IPSCs für Primaten sind nützlich, aber aufgrund ethischer und technischer Probleme oft schwer zu beschaffen. Dieses Protokoll bietet einen möglichst zugänglichen Weg zur Generierung und Wartung von Primaten-IPSCs. Die Verwendung von Harnzellen als primäre Quelle für IPSCs hat einen großen Vorteil, da sie auf völlig nicht-invasive Weise ohne spezielle Techniken gewonnen werden können.
Das Verfahren wird von Jessica Radmer, Doktorandin am Wolfgang-M.S.Labor, demonstriert. Zentrifugieren Sie zunächst das Urinröhrchen bei 400 G für 10 Minuten. Saugen Sie dann den Überstand vorsichtig ab, lassen Sie etwa einen Milliliter im Röhrchen und resuspendieren Sie das Pellet darin.
Waschen Sie die Zellen, indem Sie 10 Milliliter Urinwaschpuffer hinzufügen, der Amphotericin enthält, und mischen Sie die Suspension vorsichtig mit einer serologischen Pipette. Nach dem Zentrifugieren wird der Überstand vorsichtig abgesaugt, wobei etwa weniger als 0,2 Milliliter im Röhrchen verbleiben. Resuspendieren Sie das Zellpellet in einem Milliliter primärem Urinmedium, das Amphotericin enthält, pro 50 Milliliter anfänglich verarbeiteten Urins.
Entfernen Sie die Gelatine und geben Sie einen Milliliter der Suspension in eine mit Gelatine beschichtete 12-Well-Platte. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. Um eine mit einer Basalmembranmatrix beschichtete 12-Well-Platte herzustellen, fügen Sie 500 Mikroliter Basalmembranmatrix pro Well hinzu.
Bewegen Sie die Platte, um die Flüssigkeit zu verteilen, und inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Ersetzen Sie nach der Inkubation die Basalmembranmatrix durch 900 Mikroliter REMC-Medium und lagern Sie sie bis zur Verwendung bei 37 Grad Celsius. Berechnen Sie das Volumen der Sendai-Viren, die für eine Vielzahl von Infektionen benötigt werden, indem Sie die Gleichung verwenden.
Tauen Sie die Komponenten des Sendai-Umprogrammierungskits schnell im 37 Grad Celsius temperierten Wasserbad auf. Geben Sie REMC-Medium für insgesamt 100 Mikroliter in ein Röhrchen, bevor Sie das berechnete Volumen an Sendai-Viren hinzufügen und mischen. Nach der Dissoziation der Harnzellen, wie im Manuskript beschrieben, werden die Zellen mit dem Zellzähler gezählt und die gewünschte Anzahl von Zellen in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen übertragen.
Das Pellet wird durch Zentrifugation gewonnen und in 100 Mikrolitern der vorbereiteten Sendai-Virusmischung resuspendiert. Inkubieren Sie das Röhrchen eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius für eine Suspensionsinfektion. Nach der Inkubation wird REMC zu insgesamt einem Milliliter hinzugefügt, bevor die Zellsuspension in die mit der Basalmembranmatrix beschichtete 12-Well-Platte eingesät wird.
Nach der Transduktion wird das Medium jeden zweiten Tag gewechselt, bis sich induzierte pluripotente Stammzellen (IPSC) entwickelt haben, wobei am fünften Tag auf PSC-Erzeugungsmedium umgestellt wird. Wenn die IPSC-Kolonien groß genug sind, um Klumpen zu verklumpen, saugen Sie das Medium aus den kultivierten Zellen ab und waschen Sie die Zellen vorsichtig mit 500 Mikrolitern DPBS. Nach dem Entfernen des DPBS werden 500 Mikroliter 0,5 Millimolar EDTA in die Vertiefung gegeben und zwei bis fünf Minuten inkubiert.
Beobachten Sie die Zellen sorgfältig unter dem Mikroskop, bis sich die Kolonien zu lösen beginnen. Wenn sich die Ränder der Kolonien abzulösen beginnen und Lücken zwischen den Zellen sichtbar werden, entfernen Sie das EDTA und fügen Sie vorsichtig 500 Mikroliter DPBS hinzu. Saugen Sie das DPBS ab und spülen Sie die Vertiefung mit 500 Mikrolitern PSC-Nährmedium mit einer P-1000-Pipette.
Pipettieren Sie auf und ab, um die Kolonien in Klumpen geeigneter Größe zu zerstreuen. Abhängig von der Konfluenz, der gewünschten Dichte der ausgesäten Zellen und der IPSC-Klonpräferenz werden 1/10 bis 1/50 der Zellklumpensuspension in die neuen Vertiefungen übertragen. Bewegen Sie die Platte mehrmals vorsichtig hin und her, um die Klumpen gleichmäßig in der Vertiefung zu verteilen.
Inkubieren Sie die Platte mindestens 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, damit sich die Klumpen festsetzen können. Wechseln Sie das Medium alle zwei bis drei Tage, bis die Kolonien groß genug sind, um durchzugehen. Nach der Isolierung sind Plattenepithelzellen und verschiedene kleinere runde Zellen zu sehen, die mit dem Urin ausgeschieden wurden.
Die ersten adhärenten proliferierenden Zellen sind zu sehen, und diese Zellen wachsen zu großen Kolonien heran, die durchquert werden können. Es sind zwei unterschiedliche Zelltypen zu sehen, einer mit einem epithelialen Phänotyp und der andere mit einem eher mesenchymalen Phänotyp mit länglicher Form. Nach der ersten Passage wachsen die Harnzellen als Monoschicht.
Während der IPSC-Generierung sind einige adhärente Zellen zu sehen, die beginnen, morphologische Veränderungen zu zeigen, was auf eine Reprogrammierung der Zellen hinweist. Darüber hinaus weisen die Zellen, die Kolonien bilden, die typische embryonale Stammzellmorphologie auf. Allen generierten IPSCs gemeinsam ist die typische embryonale stammzellähnliche Koloniemorphologie, die durch dicht gepackte Zellen mit klar definierten Rändern gekennzeichnet ist.
Immunzytochemie wurde verwendet, um die Expression von Pluripotenz-assoziierten Markern in Gorilla-IPSCs zu testen. Darüber hinaus zeigte die durchflusszytometrische Analyse, dass die analysierten Orang-Utan-IPSCs positiv für TRA-1-60 sind. Darüber hinaus sind die IPSCs der Gorillas in der Lage, sich in Endoderm-, Mesoderm- und Ektodermlinien zu differenzieren.
Eine erhöhte Anzahl differenzierter Zellen und ein Verlust der Grenzintegrität und Homogenität deuten auf eine schlechte IPSC-Qualität hin. Im Gegensatz dazu deuten definierte Grenzen, dichte zelluläre Verpackungen und prominente Nukleolen auf qualitativ hochwertige IPSCs hin. Aufgrund der koronalen Variabilität müssen die klonspezifischen Bedingungen wie das Spaltungsverhältnis, das Passagetiming und die Klumpengröße optimiert werden, um das Wachstum der Primaten-IPSCs gesund zu halten.
Als Qualitätskontrollen etablierter IPSCs kann neben der Überprüfung der Markergenexpression auch die Präpotenz durch direkte oder indirekte Differenzierungsinduktion wie z.B. in vitro EV-Differenzierung verifiziert werden.
