Les neurones hypothalamiques de kisspeptine comme cible pour les enregistrements de patch-clamp à cellules entières

En mesurant les propriétés électrophysiologiques des membranes cellulaires, la question du principal prouve que moduler l’activité électrique d’une cellule peut être résolu. L’enregistrement de patch clamp à cellules entières est une technique périphérique pour étudier les courants ioniques dans des cellules individuelles et interroger la réponse cellulaire à différents stimuli. La meilleure performance sur les pré-enregistrements de patch clamp à cellules entières sera obtenue après avoir beaucoup pratiqué et étudié.

Pour commencer la dissection cérébrale, faites une incision à l’aide de ciseaux chirurgicaux dans la peau au sommet du crâne de l’animal décapité de la caudale au rostral et retirez le cuir chevelu. Ensuite, coupez la plaque interpariétale le long de la suture sagittale avec les ciseaux d’iris et retirez l’os occipital. Glissez l’ostéotome sous l’os pariétal et retirez-le doucement jusqu’à ce que le cerveau soit exposé.

Après avoir exposé le cerveau, tournez la tête à l’envers. Abaissez doucement le cerveau pour visualiser le nerf trijumeau de chaque côté. Ensuite, coupez le nerf trijumeau à l’aide de ciseaux courbes Castroviejo.

Après avoir visualisé l’hypothalamus, identifiez le nerf optique et coupez-le doucement. Ensuite, coupez la partie antérieure éloignée du lobe frontal. Retirez le cerveau et immergez-le immédiatement dans la solution de tranchage jusqu’à l’acquisition des tranches.

Pour trancher les échantillons de cerveau, placez le cerveau sur un papier filtre pour sécher l’excès de solution. Ensuite, avec une lame de rasoir tranchante, effectuez une coupe coronale séparant le tronc cérébral avec le cervelet du reste du tissu. Ensuite, collez la partie caudle du cerveau à la base d’un vibratome et remplissez la chambre du dispositif de tranchage avec la solution de tranchage ou la solution aCSF refroidie à zéro à deux degrés Celsius.

Placez de la glace sèche autour de la chambre du vibratome pour garder la solution de tranchage froide pendant la procédure. Insérez la lame de rasoir dans le vibratome et réglez les paramètres de coupe de l’appareil, tels que la vitesse à trois, la fréquence à neuf et l’alimentation à 250 micromètres. Pendant la procédure de tranchage des tissus, transférer les tranches à l’aide d’une pipette de transfert en acrylique dans la chambre de récupération et attendre 60 minutes pour la récupération des tissus après l’acquisition de la tranche.

Avant de commencer le scellage et l’enregistrement des cellules, allumez le microscope, l’amplificateur, le numériseur et le micromanipulateur. Construisez la chambre d’enregistrement fixée au microscope avec la solution aCSF. Utilisez une pompe de perfusion pour perfuser constamment l’aCSF à deux millilitres par minute.

Vérifiez les paramètres du logiciel et créez des protocoles spécifiques pour les enregistrements en fonction du type d’expérience. Transférez une tranche de cerveau d’intérêt une à la fois dans la chambre d’enregistrement à l’aide d’une pipette de transfert en acrylique. Tenez la tranche avec une ancre de tranche afin qu’elle ne bouge pas pendant la perfusion aCSF.

Positionnez la tranche au centre de la chambre d’enregistrement à l’aide de la lentille d’objectif basse consommation du microscope à immersion, 10X ou 20X. La position de la tranche est essentielle pour permettre une bonne vue de la région souhaitée au microscope et pour une portée parfaite de la micropipette d’enregistrement. Après avoir localisé la région d’intérêt, passez la lentille de l’objectif à la lentille haute puissance, 63X et concentrez-vous sur le niveau tissulaire en observant la protéine fluorescente endogène et les formes des cellules dans la région cible pour localiser les cellules de la kisspeptine à la surface de la tranche de cerveau.

Lorsqu’une cellule cible possible est localisée, marquez-la sur l’écran de l’ordinateur avec le curseur de la souris ou en dessinant un format comme un carré sur la zone d’intérêt. La marque d’écran de l’ordinateur aide à guider la position de la pipette d’enregistrement vers la cellule. Après avoir déterminé l’emplacement exact de la cellule cible, soulevez l’objectif et introduisez la micropipette d’enregistrement remplie de la solution interne dans le porte-électrode en s’assurant que la solution interne est en contact avec l’électrode d’argent.

Appliquez une pression positive avant de plonger la micropipette dans la solution aCSF à l’aide d’une seringue remplie d’air d’un à trois millilitres reliée au porte-micropipette par un tube en polyéthylène pour empêcher les débris de pénétrer dans la micropipette. À l’aide du micromanipulateur, guidez la micropipette sous le centre de l’objectif. Déplacez les boutons du micromanipulateur pour guider l’axe XYZ de la micropipette vers la cellule d’intérêt.

Ajustez la mise au point pour voir la pointe de la micropipette et rapprochez la mise au point, mais pas trop près de la tranche. Réduisez la vitesse du micromanipulateur et abaissez lentement la micropipette jusqu’à la plaine de mise au point, en veillant à ce que la pointe de la micropipette ne pénètre pas brusquement dans la tranche, mais descende lentement jusqu’à ce qu’elle touche la surface de la cellule ou la région cible. Appliquer une légère pression positive avec une seringue remplie d’air d’un à trois millilitres pour éliminer tous les débris de la trajectoire d’approche.

Déplacez lentement le micromanipulateur sur l’axe XYZ pour rapprocher l’embout de la micropipette et toucher la cellule cible qui provoque une fossette par la pression appliquée. Après avoir établi la fossette à l’aide du mode de serrage de tension sur le logiciel, appliquez une faible aspiration brève par la bouche pendant une à deux secondes à travers le tube connecté au support de micropipette pour générer l’étanchéité entre la micropipette et la cellule. Si le joint reste mécaniquement stable sans interférence sonore pendant environ une minute, réglez la tension de maintien au potentiel de repos physiologique le plus proche de la cellule d’intérêt.

Pour les neurones hypothalamiques kisspeptine moins 50 millivolts est recommandé. Ensuite, appliquez une brève aspiration par la bouche pour briser la membrane plasmique à l’extrémité de la micropipette scellée placée sur la cellule afin que la membrane rompue n’obstrue pas la micropipette ou n’attire pas une partie importante de la membrane ou la cellule. Une configuration adéquate de la cellule entière peut être obtenue en effectuant une aspiration avec une force suffisante.

Vérifiez le manuel des paramètres système utilisé. Après avoir cassé la membrane cellulaire, activez l’option cellule entière en mode de serrage de tension et cliquez sur la commande automatique faisant référence à l’onglet de la cellule entière. La résistance série de la cellule et la capacité de la cellule entière sont automatiquement calculées et affichées instantanément par le logiciel.

Ensuite, vérifiez les paramètres de viabilité de la cellule dans le logiciel comme décrit dans le manuscrit texte. Surveillez la résistance en série et la capacité stationnaire de la cellule pendant les expériences. Une fois que la configuration de la cellule entière est correctement réalisée, mesurez les courants synaptiques en mode de pince de tension.

Enregistrer les changements dans le potentiel de membrane au repos et les variations induites du potentiel de membrane au repos dans le mode de serrage actuel. Les effets possibles de l’hormone de croissance recombinante humaine sur l’activité des neurones hypothalamiques kisspeptine ont été étudiés à l’aide d’enregistrements de patch clamp à cellules entières. L’administration de l’hormone de croissance recombinante humaine, HGH à 20 microgrammes par gramme a induit une hyperpolarisation significative du potentiel de la membrane au repos dans 5 des 12 neurones de kisspeptine AVPV / PeN et 9 des 14 neurones ARH kisspeptin enregistrés.

Les neurones hyperpolarisés AVPV/PeN kisspeptin et ARH kisspeptin ont significativement modifié le potentiel de la membrane au repos par rapport aux cellules qui ne répondent pas. Les effets sur le potentiel membranaire au repos pendant l’application de HGH ont suivi une réduction significative de la résistance à l’entrée de la cellule entière d’environ 0,9 à 0,7 gigaohms sur les neurones de la kisspeptine AVPV / PeN et de 1,7 à 1,0 gigaohms sur les neurones de la kisspeptine ARH. Au cours des lignes cérébrales parfaites effectuées via un gigaseal minutieux et la zone de la cellule via la plage, les paramètres sont nécessaires pour obtenir les meilleurs enregistrements de cellules entières.

La solution de micropipette de la cellule enregistrée peut être collectée et utilisée pour la RTPCR unicellulaire permettant la caractérisation moléculaire d’une cellule isolée. La technique de pince patch à cellules entières combinée à l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés représente une percée dans la compréhension de la reproduction permettant la définition des neurones kisspeptine aux propriétés accrues, et ils sont des modulateurs majeurs.