تعتبر الرئيسيات IPSCs مفيدة ولكن غالبا ما يصعب الحصول عليها بسبب القضايا الأخلاقية والتقنية. يوفر هذا البروتوكول مسارا يسهل الوصول إليه لتوليد وصيانة IPSCs الرئيسيات. استخدام الخلايا البولية كمصدر أساسي ل IPSCs له ميزة كبيرة حيث يمكن الحصول عليها بطريقة غير جراحية تماما دون أي تقنيات خاصة.
وستقوم جيسيكا رادمر ، طالبة دكتوراه من مختبر فولفغانغ إم إس ، بتوضيح الإجراء. للبدء ، الطرد المركزي أنبوب يحتوي على البول في 400G لمدة 10 دقائق. ثم استنشق بعناية طاف ، وترك ما يقرب من ملليلتر واحد في الأنبوب وإعادة تعليق بيليه فيه.
اغسل الخلايا بإضافة 10 ملليلتر من محلول غسيل البول الذي يحتوي على الأمفوتريسين واخلط المعلق بعناية باستخدام ماصة مصلية. بعد الطرد المركزي ، استنشق بعناية طاف ، وترك ما يقرب من أقل من 0.2 ملليلتر في الأنبوب. أعد تعليق حبيبات الخلية في ملليلتر واحد من وسط البول الأساسي الذي يحتوي على الأمفوتريسين لكل 50 ملليلتر من البول المعالج في البداية.
قم بإزالة الجيلاتين وأضف ملليلتر واحد من المعلق إلى بئر من الجيلاتين المطلي ب 12 صفيحة بئر. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. لتحضير مصفوفة غشاء قاعدي مطلية ب 12 صفيحة بئر ، أضف 500 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء القاعدي لكل بئر.
حرك اللوحة لتوزيع السائل واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. بعد الحضانة ، استبدل مصفوفة الغشاء القاعدي ب 900 ميكرولتر من وسط REMC وقم بتخزينها عند 37 درجة مئوية حتى الاستخدام. احسب حجم فيروسات سنداي اللازمة لتعدد العدوى بخمسة باستخدام المعادلة.
قم بإذابة مكونات مجموعة إعادة برمجة Sendai بسرعة في حمام مائي مقسى عند 37 درجة مئوية. أضف وسط REMC لما مجموعه 100 ميكرولتر إلى أنبوب قبل إضافة الحجم المحسوب لفيروسات سينداي والخلط. بعد تفكك الخلايا البولية كما هو موضح في المخطوطة ، عد الخلايا باستخدام عداد الخلايا وانقل العدد المطلوب من الخلايا إلى أنبوب 1.5 ملليلتر.
الحصول على بيليه عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليقها في 100 ميكرولتر من خليط فيروس سينداي المعدة. احتضان الأنبوب لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية لعدوى التعليق. بعد الحضانة ، أضف REMC إلى ما مجموعه ملليلتر واحد قبل بذر تعليق الخلية في مصفوفة الغشاء القاعدي المغلفة ب 12 صفيحة بئر.
بعد التحويل ، قم بتغيير الوسط كل يومين حتى يتم تطوير مستعمرات الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات ، أو IPSC ، مع التحول إلى وسيط توليد PSC في اليوم الخامس. عندما تنمو مستعمرات IPSC كبيرة بما يكفي لتمرير التكتل ، قم باستنشاق الوسط من الخلايا المستزرعة واغسل الخلايا بعناية باستخدام 500 ميكرولتر من DPBS. بعد إزالة DPBS ، أضف 500 ميكرولتر من 0.5 مليمول EDTA إلى البئر واحتضانها لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق.
راقب بعناية الخلايا الموجودة تحت المجهر حتى تبدأ المستعمرات في الانفصال. عندما تبدأ حواف المستعمرات في التقشر وتصبح الفجوات بين الخلايا مرئية ، قم بإزالة EDTA وأضف بعناية 500 ميكرولتر من DPBS. قم بنضح DPBS واغسل البئر ب 500 ميكرولتر من وسيط زراعة PSC باستخدام ماصة P-1000.
ماصة صعودا وهبوطا لتفريق المستعمرات إلى كتل من الحجم المناسب. اعتمادا على الالتقاء ، والكثافة المطلوبة للخلايا المصنفة والتفضيل النسيلي IPSC ، قم بنقل 1/10 إلى 1/50 من تعليق كتلة الخلية إلى الآبار الجديدة. حرك اللوحة برفق ذهابا وإيابا عدة مرات لتوزيع الكتل بالتساوي في البئر.
احتضن اللوحة لمدة 30 دقيقة على الأقل عند 37 درجة مئوية للسماح للكتل بالالتصاق. قم بتغيير الوسط كل يومين إلى ثلاثة أيام حتى تنمو المستعمرات بشكل كبير بما يكفي للمرور. بعد العزلة ، يمكن رؤية الخلايا الحرشفية والعديد من الخلايا المستديرة الأصغر التي تفرز مع البول.
يمكن رؤية الخلايا المتكاثرة الأولى الملتصقة ، وتنمو هذه الخلايا لتصبح مستعمرات كبيرة يمكن مرورها. يمكن ملاحظة نوعين مختلفين من الخلايا، أحدهما له نمط ظاهري شبيه بالطلائية، والآخر يظهر نمطا ظاهريا أكثر شبها باللحمة المتوسطة وله شكل ممدود. بعد المقطع الأول ، تنمو الخلايا البولية كطبقة أحادية.
خلال جيل IPSC ، يمكن رؤية بعض الخلايا الملتصقة وتبدأ هذه الخلايا في إظهار التغيرات المورفولوجية ، مما يشير إلى إعادة برمجة الخلايا. علاوة على ذلك ، تعرض الخلايا التي تشكل مستعمرات مورفولوجيا الخلايا الجذعية الجنينية النموذجية. تشترك جميع IPSCs التي تم إنشاؤها في مورفولوجيا مستعمرة شبيهة بالخلايا الجذعية الجنينية النموذجية ، والتي تتميز بخلايا معبأة بإحكام ذات حواف محددة بوضوح.
تم استخدام الكيمياء المناعية لاختبار التعبير عن العلامات المرتبطة بتعدد القدرات في IPSCs الغوريلا. علاوة على ذلك ، أظهر تحليل قياس التدفق الخلوي أن IPSCs إنسان الغاب التي تم تحليلها إيجابية ل TRA-1-60. علاوة على ذلك ، فإن IPSCs الغوريلا قادرة على التمايز إلى سلالات الأديم الباطن والأديم المتوسط والأديم الظاهر.
تشير زيادة عدد الخلايا المتمايزة وفقدان سلامة الحدود وتوحيدها إلى ضعف جودة IPSC. في المقابل ، تشير الحدود المحددة والتعبئة الخلوية الضيقة والنواة البارزة إلى IPSCs عالية الجودة. نظرا للتغير الإكليلي ، يحتاج المرء إلى تحسين الظروف المحددة للاستنساخ مثل نسبة الانقسام وتوقيت المرور وحجم التكتل للحفاظ على نمو IPSCs الرئيسيات بصحة جيدة.
كضوابط جودة ل IPSCs المعمول بها ، يمكن للمرء التحقق من الفاعلية المسبقة عن طريق تحريض التمايز المباشر أو غير المباشر مثل تمايز EV في المختبر ، إلى جانب التحقق من التعبير الجيني للعلامة.
