İşitsel ve vestibüler afferent nöronların terminallerinde bulunan birçok iyon kanalı ve nörotransmitter reseptörü de hücre gövdelerinde bulunur. İzole edilmiş hücre gövdelerinin kültürleri, bu iyon kanallarının ve reseptörlerin nöronların tepkilerini nasıl etkilediğini anlamak için in vitro olarak incelenebilir. Hücre gövdelerinin kompakt morfolojisi, iyon kanallarının ve nörotransmitter reseptörlerinin voltaja bağlı özelliklerini karakterize etmek için yüksek kaliteli elektriksel kayıtlara izin verir.
Ayrıca, çok çeşitli hücre tiplerine kolay erişim, hücre çeşitliliğinin fiziksel analizi ile yüksek verim sağlar. Prosedürler, yüksek lisans öğrencisi Katherine Regalado ve doktora sonrası araştırmacılar Dr.Daniel Bronson ve laboratuvarımdan Nathaniel Nowak tarafından gösterilecek. Başlamak için, hücre ayrışması için tritrasyon pipetleri hazırlamak üzere bir Bunsen brülörünün alevine bir cam mera pipeti tutun.
Cam uç erimeye başladığında, camı istediğiniz uç çapına kadar uzatın. Küçük bir kıvrım oluşturmak için pipetin bir ucunu alevden çekin. Bükülmüş pipeti mikroskop altına yerleştirin.
Bir puanlama karosu kullanarak, camı istenen çapta çizin ve kırın. Pipet ucunu brülör alevinin üstünden geçirin. Bu, ucun yakınındaki pürüzlü kenarları hızla parlatacaktır.
Kapalı cerrahi makas kullanarak ötenazi yapılan farenin beynini çıkarın. Beyni kafatasından tamamen ayırmak için kraniyal siniri kesin ve çıkarın. Başın arkasından başlayarak, şeffaf membranöz materyali forseps ile çekin ve ardından cerrahi makas kullanarak kafatasının üst kısmını kesin.
Diseksiyon alanını ve otik kapsülü daha temiz ve erişimi daha kolay hale getirmek için başın ve boynun arkasındaki fazla dokuyu çıkarın. Dokuyu taze L-15 çözeltisi ile ikinci bir Petri kabına aktarın. Ardından otik kapsülü ve işitsel, üstün, vestibüler ve alt vestibüler sinirleri bulun.
Küçük yaylı makas kullanarak üst ve alt gangliyonları ayırın ve işitme sinirini kesin. Bir neşter kullanarak, sinirin kemikli kapsüle daldığı kemikli bölgeyi zayıflatmak için kemikli sırtı nazikçe tıraş edin. Ganglionun tüm şişmiş kısmını açığa çıkaran bir neşter ile kalıntıları dikkatlice çıkarın.
Gangliyonu utriküle doğru dalan periferik sinir dalından kesmek ve ayırmak için ince yaylı makası kullanın. İnce forseps kullanarak üstün ganglionu çıkarın ve taze L-15 çözeltisi ile 35 milimetrelik bir Petri kabına aktarın. Enzim çözeltisini önceden ısıttıktan sonra, enzim karışımını 35 milimetrelik bir Petri kabına dökün ve 10 ila 15 dakika boyunca 37 santigrat derecelik bir inkübatöre koyun.
Kemik, fazla doku, sinir lifleri ve diğer gereksiz yapıları çıkararak ganglionu ince forseps ve küçük yaylı makas kullanarak temizleyin. Herhangi bir ganglionik dokunun çıkarılmasını en aza indirmeye özen gösterin. Temizlenmiş gangliyonları önceden ısıtılmış enzim çözeltisine aktarın ve 10 ila 40 dakika boyunca inkübatöre geri koyun.
Daha sonra gangliyonları taze L-15 çözeltisi ile 35 milimetrelik Petri kabına aktarın. İki ila üç dakika sonra, gangliyonları filtrelenmiş kültür ortamıyla dolu başka bir 35 milimetrelik Petri kabına aktarın. Yaklaşık 150 mikrolitre filtrelenmiş kültür ortamını kaplanmış bir cam tabanlı kaba aktarın.
Ardından, istenen sayıda ganglionu kapak fişine aktarın. Kültür kabından az miktarda kültür ortamı çekin ve dokunun cam pipetin kenarlarına yapışmasını önlemek için tritrasyon pipetini orta derecede durulayın. Ganglionlar yeterince ayrışana kadar dokuyu pipetten nazikçe ve tekrar tekrar geçirerek eziyet edin.
Beş dakika sonra, hücrelerin kapak kaymasına yerleşip yerleşmediğini görmek için ışık mikroskobu altında kontrol edin. Bir kültür kabını 12 ila 24 saat boyunca 37 santigrat derecelik bir inkübatöre dikkatlice yerleştirin. Ardından, kafayı ikiye böldükten sonra otik kapsülü bulun ve forseps kullanarak kenarlarından yontarak kafatasından çıkarın.
Otik kapsülün spiral kısmı, Corti organı ile kokleayı barındırır. Kemiğin kıvrımına paralel ince forseps ile koklear dönüşlerin üzerine çıkarak kemiği parçalayın. Otik kapsülün geri kalanından kurtarmak için kokleanın tabanındaki modiolusu kesmek için küçük yaylı makas kullanın.
Corti'nin organını düz duracak şekilde küçük yaylı makas kullanarak iki veya üç turda kesin ve her dönüşte modiolusu çıkarın. Stria'yı tabanda ince forseps ile sıkıştırarak stria vaskularis'i çıkarın. Corti organından arındırmak için spiralin etrafında ve tepeye kadar gevşeyin.
Spiral ganglion nöron lif yollarının saç hücrelerine doğru çıkıntı yaptığı yerin kenarını keserek spiral ganglionu çıkarın ve ardından gangliyonu daha önce gösterildiği gibi temizleyin. Spiral ganglionu enzimatik olarak tedavi ettikten sonra, spiral ganglionu N2 ve B27 ile takviye edilmiş kültür ortamında tritratlayın. Ayrışmış gangliyonları içeren kültür kabını 12 ila 24 saat boyunca 37 santigrat derece,% 5 karbondioksit inkübatörüne yerleştirin.
Pipetin ucunu, amfoterisin içermeyen temiz bir çözelti ile doldurmak için kültür kabının temiz çözeltisine batırın. Pipetin arkasını amfoterisin içeren dahili solüsyonla doldurun. Amfoterisin pipetin arkasından uca yavaşça girerken, pipetin ucunu tekrar kültür kabının temiz çözeltisine batırın.
Ardından, pipeti, pipetin üçte ikisine kadar amfoterisin çözeltisiyle doldurmayı bitirin. Pipeti kayıt odasının banyosuna indirin ve pipet ucunu görüş alanının ortasına yerleştirin. Ucun hava kabarcıkları veya diğer kalıntılar içermediğinden emin olun.
Pipeti membrana yakın bir yere yerleştirin ve hücrenin ortasına sıkıca inin. Bir şırınga veya ağız pipeti kullanarak negatif basınç uygulayın veya emme yapın. Eksi 60 milivoltluk tutma potansiyelini açın.
Sızdırmazlık direnci, bir giga ohm'u geçene kadar artmalıdır. Bir giga ohm conta oluştuğunda, negatif basıncı serbest bırakın. Tirozin çalışmaya başlamadan önce, giriş direnci yavaşça azalır ve beş milivolt voltaj adımına yanıt olarak akan akım, amfoterisin zara girdikçe kademeli olarak artar.
Bir vestibüler ganglion nöronundan uyarılan tüm hücre akımlarının temsili örnekleri bu şekilde gösterilmektedir. Net içe doğru sodyum akımları burada geçici aktivasyonları ve inaktivasyonları ile tanımlanır. Net dış akımlar büyük ölçüde potasyum iyonları tarafından taşınır ve sodyum akımlarından çok daha yavaş aktivasyon ve inaktivasyon kinetiğine sahiptir.
Hiperpolarizasyonla aktive olan siklik nükleotid kapılı akımlar veya HCN akımları, uzun süreli hiperpolarize voltaj ailesi tarafından aktive edilir. Kayıt sırasında farklı zaman noktalarında delikli yamadaki iyon kanalı karakterizasyonunun kararlılığı bu şekilde gösterilmiştir. HCN akımlarının gerilime bağlı aktivasyon eğrileri delikli bir yama konfigürasyonunda ölçüldü.
Eğri sigmoidal bir şekle sahiptir ve uzun bir kayıt boyunca sabittir. Yırtılmış yama modunun göreceli kararsızlığı, farklı zaman noktalarından örtüşmeyen sigmoidal eğrilerle gösterilir. Yırtılmış bir yama konfigürasyonu sırasında HCN akımlarının aktivasyon eğrileri burada gösterilmektedir.
Beş vestibüler ganglion somara, beş spiral ganglion nöronundaki ateşleme paternleri ve karşılık gelen akım adımları burada gösterilmektedir. Ateşleme modellerindeki bu heterojenlik, hem vestibüler ganglion nöronlarında hem de spiral ganglion nöronlarında altta yatan sodyum ve potasyum kanallarının bileşimindeki temel bir çeşitliliği yansıtır. Bu prosedür sırasında hücre sağkalımını en üst düzeye çıkarmak için hava kabarcıkları oluşturmaktan kaçının, dokuyu fazla çalıştırmayın ve numuneleri inkübatöre yerleştirmeden önce hücrelerin yerleşmesine izin verin.
Delikli yama kelepçesi, efferent nörotransmiterlerin ganglion nöronları üzerindeki etkilerini araştırmak için kritik olan sitozolik ikinci haberciler tarafından modüle edilen iyon kanallarının incelenmesini sağlar. Bu bipolar nöronların yama kelepçe kayıtları, biyofiziksel çeşitliliğin duyusal nöronlardaki fonksiyonel çeşitliliğe nasıl katkıda bulunduğunu ortaya çıkarmada etkili olmuştur.
