Muitos canais iônicos e receptores de neurotransmissores que são encontrados nos terminais dos neurônios aferentes auditivos e vestibulares também são encontrados em seus corpos celulares. Culturas de corpos celulares isolados podem ser estudadas in vitro para entender como esses canais iônicos e receptores influenciam as respostas dos neurônios. A morfologia compacta dos corpos celulares permite registros elétricos de alta qualidade para caracterizar as propriedades voltagem-dependentes dos canais iônicos e receptores de neurotransmissores.
Além disso, o fácil acesso a uma ampla variedade de tipos celulares permite um alto rendimento por meio de uma análise física da diversidade celular. Os procedimentos serão demonstrados pela aluna de pós-graduação Katherine Regalado, juntamente com os bolsistas de pós-doutorado, Dr.Daniel Bronson e Nathaniel Nowak do meu laboratório. Para começar, segure uma pipeta de pastagem de vidro à chama de um queimador de Bunsen para preparar pipetas de tritração para dissociação celular.
Quando a ponta de vidro começar a derreter, estique o vidro até o diâmetro desejado da ponta. Puxe uma extremidade da pipeta para longe da chama para criar uma pequena curva. Coloque a pipeta dobrada sob um microscópio.
Usando uma telha de pontuação, marque e quebre o vidro no diâmetro desejado. Passe a ponta da pipeta por cima da chama do queimador. Isso irá polir rapidamente as bordas ásperas perto da ponta.
Retirar o cérebro do rato eutanasiado usando uma tesoura cirúrgica fechada. Sever e remover o nervo craniano para separar completamente o cérebro do crânio. Começando na parte de trás da cabeça, puxe o material membranoso claro com pinça e, em seguida, corte a parte superior do crânio usando tesoura cirúrgica.
Remova o excesso de tecido da parte de trás da cabeça e pescoço para tornar a área de dissecção e a cápsula ótica mais limpas e de fácil acesso. Transfira o tecido para uma segunda placa de Petri com solução fresca de L-15. Em seguida, localize a cápsula ótica e os nervos auditivo, superior, vestibular e vestibular inferior.
Separe os gânglios superior e inferior com uma pequena tesoura de mola e corte o nervo auditivo. Usando um bisturi, raspe suavemente a crista óssea para enfraquecer a área óssea sob a qual o nervo mergulha na cápsula óssea. Remova cuidadosamente os detritos com um bisturi, expondo toda a porção inchada do gânglio.
Use a tesoura fina de mola para cortar e separar o gânglio do ramo nervoso periférico que está mergulhando em direção ao utrículo. Remova o gânglio superior usando pinça fina e transfira-o para uma placa de Petri de 35 milímetros com solução fresca de L-15. Depois de pré-aquecer a solução enzimática, despeje a mistura enzimática em uma placa de Petri de 35 milímetros e coloque-a em uma incubadora de 37 graus Celsius por 10 a 15 minutos.
Limpe o gânglio usando pinças finas e pequenas tesouras de mola, removendo osso, excesso de tecido, fibras nervosas e quaisquer outras estruturas supérfluas. Tome cuidado para minimizar a remoção de qualquer tecido ganglionar. Transfira os gânglios limpos para a solução enzimática pré-aquecida e coloque-a de volta na incubadora por 10 a 40 minutos.
Em seguida, transfira os gânglios para a placa de Petri de 35 milímetros com solução fresca de L-15. Após dois a três minutos, transferir os gânglios para outra placa de Petri de 35 milímetros preenchida com meios de cultura filtrados. Transfira aproximadamente 150 microlitros de meios de cultura filtrados para uma placa de fundo de vidro revestido.
Em seguida, transfira o número desejado de gânglios para a folha de cobertura. Retire uma pequena quantidade de meios de cultura da placa de cultura e lave a pipeta de tritração com meio para evitar que o tecido grude nas laterais da pipeta de vidro. Triturar passando suave e repetidamente o tecido através da pipeta até que os gânglios estejam suficientemente dissociados.
Após cinco minutos, verifique sob um microscópio de luz se as células se acomodaram na tampa. Coloque cuidadosamente um prato de cultura em uma incubadora de 37 graus Celsius por 12 a 24 horas. Em seguida, localize a cápsula ótica após bissetriz da cabeça e extraia-a do crânio lascando as bordas usando pinças.
A porção espiral da cápsula ótica abriga a cóclea com o órgão de Corti. Lascar o osso, sobrepondo as espiras cocleares com pinças finas paralelas à curva do osso. Use uma pequena tesoura de mola para cortar o modíolo na base da cóclea para libertá-lo do resto da cápsula ótica.
Corte o órgão de Corti em duas ou três voltas usando uma pequena tesoura de mola de modo que ele fique plano, e extire o modiolus de cada volta. Remova a estria vascular pinçando a estria na base com pinças finas. Relaxe ao redor da espiral e até o ápice para descascá-la livre do órgão de Corti.
Remova o gânglio espiral cortando na borda de onde os tratos de fibras do gânglio espiral se projetam em direção às células ciliadas e, em seguida, limpe o gânglio como mostrado anteriormente. Após tratamento enzimaticamente do gânglio espiral, tritrato do gânglio espiral em meio de cultura suplementado com N2 e B27. Coloque a placa de cultura contendo os gânglios dissociados em uma incubadora de dióxido de carbono de 37 graus Celsius, 5%, por 12 a 24 horas.
Mergulhe a ponta da pipeta na solução limpa do prato de cultura para preenchê-lo com uma solução limpa que não contenha anfotericina. Encha o verso da pipeta com a solução interna contendo anfotericina. Mergulhe a ponta da pipeta de volta na solução limpa do prato de cultura enquanto a anfotericina entra lentamente na ponta pela parte de trás da pipeta.
Em seguida, termine de encher a pipeta com a solução de anfotericina de até dois terços da pipeta. Abaixe a pipeta para o banho da câmara de gravação e localize a ponta da pipeta no meio do campo de visão. Certifique-se de que a ponta está livre de bolhas de ar ou outros detritos.
Posicione a pipeta perto da membrana e pouse firmemente no centro da célula. Aplicar pressão negativa ou sucção usando uma seringa ou pipeta bucal. Ligue o potencial de retenção de menos 60 milivolts.
A resistência da vedação deve aumentar até passar de um giga ohm. Uma vez que uma vedação de giga ohm se forma, libere a pressão negativa. Antes que a tirosina comece a funcionar, a resistência de entrada diminui lentamente, e a corrente que flui em resposta ao passo de tensão de cinco milivolts, aumenta progressivamente à medida que a anfotericina entra na membrana.
Os exemplos representativos de correntes celulares inteiras evocadas a partir de um neurônio ganglionar vestibular são mostrados nesta figura. As correntes líquidas de sódio para dentro são identificadas aqui por sua ativação e inativação transitórias. As correntes líquidas de saída são transportadas em grande parte por íons potássio e têm uma cinética de ativação e inativação muito mais lenta do que as correntes de sódio.
As correntes dependentes de nucleotídeos cíclicos ativados por hiperpolarização, ou correntes HCN, são ativadas por uma família de tensões hiperpolarizantes de longa duração. A estabilidade da caracterização do canal iônico no remendo perfurado em diferentes momentos durante o registro é mostrada nesta figura. As curvas de ativação dependentes de voltagem das correntes HCN foram medidas em uma configuração de remendo perfurado.
A curva tem uma forma sigmoidal e foi estável ao longo de uma longa gravação. A instabilidade relativa do modo de remendo roto é ilustrada por curvas sigmoidais não sobrepostas de diferentes pontos de tempo. As curvas de ativação das correntes HCN durante uma configuração de patch rompido são mostradas aqui.
Os padrões de disparo em cinco gânglios vestibulares somara, cinco neurônios espirais ganglionares e os passos atuais correspondentes são mostrados aqui. Essa heterogeneidade nos padrões de disparo reflete uma diversidade fundamental na composição dos canais subjacentes de sódio e potássio tanto nos neurônios ganglionares vestibulares quanto nos neurônios do gânglio espiral. Para maximizar a sobrevivência celular durante este procedimento, evite a formação de bolhas de ar, não sobrecarregue o tecido e permita que as células se estabeleçam antes de colocar amostras na incubadora.
O patch clamp perfurado possibilita o estudo de canais iônicos modulados por segundos mensageiros citosólicos, o que é fundamental para investigar os efeitos de neurotransmissores eferentes nos neurônios ganglionares. Gravações de patch clamp desses neurônios bipolares têm sido fundamentais para revelar como a diversidade biofísica contribui para a diversidade funcional em neurônios sensoriais.
