تم تمويل هذا العمل من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة 5R01AI144149. تم إنشاء الأشكال التخطيطية باستخدام BioRender.

دليل لتعطيل الجينات الدقيق في الضامة الأولية المشتقة من نخاع العظم

<ol>
	<li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+and+pathogenic+functions+of+macrophage+subsets.">Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).</li><li>Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+biology+in+development,+homeostasis,+and+disease.">Macrophage biology in development, homeostasis, and disease.</a> Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).</li><li>Paddison, P. J., Caudy, A. A., Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+suppression+of+gene+expression+by+RNAi+in+mammalian+cells.">Stable suppression of gene expression by RNAi in mammalian cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (3), 1443-1448 (2002).</li><li>Laugel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+isogenic+cells+deficient+for+MR1+with+a+CRISPR/Cas9+lentiviral+system:+Tools+to+study+microbial+antigen+processing+and+presentation+to+human+MR1-restricted+T+cells.">Engineering of isogenic cells deficient for MR1 with a CRISPR/Cas9 lentiviral system: Tools to study microbial antigen processing and presentation to human MR1-restricted T cells.</a> The Journal of Immunology. 197 (3), 971-982 (2016).</li><li>Andreu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+macrophages+and+J774+cells+respond+differently+to+infection+with+Mycobacterium+tuberculosis.">Primary macrophages and J774 cells respond differently to infection with Mycobacterium tuberculosis.</a> Scientific Reports. 7, 42225 (2017).</li><li>Roberts, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9++conditionally-immortalized+macrophages+as+a+tool+for+bacterial+pathogenesis+and+beyond.">Cas9+ conditionally-immortalized macrophages as a tool for bacterial pathogenesis and beyond.</a> eLife. 8, e45957 (2019).</li><li>Oberdoerffer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+RNA+interference+in+the+mouse+hematopoietic+system+varies+between+cell+types+and+developmental+stages.">Efficiency of RNA interference in the mouse hematopoietic system varies between cell types and developmental stages.</a> Molecular and Cellular Biology. 25 (10), 3896-3905 (2005).</li><li>Ma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YTHDF2+orchestrates+tumor-associated+macrophage+reprogramming+and+controls+antitumor+immunity+through+CD8++T+cells.">YTHDF2 orchestrates tumor-associated macrophage reprogramming and controls antitumor immunity through CD8+ T cells.</a> Nature Immunology. 24 (2), 255-266 (2023).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li><li>Cho, S. W., Kim, S., Kim, J. M., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+genome+engineering+in+human+cells+with+the+Cas9+RNA-guided+endonuclease.">Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease.</a> Nature Biotechnology. 31 (3), 230-232 (2013).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-programmed+genome+editing+in+human+cells.">RNA-programmed genome editing in human cells.</a> eLife. 2, e00471 (2013).</li><li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins.">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li><li>Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+homology-directed+human+genome+engineering+by+controlled+timing+of+CRISPR/Cas9+delivery.">Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery.</a> eLife. 3, 04766 (2014).</li><li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition.">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Research. 42 (22), e168 (2014).</li><li>Craft, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9-mediated+genome+editing+in+primary+murine+bone+marrow-derived+macrophages.">CRISPR-Cas9-mediated genome editing in primary murine bone marrow-derived macrophages.</a> University of California, Davis. , (2022).</li><li>Herb, M., Farid, A., Gluschko, A., Kr&#246;nke, M., Schramm, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+transfection+of+primary+macrophages+with+in+vitro+transcribed+mRNA.">Highly efficient transfection of primary macrophages with in vitro transcribed mRNA.</a> Journal of Visualized Experiments. (153), e60143 (2019).</li><li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+delivery+of+Cas9+protein/gRNA+complexes+using+lipofectamine+CRISPRMAX.">Improved delivery of Cas9 protein/gRNA complexes using lipofectamine CRISPRMAX.</a> Biotechnology Letters. 38 (6), 919-929 (2016).</li></ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

يسمح تحرير الجينوم باستخدام مجمعات Cas9-sgRNA المكهربة بالتعطيل الفعال لوظيفة الجينات في BMDMs. تختلف كفاءة التحرير حسب التسلسل المستهدف والجين. عادة ، يتم فحص أربعة إلى خمسة sgRNAs بشكل عام لتحديد واحد نشط للغاية. تتمتع بعض المواضع بكفاءة تحرير أقل ، ويرجع ذلك على الأرجح إلى بنية الكروماتين. في هذه...

البلاعم هي خلايا مناعية فطرية تلعب أدوارا حاسمة في إصلاح الأنسجة والمناعة 1,2. تتميز خطوط خلايا البلاعم الخالدة ، مثل خلايا الماوس RAW 264.7 أو خلايا THP-1 البشرية ، بالعديد من الخصائص المفيدة ، بما في ذلك النمو القوي وسهولة تعطيل الجينات عن طريق توصيل ناقلات لتداخل الحمض النووي الريبي أو CRISPR / Cas9 3,4. ومع ذلك ، فإن التحول السرطاني يغير بشكل كبير فسيولوجيتها ، مما يؤدي إلى التنشيط الشاذ لبعض المسارات والاستجابات الصامتة للآخرين 5,6. تلخص البلاعم الأولية المشتقة من نخاع العظم (BMDMs) بشكل أوثق في فسيولوجيا البلاعم في الجسم الحي ، ولكنها تظل صعبة التلاعب وراثيا بسبب الكفاءة المنخفضة لكل من نقل البلازميد والنقل الفيروسي في هذه الخلايا المناعية الأولية 7,8. وبالتالي ، هناك حاجة إلى طرق أكثر كفاءة لتعطيل وظيفة الجينات.
يعد تحرير الجينوم CRISPR / Cas9 أداة قوية للتلاعب الجيني عبر مجموعة من الأنظمة البيولوجية ، بما في ذلك خلايا الثدييات9،10،11،12. يقوم بروتين Streptococcus pyogenes Cas9 بكفاءة وعلى وجه التحديد بشق الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل عند تعقيده باستخدام الحمض النووي الريبي الإرشادي الخاص بالتسلسل. يؤدي إصلاح الحمض النووي من خلال الانضمام النهائي غير المتماثل (NHEJ) للحمض النووي المشقوق إلى عمليات إدخال أو حذف صغيرة (indels) تخلق طفرات إزاحة الإطار. في الدراسات المبكرة ، تم تسليم Cas9 و sgRNAs من خلال ناقلات البلازميد أو الفيروسات العدسية ، وهي طرق توصيل فعالة للعديد من خطوط الخلايا 9,10. ومع ذلك ، فإن الخلايا الأولية ، وعلى وجه الخصوص ، الخلايا المناعية الأولية غالبا ما تكون مقاومة لهذه الطرق بسبب انخفاض كفاءة توصيل النواقل عن طريق النقل أو التنبيث. بعد ذلك ، تم تطوير طرق لتوليد مجمعات sgRNA-Cas9 في المختبر وتسليمها عن طريق التثقيب الكهربائي ، وقد حققت هذه الطرق كفاءة عالية في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا13,14. اقترحت النتائج إمكانية استخدام هذا النهج لإجراء تحرير الجينوم في البلاعم الأولية.
هنا ، نقدم بروتوكولا لاستخدام مجمعات البروتين النووي الريبي sgRNA-Cas9 (RNPs) لإجراء تحرير الجينوم في BMDMs الأولية. يحتوي على خطوات للتخفيف من تنشيط أجهزة الاستشعار المناعية الموجودة في الخلايا المناعية الأولية ويؤدي إلى تحرير يصل إلى 95٪ في المواقع المستهدفة بأقل قدر من السمية. يتضمن هذا البروتوكول أيضا مهام سير العمل لتقييم كفاءة التحرير باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الروتيني (PCR) وتسلسل سانجر ، يليه في تحليل السيليكو بواسطة تتبع Indels بواسطة التحلل (TIDE) 15 ، وهي أداة برمجية عبر الإنترنت تم التحقق من صحتها جيدا.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3T3-MCSF Cell Line</td>
			<td>Gift from Russell Vance</td>
			<td>not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R Cas9 Electroporation Enhancer</td>
			<td>IDT</td>
			<td>1075915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampure XP Reagent Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calf intestinal alkaline phosphatase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0525S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS +Ca/Mg (0.9mM CaCl2 and 0.5mM MgCl2)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14040-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS -Ca/Mg</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0293S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-015-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Herculase DNA polymerase &#38; buffer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>600677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2040S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LoBind conical tubes 15 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30122216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LoBind Eppendorf tubes 2 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer r2.1</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B6002S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>MPK5000, MPP100, MPS100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System 10 uL Tips</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>MPK1025 or MPK1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS + 1mM EDTA</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE02017F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EO0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rCutSmart Buffer for ExoI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B6004S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribolock</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EO0384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA loading dye</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B0363S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. pyogenes Cas9-NLS</td>
			<td>University of California Macro Lab</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>Available to non-UC investigators through&#160; https://qb3.berkeley.edu</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. pyogenes Cas9-NLS, modified 3rd Generation</td>
			<td>IDT</td>
			<td>1081059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAP</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0371S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-efficiency gene disruption in primary bone marrow-derived macrophages using electroporated cas9-sgrna complexes

تعد البلاعم المشتقة من نخاع العظم (BMDMs) من الفئران أداة رئيسية لدراسة البيولوجيا المعقدة لبلاعم الأنسجة. كخلايا أولية ، فإنها تمثل فسيولوجيا البلاعم في الجسم الحي بشكل أوثق من خطوط خلايا البلاعم الخالدة ويمكن اشتقاقها من الفئران التي تحمل بالفعل تغييرات جينية محددة. ومع ذلك ، فإن تعطيل وظيفة الجينات في BMDMs لا يزال يمثل تحديا تقنيا. هنا ، نقدم بروتوكولا لتحرير جينوم CRISPR / Cas9 الفعال في BMDMs ، والذي يسمح بإدخال عمليات إدخال وحذف صغيرة (indels) تؤدي إلى طفرات إزاحة الإطار التي تعطل وظيفة الجينات. يصف البروتوكول كيفية تجميع الحمض النووي الريبي أحادي التوجيه (sgRNA-Cas9) وتشكيل مجمعات البروتين النووي الريبي sgRNA-Cas9 المنقاة (RNPs) التي يمكن توصيلها عن طريق التثقيب الكهربائي. كما يوفر طريقة فعالة لمراقبة كفاءة التحرير باستخدام تسلسل سانجر الروتيني وبرنامج تحليل متاح مجانا عبر الإنترنت. يمكن تنفيذ البروتوكول في غضون 1 أسبوع ولا يتطلب بناء البلازميد. ينتج عنه عادة كفاءة تحرير تتراوح من 85٪ إلى 95٪.

Macrophages are innate immune cells that play critical roles in tissue repair and immunity1,2. Immortalized macrophage cell lines, such as mouse RAW 264.7 cells or human THP-1 cells, have several beneficial characteristics, including robust growth and ease of gene disruption by delivering vectors for RNA interference or CRISPR/Cas93,4. However, oncogenic transformation dramatically alters their physiology, which results in the aberrant activation of some pathways and muted responses of others5,6. Primary bone marrow-derived macrophages (BMDMs) more closely recapitulate in vivo macrophage physiology, but remain challenging to genetically manipulate due to the low efficiency of both plasmid transfection and viral transduction in these primary immune cells7,8. Thus, more efficient methods for disrupting gene function are needed.
CRISPR/Cas9 genome editing is a powerful tool for genetic manipulation across a range of biological systems, including mammalian cells9,10,11,12. The Streptococcus pyogenes Cas9 protein efficiently and specifically cleaves double-stranded DNA when complexed with a sequence-specific guide RNA. DNA repair through the non-homologous end joining (NHEJ) of the cleaved DNA results in small insertions or deletions (indels) that create frameshift mutations. In early studies, Cas9 and sgRNAs were delivered through plasmid or lentiviral vectors, which are effective delivery methods for many cell lines9,10. However, primary cells and, in particular, primary immune cells are often refractory to these methods due to the low efficiency of vector delivery by transfection or transduction. Subsequently, methods have been developed to generate sgRNA-Cas9 complexes in vitro and to deliver them via electroporation, and these methods have achieved high efficiency in a variety of cell types13,14. The results have suggested the possibility of using this approach to carry out genome editing in primary macrophages.
Here, we provide a protocol for using sgRNA-Cas9 ribonucleoprotein complexes (RNPs) to carry out genome editing in primary BMDMs. It contains steps to mitigate the activation of the immune sensors present in primary immune cells and results in up to 95% editing at targeted loci with minimal toxicity. This protocol also includes workflows to evaluate editing efficiency using routine polymerase chain reaction (PCR) and Sanger sequencing, followed by in silico analysis by Tracking of Indels by Decomposition (TIDE)15, a well-validated online software tool.

تسليط الضوء على المؤلف: تحرير جينوم CRISPR / Cas9 الفعال في الضامة المشتقة من نخاع العظام لتعطيل الجينات بدقة

اضطراب جيني عالي الكفاءة في البلاعم الأولية المشتقة من نخاع العظم باستخدام مجمعات Cas9-sgRNA الكهربائية

Our laboratory studies the interaction between mycobacterium, tuberculosis and the host immune system, with a focus on the initial interaction between the bacterium and the macrophage. There's a variety of gene-disruption techniques used in macrophages, including RNAi technologies and CRISPR technologies. One of the major challenges is the low efficiency of gene disruption in macrophages.This protocol enables the rapid and high-efficiency genetic manipulation of primary macrophages without the need for cloning and plasmid construction. These methods should be broadly applicable in immunology, enabling researchers to disrupt genes in primary macrophages for a wide array of studies.

قالب IVT هو منتج PCR 127 bp (الشكل 1B). منتج IVT كامل الطول هو 98 nt RNA ، والذي يهاجر بشكل مشابه لجزء DNA مزدوج تقطعت به السبل 70 bp (الشكل 1C).
بعد التثقيب الكهربائي ، يجب أن تكون الخلايا قابلة للحياة بنسبة >90٪ ، مع إجمالي عدد الخلايا بنسبة >70٪ من رقم خلية البداية...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Efficient CRISPR/Cas9 Genome Editing in Bone Marrow-Derived Macrophages for Precise Gene Disruption at JoVE.com

يصف هذا البروتوكول إجراء تحرير الجينوم في البلاعم المشتقة من نخاع عظم الفأر باستخدام مجمعات البروتين النووي الريبي Cas9-sgRNA المجمعة في المختبر وتسليمها عن طريق التثقيب الكهربائي.

Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) from mice are a key tool for studying the complex biology of tissue macrophages. As primary cells, they model the ...

يدرس مختبرنا التفاعل بين المتفطرة والسل والجهاز المناعي المضيف ، مع التركيز على التفاعل الأولي بين البكتيريا والبلاعم. هناك مجموعة متنوعة من تقنيات تعطيل الجينات المستخدمة في البلاعم ، بما في ذلك تقنيات RNAi وتقنيات CRISPR. أحد التحديات الرئيسية هو انخفاض كفاءة اضطراب الجينات في البلاعم.يتيح هذا البروتوكول المعالجة الجينية السريعة وعالية الكفاءة للبلاعم الأولية دون الحاجة إلى الاستنساخ وبناء البلازميد. يجب أن تكون هذه الطرق قابلة للتطبيق على نطاق واسع في علم المناعة ، مما يمكن الباحثين من تعطيل الجينات في الضامة الأولية لمجموعة واسعة من الدراسات.

high-efficiency-gene-disruption-primary-bone-marrow-derived

Research

JoVE Journal

Genetics

High-Efficiency Gene Disruption in Primary Bone Marrow-Derived Macrophages Using Electroporated Cas9-sgRNA Complexes

1.1K Views.  University of California, Davis. يدرس مختبرنا التفاعل بين المتفطرة والسل والجهاز المناعي المضيف ، مع التركيز على التفاعل الأولي بين البكتيريا والبلاعم. هناك مجموعة متنوعة من تقنيات تعطيل الجينات المستخدمة في البلاعم ، بما في ذلك تقنيات RNAi وتقنيات CRISPR. أحد التحديات الرئيسية هو انخفاض كفاءة اضطراب الجينات...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: تحرير جينوم CRISPR / Cas9 الفعال في الضامة المشتقة من نخاع العظام لتعطيل الجينات بدقة

Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) from mice are a key tool for studying the complex biology of tissue macrophages. As primary cells, they model the physiology of macrophages in vivo more closely than immortalized macrophage cell lines and can be derived from mice already carrying defined genetic changes. However, disrupting gene function in BMDMs remains technically challenging. Here, we provide a protocol for efficient CRISPR/Cas9 genome editing in BMDMs, which allows for the introduction of small insertions and deletions (indels) that result in frameshift mutations that disrupt gene function. The protocol describes how to synthesize single-guide RNAs (sgRNA-Cas9) and form purified sgRNA-Cas9 ribonucleoprotein complexes (RNPs) that can be delivered by electroporation. It also provides an efficient method for monitoring editing efficiency using routine Sanger sequencing and a freely available online analysis program. The protocol can be performed within 1 week and does not require plasmid construction; it typically results in 85% to 95% editing efficiency.

This protocol describes the procedure for genome editing in mouse bone marrow-derived macrophages using Cas9-sgRNA ribonucleoprotein complexes assembled in vitro and delivered by electroporation.

Preparation for Electroporation and Ribonucleoprotein Delivery for Genome Editing in Mouse Bone Marrow-Derived Macrophages

To begin, set the parameters of the pipette station placed in the laminar flow hood to 1, 900 volts, 20 milliseconds in one pulse. Carefully remove a transfection tube from the package to keep it sterile and fill it with three milliliters of E buffer. To prepare the cells for electroporation, remove the growth medium from the cells and wash them using PBS to remove the serum and divalent cations that promote adhesion.Then add a mixture of PBS and one millimolar EDTA to the cells and incubate at room temperature for about five minutes until the cells begin to detach. Pipette up and down gently to detach the cells and transfer the cells to a low protein binding 15 milliliter tube. Pellet the cells at 500 G for five minutes.After centrifugation quickly remove most of the supernatant, leaving about one milliliter of the supernatant in the tube. Resuspend the cells in the remaining supernatant and transfer it to a low protein binding 1.5 milliliter microfuge tube. Remove a small aliquot of cells to count and pellet the remaining cells by centrifusion at 500 G at room temperature for five minutes.Count the cells during centrifugation. Take 1x sgRNA in 20 millimolar Cas9 solution and warm the tubes to room temperature. After centrifugation, remove all the supernatant from the cell pellet and resuspend the cells in PBS with calcium chloride and magnesium chloride at a concentration of 40 million cells per milliliter.For the sgRNA Cas9 ribonucleoprotein complex assembly, add 2.5 microliters of sgRNA to one microliter of the diluted Cas9 in sterilized PCR tubes and dispense the sgRNA slowly with mixing for about 15 seconds to prevent precipitation. Incubate for five minutes at room temperature to allow the ribonucleoprotein complex formation. To deliver the ribonucleoprotein complex by electroporation, prepare the electroporation tip by depressing the plunger to extend the stem.Then insert the stem into the tip. Resuspend the cells by pipetting up and down. Load the electroporation tip with the cells and withdraw the full 10 microliters volume capacity of the tip.Starting with the negative control sgRNA, transfer 10 microliters of cells in the electroporation tip to the sample tube containing 3.5 microliters of ribonucleoprotein. Pipette up and down three times to mix well, and draw 10 microliters of the mixture back into the tip. Place the tip into the electroporation station, lowering it into the buffer, and push Start on the touchscreen display.After completion, the display will indicate a successful pulse. Remove the pipette from the device and place the cells in a dry well of the uncoated 12 well plate. Rinse the tip by pipetting up and down twice in 15 milliliters of PBS with calcium chloride and magnesium chloride.Set aside the pipette with the tip still attached. Immediately add one milliliter of the antibiotic free medium aliquoted earlier to the cells and gently shake the plate to mix. The representative Sanger sequencing chromatogram of the Rosa 26 locus from the bone marrow derived macrophages electroporated with a controlled non-targeting sgRNA Cas9 ribonucleoprotein, Rosa 26 specific sgRNA, and Src and Cblb genes in the edited macrophages are shown here.The analysis of the targeted genes by PCR and Sanger sequencing shows multiple nucleotides at each position downstream of the Cas9 cleavage site. These results validate the attainment of a high editing efficiency for multiple targeted genes.