من خلال قياس الخصائص الفيزيولوجية الكهربية لأغشية الخلايا ، تثبت مسألة الرئيسي أنه يمكن حل تعديل النشاط الكهربائي للخلية. تسجيل مشبك التصحيح للخلية الكاملة هو تقنية محيطية لدراسة التيارات الأيونية في الخلايا الفردية واستجواب الاستجابة الخلوية للمحفزات المختلفة. سيتم تحقيق أفضل أداء في التسجيلات المسبقة لمشبك التصحيح كامل الخلية بعد ممارسة ودراسة الكثير.
لبدء تشريح الدماغ ، قم بعمل شق باستخدام مقص جراحي في الجلد في الجزء العلوي من جمجمة الحيوان مقطوع الرأس من المرجل إلى المنضدة وإزالة فروة الرأس. بعد ذلك ، قم بقطع الصفيحة الجدارية على طول الخيط السهمي بمقص القزحية وإزالة العظم القذالي. حرك العظم العظمي أسفل العظم الجداري واسحبه برفق للخارج حتى ينكشف الدماغ.
بعد تعريض الدماغ ، اقلب الرأس رأسا على عقب. اخفض الدماغ برفق لتصور العصب الثلاثي التوائم على كل جانب. ثم قطع العصب الثلاثي التوائم باستخدام مقص Castroviejo المنحني.
بعد تصور ما تحت المهاد ، حدد العصب البصري وقطعه بلطف. بعد ذلك ، قم بقطع الجزء الأمامي البعيد من الفص الجبهي. قم بإزالة الدماغ واغمره على الفور في محلول التقطيع حتى الحصول على الشرائح.
لتقطيع عينات الدماغ ، ضع الدماغ على ورق ترشيح لتجفيف المحلول الزائد. ثم مع شفرة حلاقة حادة القطع إجراء قطع إكليلي يفصل جذع الدماغ مع المخيخ عن بقية الأنسجة. بعد ذلك ، قم بلصق جزء المرجل من الدماغ بقاعدة الاهتزاز واملأ حجرة جهاز التقطيع بمحلول التقطيع أو محلول aCSF المبرد إلى صفر إلى درجتين مئويتين.
ضع الثلج الجاف حول حجرة الاهتزاز للحفاظ على محلول التقطيع باردا أثناء الإجراء. أدخل شفرة الحلاقة في الاهتزاز واضبط معلمات القطع الخاصة بالجهاز ، مثل السرعة إلى ثلاثة ، والتردد إلى تسعة ، والتغذية إلى 250 ميكرومتر. أثناء إجراء تقطيع الأنسجة ، انقل الشرائح باستخدام ماصة نقل الأكريليك إلى غرفة الاسترداد وانتظر 60 دقيقة لاستعادة الأنسجة بعد الحصول على الشرائح.
قبل البدء في ختم الخلية وتسجيلها ، قم بتشغيل المجهر ومكبر الصوت والتحويل الرقمي والمناور الدقيق. قم ببناء غرفة التسجيل المرفقة بالمجهر باستخدام محلول aCSF. استخدم مضخة التروية لتهوية السائل الدماغي النخاعي باستمرار بمعدل ملليلتر في الدقيقة.
تحقق من إعدادات البرنامج وأنشئ بروتوكولات محددة للتسجيلات وفقا لنوع التجربة. انقل شريحة دماغية ذات أهمية واحدة تلو الأخرى إلى غرفة التسجيل باستخدام ماصة نقل الأكريليك. أمسك الشريحة بمرساة شريحة حتى لا تتحرك أثناء تروية السائل الدماغي الشوكي.
ضع الشريحة في وسط غرفة التسجيل باستخدام عدسة الهدف منخفضة الطاقة لمجهر الغمر ، 10X أو 20X. يعد موضع الشريحة أمرا بالغ الأهمية للسماح برؤية جيدة للمنطقة المرغوبة تحت المجهر وللوصول المثالي إلى ماصة التسجيل الدقيقة. بعد تحديد المنطقة محل الاهتمام ، قم بتبديل العدسة الموضوعية إلى العدسة عالية الطاقة ، 63X والتركيز على مستوى الأنسجة مع مراقبة البروتين الفلوري الداخلي وأشكال الخلايا في المنطقة المستهدفة لتحديد موقع خلايا kisspeptin على سطح شريحة الدماغ.
عند تحديد موقع خلية هدف محتملة ، قم بتمييزها على شاشة الكمبيوتر بمؤشر الماوس أو عن طريق رسم تنسيق مثل مربع فوق منطقة الاهتمام. تساعد علامة شاشة الكمبيوتر في توجيه موضع ماصة التسجيل إلى الخلية. بعد تحديد الموقع الدقيق للخلية المستهدفة ، ارفع الهدف وأدخل ماصة التسجيل الدقيقة المملوءة بالمحلول الداخلي في حامل القطب الكهربائي لضمان ملامسة المحلول الداخلي للقطب الفضي.
ضع ضغطا إيجابيا قبل غمر الماصة الدقيقة في محلول aCSF باستخدام حقنة مملوءة بالهواء من واحد إلى ثلاثة ملليلتر متصلة بحامل الماصة الدقيقة من خلال أنبوب بولي إيثيلين لمنع الحطام من دخول الماصة الدقيقة. باستخدام مناور دقيق توجيه micropipette أسفل مركز الهدف. حرك أزرار المناور الدقيق لتوجيه محور XYZ للماصة الدقيقة نحو الخلية محل الاهتمام.
اضبط التركيز البؤري لرؤية طرف الماصة الدقيقة وتقريب التركيز البؤري ، ولكن ليس قريبا جدا من الشريحة. قلل من سرعة المعالج الدقيق وقم بخفض الماصة الدقيقة ببطء إلى سهل التركيز ، مما يضمن أن طرف الماصة الدقيقة لا يخترق الشريحة فجأة ، ولكنه ينزل ببطء حتى يلامس سطح الخلية أو المنطقة المستهدفة. تطبيق ضغط إيجابي خفيف مع حقنة مملوءة بالهواء من واحد إلى ثلاثة ملليلتر لإزالة أي حطام من مسار الاقتراب.
حرك المعالج الدقيق ببطء على محور XYZ لتقريب طرف الماصة الدقيقة ولمس الخلية المستهدفة التي تسبب غمازة بسبب الضغط المطبق. بعد إنشاء الدمل بمساعدة وضع مشبك الجهد على البرنامج ، قم بتطبيق شفط قصير ضعيف عن طريق الفم لمدة ثانية إلى ثانيتين من خلال الأنبوب المتصل بحامل الماصة الدقيقة لتوليد الختم بين الماصة الدقيقة إلى الخلية. إذا ظل الختم مستقرا ميكانيكيا دون تدخل الضوضاء لمدة دقيقة تقريبا ، فاضبط جهد التثبيت عند أقرب إمكانات الراحة الفسيولوجية للخلية المعنية.
للخلايا العصبية تحت المهاد كيسبيبتين ينصح ناقص 50 ميليفولت. بعد ذلك ، قم بتطبيق شفط قصير عن طريق الفم لكسر غشاء البلازما عند طرف الماصة الدقيقة المختوم الموضوع في الخلية حتى لا يسد الغشاء الممزق الماصة الدقيقة أو يجذب جزءا كبيرا من الغشاء أو الخلية. يمكن تحقيق تكوين خلية كاملة كافية عن طريق إجراء الشفط بقوة كافية.
تحقق من دليل إعدادات النظام المستخدم. بعد كسر غشاء الخلية ، قم بتمكين خيار الخلية بالكامل في وضع مشبك الجهد وانقر فوق الأمر التلقائي الذي يشير إلى علامة تبويب الخلية بأكملها. يتم حساب مقاومة سلسلة الخلية وسعة الخلية بأكملها تلقائيا وعرضها على الفور بواسطة البرنامج.
بعد ذلك ، تحقق من معلمات صلاحية الخلية في البرنامج كما هو موضح في المخطوطة النصية. راقب مقاومة السلسلة وسعة الحالة الثابتة للخلية أثناء التجارب. بمجرد تحقيق تكوين الخلية بالكامل بشكل صحيح ، قم بقياس التيارات المشبكية في وضع مشبك الجهد.
سجل التغيرات في إمكانات غشاء الراحة والتغيرات المحتملة لغشاء الراحة المستحث في وضع المشبك الحالي. تمت دراسة الآثار المحتملة لهرمون النمو البشري المؤتلف على نشاط الخلايا العصبية تحت المهاد بمساعدة تسجيلات المشبك التصحيح الخلية الكاملة. إدارة هرمون النمو المؤتلف البشري, هرمون النمو عند 20 ميكروغرام لكل غرام تسبب فرط استقطاب كبير من إمكانات غشاء الراحة في 5 من أصل 12 الخلايا العصبية AVPV / PeN kisspeptin و 9 من أصل 14 الخلايا العصبية ARH kisspeptin المسجلة.
غيرت الخلايا العصبية شديدة الاستقطاب AVPV / PeN kisspeptin و ARH kisspeptin بشكل كبير إمكانات غشاء الراحة مقارنة بالخلايا غير المستجيبة. الآثار على يستريح غشاء المحتملة أثناء تطبيق هرمون النمو يتبع انخفاض كبير في مقاومة مدخلات الخلية بأكملها من حوالي 0.9 إلى 0.7 جيجا أوم على الخلايا العصبية AVPV / PeN kisspeptin و 1.7 إلى 1.0 جيجا أوم على الخلايا العصبية ARH kisspeptin. خلال خطوط الدماغ المثالية التي يتم إجراؤها عبر gigaseal الدقيق والمنطقة في الخلية عبر معلمات الشاطئ مطلوبة لتحقيق أفضل تسجيلات الخلية الكاملة.
يمكن جمع محلول الماصة الدقيقة للخلية المسجلة واستخدامه لخلية واحدة RTPCR مما يسمح بالتوصيف الجزيئي لخلية معزولة. تمثل تقنية مشبك رقعة الخلية الكاملة جنبا إلى جنب مع استخدام الحيوانات المعدلة وراثيا طفرة في فهم التكاثر مما يسمح بتعريف خصائص الخلايا العصبية kisspeptin المتزايدة ، وهي معدلات رئيسية.
