この研究は、NIHの助成金5R01AI144149によって資金提供されました。回路図はBioRenderで作成しました。

原発性骨髄由来マクロファージにおける精密な遺伝子破壊のガイド

<ol>
	<li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+and+pathogenic+functions+of+macrophage+subsets.">Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).</li><li>Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+biology+in+development,+homeostasis,+and+disease.">Macrophage biology in development, homeostasis, and disease.</a> Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).</li><li>Paddison, P. J., Caudy, A. A., Hannon, G. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9++conditionally-immortalized+macrophages+as+a+tool+for+bacterial+pathogenesis+and+beyond.">Cas9+ conditionally-immortalized macrophages as a tool for bacterial pathogenesis and beyond.</a> eLife. 8, e45957 (2019).</li><li>Oberdoerffer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+RNA+interference+in+the+mouse+hematopoietic+system+varies+between+cell+types+and+developmental+stages.">Efficiency of RNA interference in the mouse hematopoietic system varies between cell types and developmental stages.</a> Molecular and Cellular Biology. 25 (10), 3896-3905 (2005).</li><li>Ma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YTHDF2+orchestrates+tumor-associated+macrophage+reprogramming+and+controls+antitumor+immunity+through+CD8++T+cells.">YTHDF2 orchestrates tumor-associated macrophage reprogramming and controls antitumor immunity through CD8+ T cells.</a> Nature Immunology. 24 (2), 255-266 (2023).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li><li>Cho, S. W., Kim, S., Kim, J. M., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+genome+engineering+in+human+cells+with+the+Cas9+RNA-guided+endonuclease.">Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease.</a> Nature Biotechnology. 31 (3), 230-232 (2013).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-programmed+genome+editing+in+human+cells.">RNA-programmed genome editing in human cells.</a> eLife. 2, e00471 (2013).</li><li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins.">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li><li>Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+homology-directed+human+genome+engineering+by+controlled+timing+of+CRISPR/Cas9+delivery.">Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery.</a> eLife. 3, 04766 (2014).</li><li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition.">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Research. 42 (22), e168 (2014).</li><li>Craft, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9-mediated+genome+editing+in+primary+murine+bone+marrow-derived+macrophages.">CRISPR-Cas9-mediated genome editing in primary murine bone marrow-derived macrophages.</a> University of California, Davis. , (2022).</li><li>Herb, M., Farid, A., Gluschko, A., Kr&#246;nke, M., Schramm, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+transfection+of+primary+macrophages+with+in+vitro+transcribed+mRNA.">Highly efficient transfection of primary macrophages with in vitro transcribed mRNA.</a> Journal of Visualized Experiments. (153), e60143 (2019).</li><li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+delivery+of+Cas9+protein/gRNA+complexes+using+lipofectamine+CRISPRMAX.">Improved delivery of Cas9 protein/gRNA complexes using lipofectamine CRISPRMAX.</a> Biotechnology Letters. 38 (6), 919-929 (2016).</li></ol>

著者は何も開示していません。

エレクトロポレーションCas9-sgRNA複合体を用いたゲノム編集は、BMDMの遺伝子機能を効果的に破壊することを可能にします。編集効率は、標的配列や遺伝子によって異なります。典型的には、4〜5個のsgRNAをスクリーニングして、活性の高いものを同定する。一部の遺伝子座は編集効率が低く、おそらくクロマチン構造が原因です。このような場合は、編集効率を高めるためにいくつかの変更を?...

マクロファージは、組織の修復と免疫に重要な役割を果たす自然免疫細胞です1,2。マウスRAW 264.7細胞やヒトTHP-1細胞などの不死化マクロファージ細胞株は、RNA干渉またはCRISPR/Cas9 3,4用のベクターを送達することによる、堅牢な増殖や遺伝子破壊の容易さなど、いくつかの有益な特性を持っています。しかし、発がん性形質転換はそれらの生理機能を劇的に変化させ、その結果、いくつかの経路の異常な活性化と他の経路の応答の抑制が生じます5,6。初代骨髄由来マクロファージ(BMDM)は、in vivoマクロファージの生理機能をより厳密に再現しているが、これらの初代免疫細胞におけるプラスミドトランスフェクションとウイルス形質導入の両方の効率が低いため、遺伝子操作は依然として困難である7,8。したがって、遺伝子機能を破壊するためのより効率的な方法が必要です。
CRISPR/Cas9ゲノム編集は、哺乳類細胞を含むさまざまな生物学的システムにわたる遺伝子操作のための強力なツールである9,10,11,12。化膿連鎖球菌Cas9タンパク質は、配列特異的なガイドRNAと複合体を形成すると、二本鎖DNAを効率的かつ特異的に切断します。切断されたDNAの非相同末端結合(NHEJ)によるDNA修復は、フレームシフト変異を引き起こす小さな挿入または欠失(インデル)をもたらします。初期の研究では、Cas9とsgRNAはプラスミドまたはレンチウイルスベクターを介して送達され、これらは多くの細胞株に効果的な送達方法である9,10。しかし、初代細胞、特に初代免疫細胞は、トランスフェクションまたは形質導入によるベクター送達の効率が低いため、これらの方法に抵抗性を示すことがよくあります。その後、in vitroでsgRNA-Cas9複合体を作製し、エレクトロポレーションを介して送達する方法が開発され、これらの方法はさまざまな細胞タイプで高効率を達成しています13,14。この結果は、このアプローチを用いて初代マクロファージのゲノム編集を行う可能性を示唆しています。
ここでは、sgRNA-Cas9リボ核タンパク質複合体(RNP)を使用して一次BMDMでゲノム編集を行うためのプロトコルを提供します。これには、初代免疫細胞に存在する免疫センサーの活性化を緩和する手順が含まれており、最小限の毒性で標的遺伝子座で最大95%の編集が可能です。このプロトコルには、ルーチンのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)およびサンガーシーケンシングを使用して編集効率を評価するワークフローも含まれており、その後、十分に検証されたオンラインソフトウェアツールである分解によるインデルの追跡(TIDE)15によるin silico分析が行われます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3T3-MCSF Cell Line</td>
			<td>Gift from Russell Vance</td>
			<td>not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R Cas9 Electroporation Enhancer</td>
			<td>IDT</td>
			<td>1075915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampure XP Reagent Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calf intestinal alkaline phosphatase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0525S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS +Ca/Mg (0.9mM CaCl2 and 0.5mM MgCl2)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14040-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS -Ca/Mg</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0293S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-015-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Herculase DNA polymerase &#38; buffer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>600677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2040S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LoBind conical tubes 15 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30122216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LoBind Eppendorf tubes 2 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer r2.1</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B6002S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>MPK5000, MPP100, MPS100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System 10 uL Tips</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>MPK1025 or MPK1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS + 1mM EDTA</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE02017F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EO0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rCutSmart Buffer for ExoI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B6004S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribolock</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EO0384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA loading dye</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B0363S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. pyogenes Cas9-NLS</td>
			<td>University of California Macro Lab</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>Available to non-UC investigators through&#160; https://qb3.berkeley.edu</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. pyogenes Cas9-NLS, modified 3rd Generation</td>
			<td>IDT</td>
			<td>1081059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAP</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0371S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-efficiency gene disruption in primary bone marrow-derived macrophages using electroporated cas9-sgrna complexes

マウス由来の骨髄由来マクロファージ(BMDM)は、組織マクロファージの複雑な生物学を研究するための重要なツールです。初代細胞として、不死化マクロファージ細胞株よりもin vivo でのマクロファージの生理機能を忠実にモデル化し、すでに定義された遺伝的変化を持つマウスに由来することができます。しかし、BMDMの遺伝子機能を破壊することは、依然として技術的に困難である。ここでは、遺伝子機能を破壊するフレームシフト変異をもたらす小さな挿入および欠失(インデル)の導入を可能にする、BMDMにおける効率的なCRISPR/Cas9ゲノム編集のプロトコルを提供します。プロトコルは単一ガイドRNA (sgRNA-Cas9)を総合し、electroporationによって渡すことができる浄化されたsgRNA-Cas9のribonucleoproteinの複合体(RNPs)を形作る方法を記述する。また、ルーチンのサンガーシーケンシングと無料で入手できるオンライン分析プログラムを使用して、編集効率を監視するための効率的な方法も提供します。プロトコルは1週間以内に実施でき、プラスミド構築は必要ありません。通常、85%から95%の編集効率が得られます。

Macrophages are innate immune cells that play critical roles in tissue repair and immunity1,2. Immortalized macrophage cell lines, such as mouse RAW 264.7 cells or human THP-1 cells, have several beneficial characteristics, including robust growth and ease of gene disruption by delivering vectors for RNA interference or CRISPR/Cas93,4. However, oncogenic transformation dramatically alters their physiology, which results in the aberrant activation of some pathways and muted responses of others5,6. Primary bone marrow-derived macrophages (BMDMs) more closely recapitulate in vivo macrophage physiology, but remain challenging to genetically manipulate due to the low efficiency of both plasmid transfection and viral transduction in these primary immune cells7,8. Thus, more efficient methods for disrupting gene function are needed.
CRISPR/Cas9 genome editing is a powerful tool for genetic manipulation across a range of biological systems, including mammalian cells9,10,11,12. The Streptococcus pyogenes Cas9 protein efficiently and specifically cleaves double-stranded DNA when complexed with a sequence-specific guide RNA. DNA repair through the non-homologous end joining (NHEJ) of the cleaved DNA results in small insertions or deletions (indels) that create frameshift mutations. In early studies, Cas9 and sgRNAs were delivered through plasmid or lentiviral vectors, which are effective delivery methods for many cell lines9,10. However, primary cells and, in particular, primary immune cells are often refractory to these methods due to the low efficiency of vector delivery by transfection or transduction. Subsequently, methods have been developed to generate sgRNA-Cas9 complexes in vitro and to deliver them via electroporation, and these methods have achieved high efficiency in a variety of cell types13,14. The results have suggested the possibility of using this approach to carry out genome editing in primary macrophages.
Here, we provide a protocol for using sgRNA-Cas9 ribonucleoprotein complexes (RNPs) to carry out genome editing in primary BMDMs. It contains steps to mitigate the activation of the immune sensors present in primary immune cells and results in up to 95% editing at targeted loci with minimal toxicity. This protocol also includes workflows to evaluate editing efficiency using routine polymerase chain reaction (PCR) and Sanger sequencing, followed by in silico analysis by Tracking of Indels by Decomposition (TIDE)15, a well-validated online software tool.

著者スポットライト:骨髄由来マクロファージにおける効率的なCRISPR/Cas9ゲノム編集による正確な遺伝子破壊

エレクトロポレーションCas9-sgRNA複合体を用いた初代骨髄由来マクロファージの高効率遺伝子破壊

Our laboratory studies the interaction between mycobacterium, tuberculosis and the host immune system, with a focus on the initial interaction between the bacterium and the macrophage. There's a variety of gene-disruption techniques used in macrophages, including RNAi technologies and CRISPR technologies. One of the major challenges is the low efficiency of gene disruption in macrophages.This protocol enables the rapid and high-efficiency genetic manipulation of primary macrophages without the need for cloning and plasmid construction. These methods should be broadly applicable in immunology, enabling researchers to disrupt genes in primary macrophages for a wide array of studies.

IVT テンプレートは 127 bp の PCR 産物です(図 1B)。完全長IVT産物は98 nt RNAで、70 bpの二本鎖DNA断片と同様に遊走します(図1C)。
エレクトロポレーション後、細胞は>90%生存可能であり、総細胞数は開始細胞数の>70%である必要があります。結果として生じる変異細胞のプールは、Cas9切断部位の近くから始まる多様なインデルのセット?...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Efficient CRISPR/Cas9 Genome Editing in Bone Marrow-Derived Macrophages for Precise Gene Disruption at JoVE.com

このプロトコルは生体 外で 組み立てられ、electroporationによって渡されるCas9-sgRNAのribonucleoproteinの複合体を使用してマウス骨髄得られたマクロファージのゲノム編集のためのプロシージャを記述する。

Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) from mice are a key tool for studying the complex biology of tissue macrophages. As primary cells, they model the ...

当研究室では、マイコバクテリウムと結核と宿主免疫系の相互作用について、細菌とマクロファージの初期相互作用に着目して研究しています。マクロファージには、RNAi技術やCRISPR技術など、さまざまな遺伝子破壊技術が使用されています。大きな課題の1つは、マクロファージの遺伝子破壊の効率が低いことです。このプロトコルはクローニングおよびプラスミッドの構造のための必要性なしで第一次マクロファージの急速で、高性能の遺伝の処理を可能にする。これらの方法は、免疫学に広く適用でき、研究者がさまざまな研究のために一次マクロファージの遺伝子を破壊することを可能にします。

high-efficiency-gene-disruption-primary-bone-marrow-derived

Research

JoVE Journal

Genetics

High-Efficiency Gene Disruption in Primary Bone Marrow-Derived Macrophages Using Electroporated Cas9-sgRNA Complexes

1.0K ビュー.  University of California, Davis. 当研究室では、マイコバクテリウムと結核と宿主免疫系の相互作用について、細菌とマクロファージの初期相互作用に着目して研究しています。マクロファージには、RNAi技術やCRISPR技術など、さまざまな遺伝子破壊技術が使用されています。大きな課題の1つは、マクロファージの遺伝子破壊の効率が低いことです。このプロトコルはクローニングおよびプラスミ?...