تم تصنيع صفائف الألياف النانوية في مركز علوم المواد النانوية ، وهو مكتب تابع لوزارة الطاقة لمرفق مستخدم العلوم (معرف الاقتراح: CNMS2019-103 و CNMS2022-A-1182). يتم تقديم الدعم من CNMS من خلال نظام اقتراح خاضع لمراجعة الأقران ويتم تقديمه مجانا للمتقدمين الناجحين الذين يعتزمون نشر نتائجهم (http://www.cnms.ornl.gov/user/becoming_a_user.shtml). نشكر كيفن ليستر و CNMS على المساعدة في إنتاج صفائف الألياف النانوية. نشكر الدكتور جون كوجمن والدكتور تيموثي ماكنايت والدكتور أمبر ويب وداريل بريجز وترافيس بي على المناقشات النقدية حول التصميم التجريبي. نشكر الدكتور آدم روندينون على مخطط آلة PECVD. نشكر ليزلي كارول على الرسوم التوضيحية العلمية. تم تمويل هذا العمل من قبل برنامج علوم التصوير الحيوي ، وزارة الطاقة الأمريكية ، مكتب العلوم ، البحوث البيولوجية والبيئية ، DE-SC0019104 ، ووزارة الزراعة الأمريكية ، 2021-67013-34835. تم دعم JMM من قبل وزارة الزراعة الأمريكية: المعهد الوطني للأغذية والزراعة: زمالة ما قبل الدكتوراه لمبادرة الزراعة وبحوث الأغذية 2021-67034-35167.

استخدام مصفوفات ألياف الكربون النانوية لتوصيل الجزيئات الحيوية والأصباغ بكفاءة إلى النباتات

<ol>
	<li>Canto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+expression+systems+in+plants:+potentialities+and+constraints.">Transient expression systems in plants: potentialities and constraints.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 896, 287-301 (2016).</li><li>Gou, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+protoplast+transient+expression+system+for+gene+functional+studies+in+strawberry+(Fragaria+vesca).">Optimization of the protoplast transient expression system for gene functional studies in strawberry (Fragaria vesca).</a> Plant Cell, Tissue, and Organ Culture. 141, 41-53 (2020).</li><li>Baltes, N. J., Gil-Humanes, J., Voytas, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+and+agriculture:+Opportunities+and+challenges.">Genome engineering and agriculture: Opportunities and challenges.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 149, 1-26 (2017).</li><li>Ren, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+protoplast+isolation+and+transient+expression+system+for+functional+characterization+of+flowering+related+genes+in+Cymbidium+orchids.">Highly efficient protoplast isolation and transient expression system for functional characterization of flowering related genes in Cymbidium orchids.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), 2264 (2020).</li><li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanovehicles+for+plant+modifications+towards+pest-and+disease-resistance+traits.">Nanovehicles for plant modifications towards pest-and disease-resistance traits.</a> Trends in Plant Science. 25 (2), 198-212 (2020).</li><li>Davern, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbon+nanofiber+arrays:+a+novel+tool+for+microdelivery+of+biomolecules+to+plants.">Carbon nanofiber arrays: a novel tool for microdelivery of biomolecules to plants.</a> PLoS One. 11 (4), e0153621 (2016).</li><li>Morgan, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+and+broadly+applicable+method+for+transient+transformation+of+plants+using+vertically+aligned+carbon+nanofiber+arrays.">An efficient and broadly applicable method for transient transformation of plants using vertically aligned carbon nanofiber arrays.</a> Frontiers in Plant Science. 13, 1051340 (2022).</li><li>Melechko, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertically+aligned+carbon+nanofibers+and+related+structures:+Controlled+synthesis+and+directed+assembly.">Vertically aligned carbon nanofibers and related structures: Controlled synthesis and directed assembly.</a> Journal of Physics D: Applied Physics. 97, 041301 (2005).</li><li>Melechko, A. V., Desikan, R., McKnight, T. E., Klein, K. L., Rack, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+vertically+aligned+carbon+nanofibres+for+interfacing+with+live+systems.">Synthesis of vertically aligned carbon nanofibres for interfacing with live systems.</a> Journal of Physics D: Applied Physics. 42 (19), 193001 (2009).</li><li>Nelson-Fitzpatrick, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Novel Materials for the Design of Cantilever Transducers [dissertation]. , (2011).</li><li>Fletcher, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+flexible+arrays+of+vertically+aligned+carbon+nanofiber+electrodes+to+temperature-sensitive+substrates.">Transfer of flexible arrays of vertically aligned carbon nanofiber electrodes to temperature-sensitive substrates.</a> Advanced Materials. 18 (13), 1689-1694 (2006).</li><li>Keller, S., Blagoi, G., Lillemose, M., Haefliger, D., Boisen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+thin+SU-8+films.">Processing of thin SU-8 films.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 18 (12), 125020 (2008).</li><li>Wouters, K., Puers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusing+and+swelling+in+SU-8:+insight+in+material+properties+and+processing.">Diffusing and swelling in SU-8: insight in material properties and processing.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 20 (9), 095013 (2010).</li><li>Jamal, M., Zarafshar, A. M., Gracias, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentially+photo-crosslinked+polymers+enable+self-assembling+microfluidics.">Differentially photo-crosslinked polymers enable self-assembling microfluidics.</a> Nature Communications. 2, 527 (2011).</li><li>Williams, R., Goodman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wetting+of+thin+layers+of+SiO2+by+water.">Wetting of thin layers of SiO2 by water.</a> Applied Physics Letters. 25 (10), 531-532 (1974).</li><li>Kundu, A., Nogueira Campos, M. G., Santra, S., Rajaraman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+vascular+delivery+of+agrochemicals+with+micromilled+microneedles+(&#181;MMNs).">Precision vascular delivery of agrochemicals with micromilled microneedles (&#181;MMNs).</a> Scientific Reports. 9, 14008 (2019).</li><li>Acanda, Y., Welker, S., Orbovi&#263;, V., Levy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+efficient+agroinfiltration+method+for+transient+gene+expression+in+Citrus.">A simple and efficient agroinfiltration method for transient gene expression in Citrus.</a> Plant Cell Reports. 40 (7), 1171-1179 (2021).</li><li>Pearce, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+properties+of+SiNx+coatings+as+stable+fluorescent+markers+on+vertically+aligned+carbon+nanofibers.">Synthesis and properties of SiNx coatings as stable fluorescent markers on vertically aligned carbon nanofibers.</a> AIMS Materials Science. 1 (2), 87-102 (2014).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Crafts, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+in+plants.">Translocation in plants.</a> Plant Physiology. 13 (4), 791 (1938).</li><li>Martens, H. J., Hansen, M., Schulz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caged+probes:+a+novel+tool+in+studying+symplasmic+transport+in+plant+tissues.">Caged probes: a novel tool in studying symplasmic transport in plant tissues.</a> Protoplasma. 223, 63-66 (2004).</li><li>Liu, J., Essner, J., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+supercapacitor+based+on+coaxially+coated+manganese+oxide+on+vertically+aligned+carbon+nanofiber+arrays.">Hybrid supercapacitor based on coaxially coated manganese oxide on vertically aligned carbon nanofiber arrays.</a> Chemistry of Materials. 22 (17), 5022-5030 (2010).</li><li>Saleem, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+temperature+and+cost-effective+growth+of+vertically+aligned+carbon+nanofibers+using+spin-coated+polymer-stabilized+palladium+nanocatalysts.">Low temperature and cost-effective growth of vertically aligned carbon nanofibers using spin-coated polymer-stabilized palladium nanocatalysts.</a> Science and Technology of Advanced Materials. 16, 015007 (2015).</li><li>Merkulov, V. I., Lowndes, D. H., Wei, Y. Y., Eres, G., Voelkl, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+growth+of+individual+and+multiple+vertically+aligned+carbon+nanofibers.">Patterned growth of individual and multiple vertically aligned carbon nanofibers.</a> Applied Physics Letters. 76 (24), 3555-3557 (2000).</li><li>Retterer, S. T., Melechko, A., Hensley, D. K., Simpson, M. L., Doktycz, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positional+control+of+catalyst+nanoparticles+for+the+synthesis+of+high+density+carbon+nanofiber+arrays.">Positional control of catalyst nanoparticles for the synthesis of high density carbon nanofiber arrays.</a> Carbon. 46 (11), 1378-1383 (2008).</li><li>Rooks, M. J., Wind, S., McEuen, P., Prober, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+30-nm-scale+structures+for+electron+transport+studies+using+a+polymethylmethacrylate+bilayer+resist.">Fabrication of 30-nm-scale structures for electron transport studies using a polymethylmethacrylate bilayer resist.</a> Journal of Vacuum Science &amp; Technology B: Microelectronics Processing and Phenomena. 5 (1), 318-321 (1987).</li><li>Lee, G., Sohn, D. K., Seok, S. H., Ko, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+hole+density+variation+in+the+PECVD+reactor+showerhead+on+the+deposition+of+amorphous+carbon+layer.">The effect of hole density variation in the PECVD reactor showerhead on the deposition of amorphous carbon layer.</a> Vacuum. 163, 37-44 (2019).</li><li>Fowlkes, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+catalyst+particle+crystallographic+orientation+in+vertically+aligned+carbon+nanofiber+synthesis.">Control of catalyst particle crystallographic orientation in vertically aligned carbon nanofiber synthesis.</a> Carbon. 44 (8), 1503-1510 (2006).</li></ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

في هذه الورقة ، قدمنا طرقا لبناء صفائف ألياف الكربون النانوية المحاذاة رأسيا ، ونقل الألياف إلى ركيزة مرنة ، وتطبيق الألياف إما في ركيزة صلبة أو مرنة على النباتات لاستخدامها في توصيل الجزيئات الحيوية أو الأصباغ إلى النباتات. وصفنا طريقتين عامتين ، الطريقة على الرقاقة والطريقة على النبات ، لترسب المواد المدخلة وأظهرنا نتائج ناجحة في الألياف على ركيزة صلبة بالإضافة إلى طريقة الرقاقة باستخدام أفلام VACNF. تطبيق هذه الألياف أبسط في الممارسة والنظرية من طرق تحويل النبات التقليدية (قصف الجسيمات ، تحويل البروتوبلاست عن طريق PEG أو التثقيب الكهربائي) ويمكن استخدامها للنباتات المتمردة على التحول بوساطة Agrobacterium. ومع ذلك ، يتم تحويل عدد قليل من الخلايا فقط.
تم إنتاج ألياف الكربون النانوية المحاذاة رأسيا في مركز مختبر أوك ريدج الوطني لعلوم المواد النانوية من خلال برنامج المستخدم الخاص بهم. يمكن للمستخدمين التقدم بطلب لاستخدام هذا المرفق لإنتاج VACNFs. بدلا من ذلك ، يمكن إنتاج رقائق VACNF في غرف نظيفة مع آلات ترسيب البخار الكيميائي المحسنة بالبلازما بالتيار المباشر مع مصدر كربون22,23. مع الطرق الموصوفة ، هناك بعض الخطوات التي تعتبر حاسمة لإنتاج الألياف ونقل الألياف وتطبيق رقائق / أفلام VACNF. لكي يعمل تطبيق الألياف ، يجب أن تكون الألياف مستقيمة ولها قطر مستدق يبلغ <200 نانومتر عند الطرف للتسليم في الخلايا النباتية لتكون ناجحة 6,7 (الشكل 3). لإنشاء ألياف نانوية كربونية ذات حجم ودرجة معينة ، هناك مجموعة متنوعة من المعلمات التي يمكن تغييرها ، بما في ذلك حجم النقطة ، والملعب الجانبي ، وكمية المحفز المودعة. لتحديد حجم النقطة الأمثل لاستخدامه في إنتاج ألياف الكربون النانوية ، تمت زراعة الألياف من أحجام نقطية مختلفة (كما هو موضح في الشكل 5). وجدنا أن أقطار 300 نانومتر أنتجت أفضل الألياف ، ومن ثم تم اختيار حجم النقطة هذا (الشكل 5). بعد العثور على المعلمات الصحيحة ، تطلعنا إلى استخدام الرقائق التي تحتوي على >50٪ من الألياف ذات الهندسة المثالية (مستقيم وقطر طرف <200 نانومتر). للتحقق من هندسة الألياف ، استخدمنا المجهر الإلكتروني الماسح لتصوير مجالات الرؤية العشوائية على عينة من رقائق / أفلام VACNF.
بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن يكون للألياف حد أدنى معين للطول لتحقيق التسليم داخل الخلايا النباتية. تكمن أهمية إنتاج ألياف ذات أطوال مختلفة في أنه يمكن استخدام ألياف أطول لاختراق طبقات الأنسجة العميقة. تعتبر الألياف الأطول (>40 ميكرومتر في الطول) ضرورية للأغشية المرنة حيث يعمل نقل الألياف عن طريق كسر الألياف من قاعدتها ويتطلب وضع طبقات SU-8 فوق الألياف. سمك العمل لطبقة SU-8 المستخدمة لهذا البروتوكول هو 20-35 ميكرومتر. الحد الأدنى للارتفاع اللازم لإنجاز التسليم داخل البشرة من النباتات المختلفة (منحنية أو مسطحة) هو 10-15 ميكرومتر 6,7. نتيجة لذلك ، فإن الألياف ذات الأطوال >40 ميكرومتر ضرورية لأفلام VACNF. هناك العديد من المعلمات المختلفة التي يجب مراعاتها عند إنتاج ألياف الكربون النانوية: مادة المحفز ، وهندسة المحفز ، وسمك مادة المحفز بالإضافة إلى الظروف داخل غرفة PECVD (نسبة الغاز ، والضغط ، ودرجة الحرارة ، والتيار ، وارتفاع رأس الدش ، ووقت النمو) 8،9،24،25. لإنتاج ألياف الكربون النانوية أطول من 25 ميكرومتر المستخدمة من قبل Morgan et al.7 و Davern et al.6 ، قمنا بزيادة كمية محفز Ni ، وقمنا بتغيير نسبة الأسيتيلين : الأمونيا ، وزدنا التيار ووقت النمو. بالإضافة إلى ذلك، أولينا المزيد من الاهتمام لهندسة المادة الحفازة. لإنتاج ألياف مستقيمة طويلة ، يجب أن يكون للمحفز المترسب شكل عفريت هوكي بدلا من شكل يشبه البركان (الشكل 4). تنشأ هياكل البركان من بقايا مقاومة الضوء بعد الإقلاع. لمنع تكوين البراكين ، تم استخدام طبقة مزدوجة من PMMA لإنشاء تقويض أثناء الطباعة الحجرية لحزمة الإلكترون26. يساعد التقويض في رفع المحفز المعدني المترسب (الشكل 2). الطبقة السميكة من المحفز مهمة لنمو VACNFs الطويلة. تم فحص مورفولوجيا VACNFs بواسطة Merkulova et al.24. ترجع المحاذاة الرأسية ل VACNFs إلى كل من نمو طرف محفز Ni ومحاذاة جهد DC عموديا على الركيزة (الشكل 6). يصف رأس الدش هندسة مفاعل PECVD (الشكل 6) ويعمل كمصدر لإمكانات المجال الكهربائي27.
لتحديد مجموعة النقاط الحفازة باستخدام الطباعة الحجرية لحزمة الإلكترون ، قمنا بتطبيق مقاومة شعاع الإلكترون (polymethyl methacrylate) ، ثم استخدمنا الحزمة الإلكترونية لعمل ثقوب صغيرة في المقاومة بشكل معين وفي مواقع محددة على الرقاقة. تم وضع ثقوب بالقطر المطلوب على شبكة منتظمة مع التباعد المحدد (الملعب) وتم تحميل ملف يحدد النمط المطلوب في أداة الطباعة الحجرية لحزمة الإلكترون قبل تحميل الركيزة في الجهاز. بالإضافة إلى ارتفاع الألياف ، هناك معلمة مهمة أخرى لنقل الألياف بنجاح وهي مقدار الوقت الذي يقضيه في حمام الأسيتون. يجب ترك أفلام VACNF في حمام الأسيتون لفترة كافية بحيث تبدأ حوافها في التجعد ؛ إذا تركت في حمام الأسيتون لفترة قصيرة جدا ، فمن الصعب رفع الرقائق وقد تنكسر. كلما كانت الرقائق أقدم ، كلما طالت مدة بقائها في حمام الأسيتون. بعد حمام الأسيتون ، تم وضع الأفلام / الرقائق في الأيزوبروبانول والماء لإزالة الأسيتون الوصول وكذلك لإزالة مقاومة الضوء الواقية على الألياف.
لأداء طلاء الدوران ، يتم وضع الرقائق أو قطع الويفر على ظرف فراغ في طلاء الدوران ، ويتم التحقق من الموضع المركزي للرقاقة باستخدام وظيفة الاختبار الخاصة بطلاء الدوران. يتم تطبيق بركة صغيرة (~ 2.5 سم في القطر) من المقاومة على مركز الرقاقة ونسج (3000 دورة في الدقيقة لمدة 45 ثانية) يتم تضمين صور الألياف قبل وبعد طلاء الدوران في الشكل 8 الذي يوضح الحفاظ على هندسة الألياف (الارتفاع والاتجاه ودرجة الصوت). يؤدي وجود الألياف إلى مقاومة جيدة في قاعدة الألياف وينتج عنها طبقات أكثر سمكا من المتوقع. تم استكشاف الطلاء الدوار بعد نمو VACNF من قبل مجموعات أخرى11,18.
خطوة أخرى في العملية ذات أهمية حيوية هي ضمان تطبيق القدر المناسب من القوة على رقائق / أفلام VACNF. تعتمد آلية التوصيل على الألياف التي تصنع ثقوبا صغيرة في جدران الخلايا عبر القوة الدافعة للملقط الذي ينقر على ركائز صلبة 6,7 أو يتدحرج باستخدام قضيب المكياج الصغير على ركائز مرنة. قد تنفصل الألياف أو لا تنفصل وتظل مضمنة في الخلايا النباتية 6,7 دون التأثير على النتيجة ، ولكن الممارسة جنبا إلى جنب مع فحص امتصاص الصبغة وتلف الأنسجة ضرورية للحصول على الضغط الصحيح. بالإضافة إلى ذلك ، من المهم اختيار نقاط زمنية مناسبة للتصوير بعد تسليم الحمض النووي باستخدام رقائق / أفلام VACNF حيث يختلف وقت التعبير القابل للكشف بين الأنواع النباتية وأنواع النواقل التي يتم تسليمها7 (الشكل 16).
على الرغم من أن هذه الطريقة قابلة للتطبيق على نطاق واسع على النباتات ، إلا أن لها بعض القيود. على سبيل المثال ، لا تؤدي إضافة طبقة رقيقة من أكسيد السيليكون إلى أفلام VACNF دائما إلى أن تكون الأفلام محبة للماء تماما بسبب الطبقة الواقية من مقاومة الضوء المضافة أعلى SU-8. إذا تحققت هذه المشكلة ، يمكن تطبيق طبقات أكثر سمكا من أكسيد السيليكون على VACNFs. لاختبار ما إذا كانت الأفلام كارهة للماء أو محبة للماء ، يمكن وضعها في الماء. إذا غرقت الأفلام ، فهي محبة للماء ، وإذا طفت ، فهي كارهة للماء. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يكون هناك اختلاف بين دفعات الألياف المنتجة. هناك العديد من المعلمات التي يمكن تغييرها عند زراعة الألياف في آلة dc -PECVD ؛ ما هو موضح في هذا البروتوكول هو مجموعة من المعلمات لكميتين مختلفتين من محفز النيني. بالإضافة إلى ذلك ، لا يمكن التحكم في الاتجاه البلوري لمحفز Ni28 وستؤدي بعض التفرعات حتما إلى الألياف.
بينما أظهرنا توصيل صبغة الفلوريسئين والحمض النووي إلى الخلايا النباتية باستخدام ركائز صلبة ومرنة لهذه الورقة ، يجب أن تكون الطريقة قابلة للتطبيق على نطاق واسع على الجزيئات الحيوية الأخرى ونهج التعديل الوراثي ، على سبيل المثال ، إسكات RNAi للأنظمة النباتية مثل التفاح أو الفواكه الأخرى حيث يستغرق الأمر سنوات لإنتاج خطوط معدلة وراثيا مستقرة. علاوة على ذلك ، يمكن أيضا استخدام هذه الألياف لتقديم مواد التحرير الجيني أو للتحولات المستقرة في النباتات.

لم يصبح التحول النباتي (العابر والمستقر) قابلا للتحقيق على نطاق واسع في جميع الأنسجة والأنواع النباتية. التحول العابر للنباتات هو عملية يتم من خلالها إدخال الجينات المشفرة في البلازميدات مؤقتا في النباتات ولكن لا يتم دمجها بشكل ثابت في الجينوم. الطرق التقليدية التي تستخدم قصف الجسيمات أو البكتيريا الزراعية أو التثقيب الكهربائي أو معالجة البولي إيثيلين جلايكول للبروتوبلاستيدات بطيئة أو يمكن أن تكون مرهقة. علاوة على ذلك ، فهي لا تنطبق على كل أنواع النباتات1،2،3،4. يعد استخدام المواد النانوية لتوصيل الحمض النووي مجالا مزدهرا لا يزال في مهده5. كما تم استخدام المواد النانوية ، وتحديدا ألياف الكربون النانوية بنجاح لتوصيل البروتينات والديكسترانس والأصباغ إلى أوراق النبات دون التسبب في استجابة الجرح6. الهدف من هذا العمل هو توفير بروتوكول مفصل لاستخدام نوع واحد من المواد النانوية ، ألياف الكربون النانوية ، لتوصيل الجزيئات الحيوية أو الأصباغ إلى النباتات. نركز هنا على الحمض النووي باعتباره الجزيء الحيوي المفضل، والذي يسمح بالتحول العابر للخلايا في مختلف أعضاء النبات.
في السابق ، أظهر Morgan et al.7 استخدام ألياف الكربون النانوية الملصقة على ركيزة السيليكون الصلبة لتحويل أوراق الخس ، N. benthamiana ، والحور ، وأوراق وجذور Arabidopsis. على الرغم من أن التحولات كانت ناجحة على مجموعة متنوعة من الأعضاء ، إلا أن الألياف كانت أكثر صعوبة في تطبيقها على الأنسجة النباتية ذات الأسطح المنحنية ، مثل الجذور أو الفاكهة. لقد فكرنا في أن الدعم المرن للألياف النانوية قد يحسن كفاءة توصيلها من خلال التوافق بشكل أفضل مع شكل العضو.
هنا ، نقوم بتفصيل الطرق المستخدمة لتصنيع وتصميم ألياف الكربون النانوية المحاذية رأسيا ، ونقل VACNFs إلى ركائز مرنة ، وتطبيق VACNFs على كل من الركائز الصلبة والمرنة للنباتات لتوصيل الجزيئات الحيوية والأصباغ. تم إنتاج ألياف الكربون النانوية باستخدام ترسيب البخار الكيميائي المعزز بالبلازما التحفيزية بالتيار المباشر (dc C-PECVD) مع محفز Ni. تم التحكم في موضع وقطر وارتفاع نقاط محفز Ni باستخدام مزيج من الطباعة الحجرية لحزمة الإلكترون ، وتبخر المعادن ، وعمليات الرفع كما وصفها Melechko et al.8,9. باستخدام مقاومة شعاع إلكتروني مزدوج الطبقة ، يمكن ترسيب محفز Ni أكثر سمكا على الركيزة لإعطاء ألياف أطول10. يعتمد نقل الألياف من الركيزة الصلبة إلى الركيزة المرنة على تعديل الطرق الموضحة في Fletcher et al.11 ، مع الطرق الحالية التي تتخلى عن استخدام طبقة كربون غير متبلورة أو طبقة مقاومة للضوء قربانية. يتم تحقيق رفع SU-8 مع نقل الألياف من خلال الاستفادة من إجهاد الشد الجوهري الناتج عن نقص الخبز والتعرض السفلي ل SU-812،13،14. SU-8 ، بوليمر معقد ، كاره للماء بشكل طبيعي ، مما يجعل استخدامه لتسهيل توصيل الحمض النووي أمرا صعبا. لمواجهة الطبيعة الكارهة للماء ل SU-8 ، نقوم بتطبيق طبقة رقيقة من أكسيد السيليكون عن طريق ترسيب الطبقة الذرية15 بعد تضمين الألياف في SU-8. يستخدم تطبيق الألياف على ركيزة صلبة لتوصيل الجزيئات الحيوية / الصبغة قوة تأثير نقر الملقط الموصوف في Davern et al.6 والطرق على النبات وعلى الرقاقة الموصوفة في Morgan et al.7. يتم تطبيق أفلام VACNF المرنة على أسطح النباتات المنحنية عن طريق تجفيف الحمض النووي أو قطرات الصبغة على الفيلم كما هو الحال مع طريقة الرقاقة من Morgan et al.7ثم لف الأفلام على أسطح النباتات المنحنية باستخدام قضيب مكياج صغير16,17. يوضح الشكل 1 طرقا مختلفة لتطبيق الألياف في ركائز صلبة ومرنة على النباتات.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>13&#34; x 13&#34; White 1/4-fold heavy duty Brawny industrial shop towel 70Ct</td>
			<td>Fastenal&#160;</td>
			<td>690535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol (IPA)&#160;</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A451-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#34; Lid</td>
			<td>Entegris</td>
			<td>H22-401-0615</td>
			<td>Wafer Carriers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#34; tray</td>
			<td>Entegris</td>
			<td>H22-40-0615</td>
			<td>Wafer Carriers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accretech SS10 dicing saw</td>
			<td>Accreteck</td>
			<td>SS10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A18-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone used in the cleanroom at ORNL</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>9005-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apples</td>
			<td>Grocery store</td>
			<td>No product number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabidopsis thaliana&#160;</td>
			<td>Seeds of accession Columbia from the laboratory of Professor Jean Greenberg at the University of Chicago</td>
			<td>No product number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon direct current plasma enhanced chemical vapor deposition machine</td>
			<td>Oak Ridge National Laboratory&#160;</td>
			<td>Custom-built</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobham Green lettuce&#160;</td>
			<td>Seeds from the laboratory of Professor Richard Michelmore at the University of California, Davis</td>
			<td>No product number</td>
			<td>Butterhead lettuce</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein dye</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2456-2.5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel-box&#160;</td>
			<td>Gel-Pak</td>
			<td>&#160;AD-23C-00-X4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heidelberg DWL 66 direct-write lithography tool&#160;</td>
			<td>Heidelberg</td>
			<td>DWL 66</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institues of Health&#160;</td>
			<td>No product number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoproponal (IPA) used in the cleanroom at ORNL</td>
			<td>Doe and Ingalls</td>
			<td>CMOS Grade 9079-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEOL 9300FS 100kV electron beam lithography system</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>8100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional 34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kord-Valmark disposable polystyrene petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>11019-554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Layout Editor&#160;</td>
			<td>&#160;juspertor GmbH</td>
			<td>No product number&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 710 confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>No product number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 800 confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>No product number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Make-up applicator&#160;</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>G2PLUS</td>
			<td>500 PCS Disposable Micro Applicators Brush for Makeup and Personal Care (Head Diameter: 1.5 mm)- 5 x 100 PCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Merlin field emission scanning electron microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Merlin</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIBK/IPA&#160; (methyl isobutyl ketone/isopropanol) (1:3)</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>M089025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Onions</td>
			<td>Grocery store</td>
			<td>No product number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxford FlexAl atomic layer deposition</td>
			<td>Oxford</td>
			<td>FlexAl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMMA 495 A4</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>M130004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMMA 950 A4</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>M230004</td>
			<td>Can dilute down to A2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene terephthalate (PET)</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>KS-6304-21-11</td>
			<td>Type D Clear PET (Polyester) Sheet .0005&#34; Thick x 27&#34; Width x 10 Ft Length 1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision tweezers</td>
			<td>Aven Inc.&#160;</td>
			<td>18032TT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pUBQ10:YFP-GW</td>
			<td>Arabidopsis Biological Resource Center</td>
			<td>CD3-1948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon etcher (used for descum)&#160;</td>
			<td>Oxford</td>
			<td>Plasmalab</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon rubber kit</td>
			<td>Smooth-On Inc</td>
			<td>Ecoflex 00-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafers</td>
			<td>Pure Wafer</td>
			<td>4N0.001-.005SSP-INV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>Brewer Sciences</td>
			<td>Model 100CB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPR 955cm 0.7&#160;</td>
			<td>Megaposit</td>
			<td>10018314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strawberries</td>
			<td>Grocery store</td>
			<td>No product number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2015</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>SU-8 2000 Series</td>
			<td>Toxic. Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>SU-8 2000 Series</td>
			<td>Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suss MicroTec contact aligner</td>
			<td>Suss MicroTec</td>
			<td>MA6/BA6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top microscope</td>
			<td>Phenom XL</td>
			<td>used for checking Ni catalysts after metal deposition</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermionics VE-240 e-beam evaporator</td>
			<td>Thermionics</td>
			<td>VE-240</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using vertically aligned carbon nanofiber arrays on rigid or flexible substrates for delivery of biomolecules and dyes to plants

يمثل توصيل الجزيئات الحيوية والأصباغ غير المنفذة للنباتات السليمة تحديا كبيرا. المواد النانوية هي أدوات صاعدة لتوصيل الحمض النووي إلى النباتات. على الرغم من إثارة هذه الأدوات الجديدة ، إلا أنها لم يتم تطبيقها على نطاق واسع بعد. من الصعب بشكل خاص تطبيق المواد النانوية المصنعة على ركيزة صلبة (دعامة) بنجاح على هياكل النباتات المنحنية. تصف هذه الدراسة عملية التصنيع الدقيق لمصفوفات ألياف الكربون النانوية المحاذية رأسيا ونقلها من ركيزة صلبة إلى ركيزة مرنة. نحن نوضح بالتفصيل ونوضح كيف يمكن استخدام هذه الألياف (على ركائز صلبة أو مرنة) للتحويل العابر أو الصبغة (على سبيل المثال ، الفلوريسين) إلى النباتات. نوضح كيف يمكن نقل VACNFs من ركيزة السيليكون الصلبة إلى ركيزة مرنة من الإيبوكسي SU-8 لتشكيل صفائف VACNF مرنة. للتغلب على الطبيعة الكارهة للماء ل SU-8 ، تم طلاء الألياف الموجودة في الفيلم المرن بطبقة رقيقة من أكسيد السيليكون (2-3 نانومتر). لاستخدام هذه الألياف لتسليمها إلى أعضاء النبات المنحنية ، نقوم بإيداع قطرة 1 ميكرولتر من الصبغة أو محلول الحمض النووي على جانب الألياف من أفلام VACNF ، وننتظر 10 دقائق ، ونضع الأفلام على العضو النباتي ونستخدم مسحة بحركة متدحرجة لدفع الألياف إلى الخلايا النباتية. باستخدام هذه الطريقة ، حققنا توصيل الصبغة والحمض النووي في أعضاء النبات ذات الأسطح المنحنية.

Plant transformation (both transient and stable) has yet to become widely achievable in all plant tissues and species. The transient transformation of plants is a process by which genes encoded in plasmids are temporarily introduced into plants but are not stably incorporated into the genome. Traditional methods that use particle bombardment, Agrobacteria, electroporation, or polyethylene glycol treatment of protoplasts are slow or can be cumbersome. Furthermore, they are not applicable to every plant species1,2,3,4.&#160;The use of nanomaterials for DNA delivery is a burgeoning field that is still in its infancy5. Nanomaterials, specifically carbon nanofibers have also successfully been used to deliver proteins, dextrans and dyes to plant leaves without causing wound response6. The goal of this work is to provide a detailed protocol for using one type of nanomaterial, carbon nanofibers, for delivering biomolecules or dyes to plants. Here, we focus on DNA as the biomolecule of choice, which permits the transient transformation of cells in various plant organs.
Previously, Morgan et al.7 demonstrated the use of carbon nanofibers affixed to rigid silicon substrate to transiently transform leaves of lettuce, N. benthamiana, and poplar, and both leaves and roots of Arabidopsis. Although transformations were successful on a variety of organs, fibers were more difficult to apply to plant tissues with curved surfaces, such as roots or fruits. We reasoned that a flexible backing for nanofibers might improve their efficiency of delivery by conforming better to the shape of the organ.
Herein, we detail methods utilized for fabricating and designing vertically aligned carbon nanofibers, transferring VACNFs to flexible substrates, and applying VACNFs on both rigid and flexible substrates to plants to deliver biomolecules and dyes. Carbon nanofibers were produced using direct current catalytic plasma-enhanced chemical vapor deposition (dc C-PECVD) with Ni catalyst. The position, diameter, and height of Ni catalyst dots were controlled using a combination of electron beam lithography, metal evaporation, and lift-off processes as described by Melechko et al.8,9. Using a double-layer e-beam resist, a thicker Ni catalyst can be deposited on the substrate to give longer fibers10. Fiber transfer from a rigid to a flexible substrate is based on a modification of methods described in Fletcher et al.11, with the current methods foregoing the use of an amorphous carbon layer or a sacrificial photoresist layer. SU-8 lift-off with fiber transfer is achieved by utilizing the intrinsic tensile stress resulting from underbaking and underexposing the SU-812,13,14. SU-8, a complex polymer, is naturally hydrophobic, which makes its use for facilitating DNA delivery difficult. To counteract the hydrophobic nature of SU-8, we apply a thin layer of silicon oxide via atomic layer deposition15 after fibers are embedded in SU-8. Application of fibers on a rigid substrate for biomolecule/dye delivery utilizes the impact force of tweezer tapping described in Davern et al.6 and the on-plant and on-chip methods described in Morgan et al.7. Flexible VACNF films are applied to curved plant surfaces by first semidrying DNA or dye droplets on the film as with the on-chip method from Morgan et al.7and then rolling the films on curved plant surfaces using a small makeup applicator16,17. Figure 1 depicts various approaches for applying fibers in rigid and flexible substrates to plants.

تسليط الضوء على المؤلف: إطلاق العنان لتحويل النبات من خلال الابتكار باستخدام مصفوفات ألياف الكربون النانوية 

استخدام صفائف ألياف الكربون النانوية المحاذية رأسيا على ركائز صلبة أو مرنة لتوصيل الجزيئات الحيوية والأصباغ إلى النباتات

We are trying to demonstrate a general method for delivery of dye or DNA into plants using carbon nanofiber arrays. Many plants are recalcitrant to traditional transformation methods. Our method can solve this problem using carbon nanofiber arrays on flexible rigid substrates.Our technique is fast and user-friendly. It can be applied to virtually any plant species or plant organ. It can also be used to deliver other reagents such as dyes and proteins.

Watch this Scientific Journal Video about Unlocking Plant Transformation by Innovating with Carbon Nanofiber Arrays at JoVE.com

نصف هنا طرق التصنيع الدقيق للألياف النانوية الكربونية المحاذية رأسيا (VACNFs) ، ونقل VACNFs إلى ركائز مرنة ، وتطبيق VACNFs على كل من الركائز الصلبة والمرنة على النباتات لتوصيل الجزيئات الحيوية والصبغة.

The delivery of biomolecules and impermeable dyes to intact plants is a major challenge. Nanomaterials are up-and-coming tools for the delivery of DNA to ...

نحن نحاول توضيح طريقة عامة لتوصيل الصبغة أو الحمض النووي إلى النباتات باستخدام صفائف ألياف الكربون النانوية. العديد من النباتات متمردة على طرق التحول التقليدية. يمكن لطريقتنا حل هذه المشكلة باستخدام صفائف ألياف الكربون النانوية على ركائز صلبة مرنة.تقنيتنا سريعة وسهلة الاستخدام. يمكن تطبيقه على أي نوع نباتي أو عضو نباتي تقريبا. يمكن استخدامه أيضا لتوصيل الكواشف الأخرى مثل الأصباغ والبروتينات.

using-vertically-aligned-carbon-nanofiber-arrays-on-rigid-or-flexible

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Using Vertically Aligned Carbon Nanofiber Arrays on Rigid or Flexible Substrates for Delivery of Biomolecules and Dyes to Plants

927 Views.  The University of Chicago. نحن نحاول توضيح طريقة عامة لتوصيل الصبغة أو الحمض النووي إلى النباتات باستخدام صفائف ألياف الكربون النانوية. العديد من النباتات متمردة على طرق التحول التقليدية. يمكن لطريقتنا حل هذه المشكلة باستخدام صفائف ألياف الكربون النانوية على ركائز صلبة مرنة.تقنيتنا سريعة وسهل?...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: إطلاق العنان لتحويل النبات من خلال الابتكار باستخدام مصفوفات ألياف الكربون النانوية 

The delivery of biomolecules and impermeable dyes to intact plants is a major challenge. Nanomaterials are up-and-coming tools for the delivery of DNA to plants. As exciting as these new tools are, they have yet to be widely applied. Nanomaterials fabricated on rigid substrate (backing) are particularly difficult to successfully apply to curved plant structures. This study describes the process for microfabricating vertically aligned carbon nanofiber arrays and transferring them from a rigid to a flexible substrate. We detail and demonstrate how these fibers (on either rigid or flexible substrates) can be used for transient transformation or dye (e.g., fluorescein) delivery to plants. We show how VACNFs can be transferred from rigid silicon substrate to a flexible SU-8 epoxy substrate to form flexible VACNF arrays. To overcome the hydrophobic nature of SU-8, fibers in the flexible film were coated with a thin silicon oxide layer (2-3 nm). To use these fibers for delivery to curved plant organs, we deposit a 1 &#181;L droplet of dye or DNA solution on the fiber side of VACNF films, wait 10 min, place the films on the plant organ and employ a swab with a rolling motion to drive fibers into plant cells. With this method, we have achieved dye and DNA delivery in plant organs with curved surfaces.

Here we describe methods for microfabricating vertically aligned carbon nanofibers (VACNFs), transferring VACNFs to flexible substrates, and applying VACNFs on both rigid and flexible substrates to plants for biomolecule and dye delivery.

On-Chip Method to Deliver Dye or Biomolecules to Plants Using VACNFs in a Flexible Substrate

Begin by preparing vertically aligned carbon nano fibers, or VACNFs. To transfer the VACNFs to a flexible substrate, first place the individual chips in acetone to separate the flexible substrate from the rigid substrate. Then, wash SU-8 films with IPA for five minutes, followed by washing with water for five minutes.Place the chips in a commercial box with a sticky pad when transporting them. Prepare a silicone rubber PET holder by mixing the elaststomer and the crosslinker from a two-part kit. Cut out a square of PET and tape it down in a clear plastic dish.Then, pour a very thin film of silicone rubber on top of the PET and cure it at 80 degrees Celsius for one to two hours. Transfer the SU-8 film to the PET holder using a pair of tweezers, and place the fiberless side of the SU-8 film on the silicone rubber. Press on the edges of the SU-8 square to help it stick to the silicone rubber PET and avoid breaking off fibers.Then, place a one microliter droplet of dye onto the fiber side of the SU-8 film and let it dry for 10 minutes. After drying, place the VACNF film onto the plant surface using a pair of sharp tweezers. Then, gently roll a small makeup applicator over the VACNF film.Mark the areas where the flexible substrates are placed with a soft tipped marker. Then remove the flexible substrates from the plant surface using tape. Repeat VACNF application for controls, such as placing dye on the fiberless side of a film, using the film without dye, and using the fiberless side of a film.The on-chip method was used to deliver fluorescein dye to curved surfaces, such as strawberries, in which a strong fluorescein signal was observed immediately. Whereas in apples, a strong fluorescein signal was seen after two hours of delivery. Similarly, delivery of a plasmid containing yellow fluorescent protein was achieved in apples.Also, a successful transient transformation of onions was done by delivering the plasmid containing yellow fluorescent protein using VACNF films.

طريقة على الرقاقة لتوصيل الصبغة أو الجزيئات الحيوية إلى النباتات باستخدام VACNFs في ركيزة مرنة

On-Plant Method to Deliver Dye or Biomolecules Using VACNFs in a Rigid Substrate

To begin, remove the photo resist from the VACNFs by washing with 100%acetone for five minutes, followed by a five minute wash with 100%IPA, and then double distilled water for five minutes. Then, place the plant tissue to be impaled on a hard surface for support. Place a one microliter droplet of dye onto the surface of the plant tissue.Place a VACNF chip with a rigid substrate down the top of the droplet, with the fibers oriented such that they will come into contact with the droplet. Using the flat side of a pair of tweezers, tap the chip, mark the area of the plant that the chip came into contact with using a soft tipped marker. Remove the VACNF chips after delivery.Repeat these steps for controls, such as placing dye on the fiberless side of a film, using the film without dye, and using the fiberless side of a film. Store intact plants or excised plant organs in humid chambers in long day conditions. For excised organs, use a plastic Petri dish with wet paper towels.Using this method, fluorescein dye was delivered to Arabidopsis leaves. Images taken at different time points, showed that the fluorescein dye was observed immediately after delivery. Similarly, delivery of a plasmid containing yellow fluorescent protein was achieved in Arabidopsis leaves.