Os IPSCs de primatas são úteis, mas muitas vezes difíceis de obter devido a questões éticas e técnicas. Este protocolo fornece um caminho mais acessível para a geração e manutenção de IPSCs de primatas. O uso de células urinárias como fonte primária de IPSCs tem uma grande vantagem, pois podem ser obtidas de forma completamente não invasiva, sem técnicas especiais.
Quem demonstrará o procedimento será Jessica Radmer, estudante de doutorado do Wolfgang M.S.Laboratory. Para começar, centrifugar o tubo contendo urina a 400G por 10 minutos. Em seguida, aspirar cuidadosamente o sobrenadante, deixando aproximadamente um mililitro no tubo e ressuspender o pellet nele.
Lave as células adicionando 10 mililitros de tampão de lavagem de urina contendo anfotericina e misture cuidadosamente a suspensão usando uma pipeta sorológica. Após a centrifugação, aspirar cuidadosamente o sobrenadante, deixando aproximadamente menos de 0,2 mililitros no tubo. Ressuspender o pellet celular em um mililitro de meio urinário primário contendo anfotericina por 50 mililitros de urina inicialmente processada.
Retire a gelatina e adicione um mililitro da suspensão em um poço de placa de 12 poços revestida com gelatina. Incubar a placa a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Para preparar uma matriz de membrana basal revestida com placa de 12 poços, adicione 500 microlitros de matriz de membrana basal por poço.
Mova a placa para distribuir o líquido e incube-o a 37 graus Celsius por uma hora. Após a incubação, substituir a matriz da membrana basal por 900 microlitros de meio REMC e armazená-la a 37 graus Celsius até o uso. Calcule o volume de vírus de Sendai necessário para uma multiplicidade de infecção de cinco usando a equação.
Descongele rapidamente os componentes do kit de reprogramação de Sendai no banho-maria temperado a 37 graus Celsius. Adicione o meio REMC para um total de 100 microlitros a um tubo antes de adicionar o volume calculado de vírus de Sendai e misturar. Após a dissociação das células urinárias, conforme descrito no manuscrito, conte as células usando o contador de células e transfira o número desejado de células para um tubo de 1,5 mililitro.
Obter o pellet por centrifugação e ressuspendê-lo em 100 microlitros da mistura preparada do vírus Sendai. Incubar o tubo por uma hora a 37 graus Celsius para infecção da suspensão. Após a incubação, adicionar REMC a um total de um mililitro antes de semear a suspensão celular na matriz de membrana basal revestida com placa de 12 poços.
Após a transdução, trocar o meio a cada dois dias até o desenvolvimento de células-tronco pluripotentes induzidas, ou IPSC, colônias com mudança para meio de geração de PSC no quinto dia. Quando as colônias IPSC crescerem o suficiente para a passagem de aglomerados, aspirar o meio das células cultivadas e lavar cuidadosamente as células com 500 microlitros de DPBS. Após a remoção do DPBS, adicione 500 microlitros de EDTA 0,5 milimolar ao poço e incube por dois a cinco minutos.
Observe cuidadosamente as células ao microscópio até que as colônias comecem a se desprender. Quando as bordas das colônias começarem a descascar e as lacunas entre as células se tornarem visíveis, remova o EDTA e adicione cuidadosamente 500 microlitros de DPBS. Aspirar o DPBS e lavar o poço com 500 microlitros de meio de cultura PSC usando uma pipeta P-1000.
Pipetar para cima e para baixo para dispersar as colônias em aglomerados de tamanho apropriado. Dependendo da confluência, da densidade desejada das células semeadas e da preferência clonal do IPSC, transferem de 1/10 a 1/50 da suspensão do aglomerado celular para os novos poços. Mova suavemente a placa para frente e para trás várias vezes para distribuir as touceiras uniformemente no poço.
Incube a placa por pelo menos 30 minutos a 37 graus Celsius para deixar as touceiras se fixarem. Troque o meio a cada dois ou três dias até que as colônias cresçam o suficiente para a passagem. Após o isolamento, células escamosas e várias células redondas menores podem ser vistas que foram excretadas com a urina.
As primeiras células aderentes em proliferação podem ser vistas, e essas células crescem em grandes colônias que podem ser passadas. Dois tipos celulares distintos podem ser observados, um com fenótipo semelhante ao epitélio e outro apresentando fenótipo mais mesenquimal com forma alongada. Após a primeira passagem, as células urinárias crescem como uma monocamada.
Durante a geração do IPSC, algumas células aderentes podem ser vistas e essas células começam a apresentar alterações morfológicas, indicando reprogramação das células. Além disso, as células que formam colônias exibem a morfologia típica de células-tronco embrionárias. Todos os IPSCs gerados compartilham a morfologia típica de colônia semelhante a células-tronco embrionárias, caracterizada por células bem compactadas com bordas claramente definidas.
A imunocitoquímica foi utilizada para testar a expressão de marcadores associados à pluripotência em IPSCs de gorilas. Além disso, a análise por citometria de fluxo mostrou que os IPSCs de orangotango analisados são positivos para TRA-1-60. Além disso, os IPSCs de gorilas são capazes de se diferenciar em linhagens endoderme, mesoderma e ectoderma.
O aumento do número de células diferenciadas e a perda da integridade e uniformidade das bordas indicam baixa qualidade do IPSC. Em contraste, fronteiras definidas, embalagem celular apertada e nucléolos proeminentes significam IPSCs de alta qualidade. Devido à variabilidade coronal, é necessário otimizar as condições específicas do clone, como razão de divisão, tempo de passagem e tamanho do aglomerado para manter os IPSCs de primatas crescendo saudáveis.
Como controles de qualidade das IPSCs estabelecidas, pode-se verificar a pré-potência por indução de diferenciação direta ou indireta, como a diferenciação in vitro de EV, além de verificar a expressão gênica de marcadores.
