Nasze badania laboratoryjne, interakcja między prątkami gruźlicy a układem odpornościowym gospodarza, z naciskiem na początkową interakcję między bakterią a makrofagami. Istnieje wiele technik rozrywania genów stosowanych w makrofagach, w tym technologie RNAi i technologie CRISPR. Jednym z głównych wyzwań jest niska skuteczność rozrywania genów w makrofagach.
Protokół ten umożliwia szybką i wysoce efektywną manipulację genetyczną pierwotnych makrofagów bez konieczności klonowania i budowy plazmidu. Metody te powinny mieć szerokie zastosowanie w immunologii, umożliwiając naukowcom zakłócanie genów w pierwotnych makrofagach w szerokim zakresie badań. Aby rozpocząć, ustaw parametry stacji pipetowej umieszczonej w okapie o przepływie laminarnym na 1 900 woltów, 20 milisekund w jednym impulsie.
Ostrożnie wyjmij probówkę do transfekcji z opakowania, aby była sterylna i napełnij ją 3 mililitrami buforu E. Aby przygotować komórki do elektroporacji, usuń pożywkę wzrostową z komórek i umyj je za pomocą PBS w celu usunięcia surowicy i kationów dwuwartościowych, które sprzyjają adhezji. Następnie dodaj mieszaninę PBS i 1 milimolowego EDTA do komórek i inkubuj w temperaturze pokojowej przez około pięć minut, aż komórki zaczną się odłączać.
Delikatnie pipetuj w górę iw dół, aby odłączyć komórki i przenieść je do 15-mililitrowej probówki o niskiej zawartości białka. Osadzać komórki w masie 500 G przez pięć minut. Po odwirowaniu szybko usuń większość supernatantu, pozostawiając około 1 mililitra supernatantu w probówce.
Ponownie zawiesić komórki w pozostałym supernatancie i przenieść go do 1,5-mililitrowej probówki do mikrofuge o niskiej wiązalności białka. Usuń małą porcję komórek, aby policzyć i zagnieździć pozostałe komórki, wirując w temperaturze 500 G w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Policz komórki podczas wirowania.
Weź 1x sgRNA i 20 milimolowy roztwór Cas9 i ogrzej probówki do temperatury pokojowej. Po odwirowaniu usunąć cały supernatant z osadu komórkowego i ponownie zawiesić komórki w PBS z chlorkiem wapnia i chlorkiem magnezu w stężeniu 40 milionów komórek na mililitr. W przypadku złożenia kompleksu rybonukleoproteinowego sgRNA Cas9 dodaj 2,5 mikrolitra sgRNA do 1 mikrolitra rozcieńczonego Cas9 w wysterylizowanych probówkach PCR i powoli dozuj sgRNA, mieszając przez około 15 sekund, aby zapobiec wytrącaniu się.
Inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić utworzenie kompleksu rybonukleoproteinowego. Aby dostarczyć kompleks rybonukleoproteinowy za pomocą elektroporacji, przygotuj końcówkę elektroporacji, naciskając tłok, aby przedłużyć trzpień. Następnie włóż łodygę do końcówki.
Ponownie zawiesić komórki, pipetując w górę i w dół. Załaduj końcówkę elektroporacyjną ogniwami i wyjmij pełną objętość końcówki wynoszącą 10 mikrolitrów. Zaczynając od kontroli ujemnej sgRNA, przenieś 10 mikrolitrów komórek w końcówce do elektroporacji do probówki z próbką zawierającej 3,5 mikrolitra rybonukleoproteiny.
Pipetuj trzy razy w górę i w dół, aby dobrze wymieszać i nabrać 10 mikrolitrów mieszaniny z powrotem do końcówki. Umieść końcówkę w stacji elektroporacji, opuszczając ją do bufora i naciśnij Start na wyświetlaczu ekranu dotykowego. Po zakończeniu wyświetlacz wskaże udany impuls.
Wyjmij pipetę z urządzenia i umieść komórki w suchym dołku na niepowlekanej płytce 12-dołkowej. Przepłukać końcówkę, pipetując dwukrotnie w górę i w dół w 15 mililitrach PBS z chlorkiem wapnia i chlorkiem magnezu. Odłóż pipetę na bok z nadal założoną końcówką.
Natychmiast dodać 1 mililitr pożywki wolnej od antybiotyków podzielonej wcześniej na komórki i delikatnie wstrząsnąć płytką, aby wymieszać. Reprezentatywny chromatogram sekwencjonowania Sangera locus Rosa 26 z makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego poddany elektroporacji kontrolowanej, niedocelowej rybonukleoproteiny sgRNA Cas9 specyficznej dla sgRNA 26 oraz genów Src i Cblb w edytowanych makrofagach pokazano tutaj. Analiza docelowych genów za pomocą PCR i sekwencjonowania Sangera pokazuje wiele nukleotydów w każdej pozycji poniżej miejsca cięcia Cas9.
Wyniki te potwierdzają osiągnięcie wysokiej wydajności edycji dla wielu docelowych genów.
