Durch die Messung der elektrophysiologischen Eigenschaften von Zellmembranen beweist die Hauptfrage, dass die elektrische Aktivität einer Zelle moduliert werden kann. Die Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnung ist eine periphere Technik, um Ionenströme in einzelnen Zellen zu untersuchen und die zelluläre Reaktion auf verschiedene Reize zu untersuchen. Die beste Leistung bei Ganzzell-Patch-Clamp-Pre-Recordings wird nach viel Üben und Lernen erreicht.
Um mit der Gehirndissektion zu beginnen, machen Sie mit einer chirurgischen Schere einen Schnitt in die Haut an der Oberseite des Schädels des enthaupteten Tieres von caudle nach rostral und entfernen Sie die Kopfhaut. Als nächstes schneiden Sie mit der Irisschere die interparietale Platte entlang der sagittalen Naht ab und entfernen Sie das Hinterhauptbein. Schieben Sie das Osteotom unter das Scheitelbein und ziehen Sie es vorsichtig heraus, bis das Gehirn freiliegt.
Nachdem Sie das Gehirn freigelegt haben, drehen Sie den Kopf auf den Kopf. Senken Sie das Gehirn sanft ab, um den Trigeminusnerv auf jeder Seite sichtbar zu machen. Schneiden Sie dann den Trigeminusnerv mit einer gebogenen Castroviejo-Schere durch.
Nachdem Sie den Hypothalamus visualisiert haben, identifizieren Sie den Sehnerv und schneiden Sie ihn vorsichtig durch. Schneiden Sie als Nächstes den vorderen Teil des Frontallappens ab. Entfernen Sie das Gehirn und tauchen Sie es sofort in die Schneidelösung, bis Sie die Scheiben erhalten.
Um die Gehirnproben in Scheiben zu schneiden, legen Sie das Gehirn auf ein Filterpapier, um die überschüssige Lösung zu trocknen. Führen Sie dann mit einer scharfen Rasierklinge einen koronalen Schnitt durch, bei dem der Hirnstamm mit dem Kleinhirn vom Rest des Gewebes getrennt wird. Kleben Sie dann den Caudle-Teil des Gehirns an die Basis eines Vibratoms und füllen Sie die Schneidekammer mit der auf null bis zwei Grad Celsius gekühlten Schneidelösung oder Liquorlösung.
Packen Sie Trockeneis um die Vibratomkammer, um die Schneidelösung während des Vorgangs kalt zu halten. Führen Sie die Rasierklinge in das Vibratom ein und stellen Sie die Schneidparameter des Geräts ein, z. B. Geschwindigkeit auf drei, Frequenz auf neun und Vorschub auf 250 Mikrometer. Übertragen Sie die Scheiben während des Gewebeaufschnitts mit einer Acryl-Transferpipette in die Auffangkammer und warten Sie 60 Minuten auf die Gewebeerholung nach der Schichtgewinnung.
Bevor Sie mit der Zellversiegelung und -aufzeichnung beginnen, schalten Sie das Mikroskop, den Verstärker, den Digitizer und den Mikromanipulator ein. Bauen Sie die am Mikroskop befestigte Aufnahmekammer mit der aCSF-Lösung. Verwenden Sie eine Perfusionspumpe, um den aCSF konstant mit zwei Millilitern pro Minute zu perfundieren.
Überprüfen Sie die Softwareeinstellungen und erstellen Sie je nach Art des Experiments spezifische Protokolle für die Aufzeichnungen. Übertragen Sie eine Gehirnscheibe, die Sie interessiert, nacheinander mit einer Acryl-Transferpipette in die Aufnahmekammer. Halten Sie die Scheibe mit einem Scheibenanker fest, damit sie sich während der aCSF-Perfusion nicht bewegt.
Positionieren Sie die Scheibe in der Mitte der Aufnahmekammer mit der Objektivlinse des Immersionsmikroskops mit geringer Leistung, 10X oder 20X. Die Schichtposition ist entscheidend, um eine gute Sicht auf den gewünschten Bereich unter dem Mikroskop zu ermöglichen und eine perfekte Reichweite für die aufnehmende Mikropipette zu gewährleisten. Nachdem Sie den interessierenden Bereich lokalisiert haben, schalten Sie die Objektivlinse auf die Hochleistungslinse 63X um und konzentrieren Sie sich auf die Gewebeebene, wobei Sie das endogene fluoreszierende Protein und die Formen der Zellen in der Zielregion beobachten, um die Kisspeptinzellen auf der Oberfläche des Gehirnschnitts zu lokalisieren.
Wenn sich eine mögliche Zielzelle befindet, markieren Sie sie auf dem Computerbildschirm mit dem Mauszeiger oder indem Sie ein Format wie ein Quadrat über den Interessenbereich zeichnen. Die Markierung des Computerbildschirms hilft dabei, die Position der Aufnahmepipette zur Zelle zu führen. Nachdem Sie die genaue Position der Zielzelle bestimmt haben, heben Sie das Objektiv an und führen Sie die mit der internen Lösung gefüllte Aufnahmemikropipette in den Elektrodenhalter ein, wobei darauf zu achten ist, dass die interne Lösung mit der Silberelektrode in Kontakt steht.
Üben Sie einen Überdruck aus, bevor Sie die Mikropipette mit einer luftgefüllten Spritze von ein bis drei Millilitern, die über einen Polyethylenschlauch mit dem Mikropipettenhalter verbunden ist, in die aCSF-Lösung tauchen, um das Eindringen von Schmutz in die Mikropipette zu verhindern. Führen Sie die Mikropipette mit dem Mikromanipulator unterhalb der Mitte des Objektivs. Bewegen Sie die Tasten des Mikromanipulators, um die XYZ-Achse der Mikropipette in Richtung der gewünschten Zelle zu führen.
Stellen Sie den Fokus so ein, dass die Spitze der Mikropipette zu sehen ist, und bringen Sie den Fokus näher, aber nicht zu nahe an die Scheibe. Verringern Sie die Geschwindigkeit des Mikromanipulators und senken Sie die Mikropipette langsam auf die Fokusebene ab, wobei darauf zu achten ist, dass die Mikropipettenspitze nicht abrupt in die Scheibe eindringt, sondern langsam absinkt, bis sie die Zelloberfläche oder den Zielbereich berührt. Leichter Überdruck mit einer luftgefüllten Spritze von ein bis drei Millilitern, um Schmutz aus der Anflugbahn zu entfernen.
Bewegen Sie den Mikromanipulator langsam auf der XYZ-Achse, um die Mikropipettenspitze näher zu bringen und die Zielzelle zu berühren, die durch den ausgeübten Druck eine Vertiefung verursacht. Nachdem Sie die Vertiefung mit Hilfe des Voltage-Clamp-Modus in der Software hergestellt haben, saugen Sie ein bis zwei Sekunden lang schwach und kurz durch den Mund, der mit dem Mikropipettenhalter verbunden ist, um die Abdichtung zwischen der Mikropipette und der Zelle zu erzeugen. Wenn die Dichtung etwa eine Minute lang mechanisch stabil bleibt, ohne dass es zu Störungen kommt, stellen Sie die Haltespannung auf das nächstgelegene physiologische Ruhepotential der zu untersuchenden Zelle ein.
Für Kisspeptin werden hypothalamische Neuronen minus 50 Millivolt empfohlen. Saugen Sie anschließend kurz mit dem Mund an, um die Plasmamembran an der Mikropipettenspitze zu brechen, die mit der Zelle versiegelt ist, damit die gerissene Membran die Mikropipette nicht verstopft oder einen beträchtlichen Membranabschnitt oder die Zelle anzieht. Eine adäquate Gesamtzellkonfiguration kann erreicht werden, indem mit ausreichender Kraft abgesaugt wird.
Überprüfen Sie das verwendete Handbuch für die Systemeinstellungen. Nachdem Sie die Zellmembran gebrochen haben, aktivieren Sie die Option "Gesamte Zelle" im Spannungszangenmodus und klicken Sie auf den automatischen Befehl, der sich auf die Registerkarte "Gesamte Zelle" bezieht. Der Serienwiderstand der Zelle und die Kapazität der gesamten Zelle werden automatisch berechnet und sofort von der Software angezeigt.
Überprüfen Sie als Nächstes die Parameter der Zellviabilität in der Software, wie im Textmanuskript beschrieben. Überwachen Sie den Serienwiderstand und die stationäre Kapazität der Zelle während der Experimente. Sobald die gesamte Zellkonfiguration richtig erreicht ist, messen Sie synaptische Ströme im Voltage-Clamp-Modus.
Zeichnen Sie die Änderungen des Ruhemembranpotentials und die induzierten Schwankungen des Ruhemembranpotentials im Stromklemmmodus auf. Die möglichen Auswirkungen von humanem rekombinantem Wachstumshormon auf die Aktivität von hypothalamischen Kisspeptin-Neuronen wurden mit Hilfe von Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen untersucht. Die Verabreichung des humanen rekombinanten Wachstumshormons HGH in einer Dosierung von 20 Mikrogramm pro Gramm induzierte eine signifikante Hyperpolarisation des Ruhemembranpotentials in 5 von 12 AVPV/PeN-Kisspeptin-Neuronen und 9 von 14 aufgezeichneten ARH-Kisspeptin-Neuronen.
Die hyperpolarisierten AVPV/PeN-Kisspeptin- und ARH-Kisspeptin-Neurone veränderten das Ruhemembranpotential signifikant im Vergleich zu den nicht reagierenden Zellen. Die Effekte auf das Ruhemembranpotential während der HGH-Applikation folgten einer signifikanten Reduktion des Ganzzell-Eingangswiderstands von etwa 0,9 bis 0,7 Gigaohm auf AVPV/PeN-Kisspeptin-Neuronen und 1,7 bis 1,0 Gigaohm auf ARH-Kisspeptin-Neuronen. Während der perfekten Gehirnlinien, die über eine sorgfältige Gigaseal durchgeführt werden, und der Bereichssache an der Zelle über Strandparameter sind die Parameter erforderlich, um die besten Ganzzellableitungen zu erzielen.
Die Mikropipettenlösung der aufgezeichneten Zelle kann gesammelt und für Einzelzell-RTPCR verwendet werden, was die molekulare Charakterisierung einer isolierten Zelle ermöglicht. Die Ganzzell-Patch-Clamp-Technik in Kombination mit der Verwendung genetisch veränderter Tiere stellt einen Durchbruch im Verständnis der Fortpflanzung dar, die es ermöglicht, die Eigenschaften von Kisspeptin-Neuronen zu definieren, und sie sind wichtige Modulatoren.
