يصف هذا البروتوكول طريقة منخفضة التكلفة لإجراء فحوصات جدوى الدواء باستخدام عضويات سرطان المبيض المشتقة من المريض. المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي استخدام مواد ومعدات مخبرية منخفضة التكلفة ومتاحة بسهولة. يمكن استخدام هذه الطريقة قبل إجراء شاشات الأدوية عالية الإنتاجية باهظة الثمن.
على الرغم من أن الطريقة تتعامل مع إجراء فحوصات جدوى الدواء في عضويات سرطان المبيض المشتقة من المريض ، إلا أنه يمكن تطبيقها على أي نظام عضوي ، بما في ذلك تلك المشتقة من الفئران. للبدء ، راقب مستخلص الغشاء القاعدي أو BME الذي يحتوي على عضويات تحت مجهر برايت فيلد لضمان التقاء 70 إلى 90٪. باستخدام ماصة ، أضف ملليلتر إلى ملليلتر من الوسائط الأساسية الدافئة مسبقا إلى البئر التي تحتوي على المواد العضوية وقم بفصل المواد العضوية ميكانيكيا عن طريق سحبها لأعلى ولأسفل.
انقل المعلق العضوي بالكامل إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر ودوامة الأنبوب لمدة خمس إلى 10 ثوان لمزيد من تفكيك الخلايا. ثم ، أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 1،107 G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. باستخدام ماصة أحادية القناة ، نضح وتجاهل المادة الطافية.
أعد تعليق الحبيبات في ملليلتر واحد من كاشف التفكك العضوي المسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية ، وانقل التعليق إلى أنبوب طرد مركزي صغير سعة 1.5 ملليلتر. احتضان العينة لمدة سبع دقائق عند 37 درجة سلزية. ثم أجهزة الطرد المركزي النتيجة في تعليق الخلية في 1،107 G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.
بعد التخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق حبيبات الخلية في ملليلتر واحد من الوسائط الأساسية الدافئة مسبقا. إعادة تكوين الخلايا في مزيج من الوسائط الأساسية و BME ، مع الحفاظ على تركيز نهائي يبلغ 20،000 خلية لكل 10 ميكرولتر. لوحة قطرة واحدة من ثلاثة ميكرولتر من الخلايا المعاد تعليقها لكل بئر من لوحة بئر سوداء غير شفافة 96.
احتضان اللوحة في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. أخيرا ، أضف 100 ميكرولتر من الوسائط العضوية المتقدمة المسخنة مسبقا إلى كل بئر قبل احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 24 إلى 72 ساعة. إجراء العلاج من تعاطي المخدرات من المواد العضوية بعد يومين من طلائها.
إجراء مقايسة الجدوى على المواد العضوية بعد سبعة أيام من العلاج بالعقاقير. أضف 100 ميكرولتر من كاشف فحص الجدوى إلى كل بئر ، وبذلك يصل الحجم الإجمالي إلى 200 ميكرولتر ، ويهز اللوحة عند 80 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق. ثم اترك اللوحة تحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 25 دقيقة إضافية.
وفي الوقت نفسه ، قم بتشغيل قارئ لوحة التلألؤ الحيوي وافتح برنامج التحكم في العين. انتقل للاتصال بالأداة "وحدد Infinite 200Pro" حدد التلألؤ "والبرنامج النصي الافتراضي" التالي من القائمة المنسدلة ، اختر BD 96 FB Falcon BD Falcon 96 Flat Black "كنوع اللوحة لتعيين معلمات التلألؤ. تعيين التوهين ك بلا.
وقت التكامل هو 1000 مللي ثانية ووقت الاستقرار على أنه صفر مللي ثانية. أخيرا ، اكشف عن اللوحة ، وقم بتحميلها على قارئ اللوحة ، واضغط على "ابدأ" للبدء. تم الحصول على صور برايتفيلد للعضوين المختلفين المشتقين من المريض ، أو PDOs ، المستخدمة في البروتوكول.
PDO واحد ، مشتق من خزعة الورم و PDO اثنين مشتقة من الاستسقاء. كشفت نتائج فحص الجدوى عن النسبة المئوية للخلايا الحية في PDO واحد و PDO اثنين بعد أن تم التعامل مع كلاهما بتركيزات متفاوتة من الكاربوبلاتين. تم رسم معدل النمو المحسوب ، أو قيم GR ، مقابل تركيزات الكاربوبلاتين المقابلة ، وكشفت مقاييس GR أن قيمة GR50 ل PDO واحد كانت أعلى بكثير من قيمة PDO اثنين.
يشير هذا إلى أن PDO one كان أكثر مقاومة للعلاج الكيميائي البلاتيني أثناء الطلاء ، من الأهمية بمكان أن يتم وضع قطرة ثلاثة ميكرولتر من تعليق الخلية مباشرة في وسط البئر. إذا تم وضع القطرة بالقرب من حافة البئر ، فقد يتسبب ذلك في انهيار القطرة ، مما يؤثر على نتائج الفحص.
