناء هذا الإجراء ، تجنب تكوين فقاعات هواء ، ولا تفرط في إرهاق الأنسجة ، والسماح للخلايا بالاستقرار قبل وضع العينات في الحاضنة.
يتيح مشبك التصحيح المثقوب دراسة القنوات الأيونية التي يتم تعديلها بواسطة الرسل الثاني الخلوي ، وهو أمر بالغ الأهمية للتحقيق في آثار الناقلات العصبية الصادرة على الخلايا العصبية العقدية. كانت تسجيلات المشبك الرقعة لهذه الخلايا العصبية ثنائية القطب مفيدة في الكشف عن كيفية مساهمة التنوع الفيزيائي الحيوي في التنوع الوظيفي في الخلايا العصبية الحسية.
