מערכי ננו-סיבים יוצרו במרכז למדעי החומרים הננופאזיים, שהוא מתקן משתמש של משרד האנרגיה של המדע (מזהה הצעה: CNMS2019-103 ו-CNMS2022-A-1182). תמיכה מ- CNMS מוענקת באמצעות מערכת הצעות שנבדקה על ידי עמיתים וניתנת ללא עלות למועמדים מוצלחים המתכוונים לפרסם את תוצאותיהם (http://www.cnms.ornl.gov/user/becoming_a_user.shtml). אנו מודים לקווין לסטר ול-CNMS על הסיוע בייצור מערכי ננו-סיבים. אנו מודים לד"ר ג'ון קוגמן, ד"ר טימותי מקנייט, ד"ר אמבר ווב, דריל בריגס וטראוויס בי על דיונים ביקורתיים על תכנון ניסויים. אנו מודים לד"ר אדם רונדינונה על הסכימה של מכונת PECVD. אנו מודים ללזלי קרול על האיורים המדעיים. עבודה זו מומנה על ידי התוכנית למדעי הדימות הביולוגי, משרד האנרגיה של ארה"ב, משרד המדע, המחקר הביולוגי והסביבתי, DE-SC0019104 ומשרד החקלאות של ארצות הברית, 2021-67013-34835. JMM נתמך על ידי משרד החקלאות של ארצות הברית: המכון הלאומי למזון וחקלאות: מלגת פרה-דוקטורט של יוזמת החקלאות וחקר המזון 2021-67034-35167.

1. ייצור VACNFs (איור 2 ואיור 3)
<ol><li>ציפוי רקיק סיליקון עם פולימתיל מתקרילט (PMMA) 495 A4 עמיד ב 4000 סל"ד ואופים אותו ב 180 ° C במשך 5 דקות. הערה: תנו לרקיק להתקרר במשך 10 שניות לפני שתמשיכו לשלב הבא.</li>
	<li>מצפים שכבת התנגדות שנייה (PMMA 950 A2) ואופים בחום של 180°C למשך 5 דקות.</li>
	<li>השתמש בליתוגרפיה של קרן אלקטרונים כדי להגדיר את נקודות הזרז בקטרים של 300 ננומטר במרווח רוחבי מוגדר (גובה: 10 מיקרומטר, או 35 מיקרומטר) במערכים של 3 מ"מ x 3 מ"מ.</li>
	<li>לפתח את ההתנגדות ב 30-40 מ"ל של 1: 3 methyl-isobutyl ketone: אלכוהול isopropyl (IPA) במשך 1.5 דקות, ולאחר מכן לשטוף אותו עם IPA ולייבש אותו עם N2. הערה: בדוק את מערך הנקודות באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר (מטרה של 20x).</li>
	<li>נקו את רקיק ההתנגדות השיורית בחשיפה של 6 שניות בפלסמת חמצן (דסקום) בחריטה מסיליקון.</li>
	<li>השתמש באידוי קרן אלקטרונים כדי להפקיד תחילה שכבת מתכת דבקה (Ti או Cr, 10 ננומטר) ולאחר מכן להפקיד שכבה שנייה, שהיא זרז Ni (130 ננומטר או 150 ננומטר). במהלך שקיעת מתכת Ti או Ni, שמור על הזרם מתחת ל- 0.2 A ב- 10 kV, על הלחץ מתחת ל- 5 x 10-6 Torr, ועל קצב השקיעה ב- ~ 1 A/s עבור תצהיר קו ראייה.</li>
	<li>השתמש בסוניקציית אמבטיה רציפה כדי להסיר את המתכת (Ni) ששקעה על שכבת ההתנגדות שמתחתיה, והשאיר את ה- Ni מונח ישירות על פרוסת הסיליקון. תהליך זה נקרא lift-off.<ol><li>לשם כך, להכין 3 מיכלים עם אצטון אמבטיה sonicate רקיק אצטון במשך 1 דקה; חזור על הפעולה 3 פעמים בטמפרטורת החדר (RT, 20°C) בתדר של 35 kHz. יש לשטוף עם IPA ולייבש עם N2. הערה: לעולם אל תתנו לאצטון להתייבש על רקיק. לאחר סוניקציית האצטון האחרונה, יש לשטוף מיד עם IPA ולאחר מכן לייבש בגז N2 . אם בשלב כלשהו הוופל מתייבש בטרם עת (לפני שטיפת IPA) קיימת אפשרות שלא כל עודפי המתכת וההתנגדות יוסרו והאצטון יכול להשאיר שאריות.</li>
	</ol></li>
	<li>בדוק את הגיאומטריה של צורת הזרז באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM). כדי לצלם תמונות SEM של שבבי VACNF, הטה את הבמה לזווית של 30° והשתמש במתח של 1-3 kV, עם זרם קרן של ~100 pA, ובמרחק עבודה ~ 5 מ"מ. הערה: הזרז צריך להיראות כמו פאק הוקי (גליל קומפקטי) (איור 4). גובה הגליל הקומפקטי צריך לשקף את עובי Ni שהופקד על פרוסת הסיליקון. אם הפרופיל של נקודת Ni גבוה ונראה קעור בחלקו העליון, בדומה להר געש (איור 4), אז סביר יותר שהזרז יירטב לטיפות Ni מרובות וכתוצאה מכך יסתעף ננו-סיבי פחמן9 (איור 4 ואיור 5). בעיות כאלה יכולות לנבוע מהתנגדות להתכה במהלך אידוי מתכת בגלל זמני שיקוע ארוכים או בעיות בתהליך ההמראה (איור 4 ואיור 5).</li>
	<li>רבע את פרוסת הסיליקון ומקם אותה בתא שיקוע אדים כימי משופר פלזמה בזרם ישר (dc-PECVD) עם תערובת אצטילן/אמוניה. מטב את פרמטרי הגידול כדי לשלוט באורך ובחידוד של ננו-סיבים (קצוות <200 ננומטר).<ol><li>השתמש בזרם של 1-1.5 אמפר ובטווח מתח של 440-560 וולט. בעת גידול הסיבים, השתמש בשלב טרום טיפול עם זרימת אמוניה בזמן המכונה והמצע להתחמם עד 620 מעלות צלזיוס. הקפד להפעיל את מקור הפחמן (אצטילן) 10 שניות לפני הפעלת הפלזמה. הערה: רבע פרוסות משמשות למקרה שיהיה צורך למטב את פרמטרי ההפעלה של מכונת PECVD. כדי לייצר סיבים באורכים גדולים מ 40 מיקרומטר וקצוות פחות מ 200 ננומטר קוטר, הפרמטרים הבאים מוצעים: עם עובי זרז Ni של 130 ננומטר, להשתמש זרם של 1.75 A, זמן צמיחה של 70 דקות, ואצטילן : אמוניה יחס של 45 סמ"ק סטנדרטי לדקה (SCCM): 100 SCCM. עם עובי Ni של 150 ננומטר, להשתמש בזרם של 1.5 A, זמן צמיחה של 80 דקות, ויחס אצטילן : אמוניה של 48 sccm : 100 sccm. השתמש בפרמטרים הבאים כדי לגדל VACNFs ללא קשר לעובי הזרז: טמפרטורת גדילה של 620 ° C, לחץ של 10 torr במהלך פלזמה, וגובה ראש מקלחת של 20 מ"מ (איור 6).</li>
	</ol></li>
	<li>הערך את הגיאומטריה של הסיבים המתקבלים באמצעות SEM בהטיה של 30° עם פוטנציאל תאוצה של 1 kV. הערה: סיבים אופטימליים יהיו ישרים ולא מסתעפים. אי אפשר לשלוט בכיוון הגבישי של זרז Ni באמצעות מאייד קרן האלקטרונים. כתוצאה מכך, יהיו כמה סיבים שיסתעפו בגלל הרטבת זרז9. כמו כן, כיוון הגביש גורם ל- VACNFs לגדול לגבהים שונים, כך שקשה להגיע לגבהים אחידים בכל ה- VACNFs.</li>
	<li>ציפוי שכבה של photoresist (SPR955) על הסיבים ב 1000 סל"ד במשך 45 שניות. לאחר מכן חתכו את פרוסת 1/4 למערכים בגודל 3 מ"מ x 3 מ"מ באמצעות מסור קוביות. אחסנו את הסיבים בשלב זה לשימוש מאוחר יותר. הערה: אין לבצע את שלב 1.11 אם מתכננים להעביר סיבים למצע גמיש.</li>
</ol>2. Tהעברת VACNFs למצע גמיש (איור 7 ואיור 8)
<ol><li>לאחר שהסיבים מסונתזים, מעיל הספינקוט SU-8 2015 photoresist על פרוסות או רבע פרוסות ב 4000 סל"ד במשך 45 שניות.</li>
	<li>אפו את הוופל במשך 3 דקות בחום של 95°C.</li>
	<li>באמצעות יישור מגע, חשוף את הפרוסות עם מסיכה בדוגמת מערך 3 מ"מ 3 מ"מ המתיישרת עם התבנית המוגדרת מליתוגרפיית קרן אלקטרונים ב- 95 mJ/cm2. הערה: השתמש במצב מגע קרבה עם מרווח חשיפה הגדול ב- 20 מיקרומטר מהסיב הגבוה ביותר. קיימת אפשרות כי סיבים יכולים להיות מופלים במהלך שלב זה בתהליך.</li>
	<li>אופים לאחר החשיפה במשך 6 דקות בחום של 95°C.</li>
	<li>לפתח את רקיק מפתח SU-8 במשך 15 שניות, לשטוף אותו עם IPA, ולייבש את רקיק עם N2, נע מלמעלה למטה. הערה: בעת פיתוח רקיק, ודא שהוא שקוע לחלוטין.</li>
	<li>ופלים בדוגמת Spincoat עם שכבת מגן של photoresist דק (SPR 955 CM 0.7) ב 3000 סל"ד עבור 45 s ו softbake עבור 30 s ב 90 ° C.</li>
	<li>הפקידו שכבה דקה של תחמוצת סיליקון על הפרוסות (2-3 ננומטר) על ידי הצבתה בשקיעת שכבה אטומית למשך 22 מחזורים ב -100 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>השתמש במסור קוביות כדי לחתוך את רקיק לריבועים בגודל 3 מ"מ x 3 מ"מ. יישרו את מסור הקוביות לתבנית הקיימת על רקיק.</li>
	<li>הערך את הגיאומטריה של הסיבים המתקבלים באמצעות SEM בהטיה של 30° עם פוטנציאל תאוצה של 3 kV.</li>
	<li>עצור כאן אם אחסון שבבים לשימוש לטווח ארוך (> שבוע). אחסנו שבבים בחושך.</li>
	<li>כדי להפריד מצעים גמישים ממצעים קשיחים, הניחו שבבים בודדים באצטון למשך 30 דקות או עד שה-SU-8 מתחיל להתכרבל.</li>
	<li>שטפו יריעות SU-8 (מחוברות או מנותקות ממצעים קשיחים) עם IPA למשך 5 דקות ולאחר מכן עם מים למשך 5 דקות. מניחים את השבבים בקופסה מסחרית עם פד דביק בעת הובלתם.</li>
	<li>אופציונלי: הנח את הצד נטול הסיבים של סרט SU-8 על סרט מסיס במים או על גבי גומי סיליקון דק עם גב פוליאתילן טרפתאלט דק (PET) (בעובי 12.5 מיקרומטר).<ol><li>השתמש בזוג פינצטה כדי להעביר את סרט SU-8. לחץ על קצוות ריבוע SU-8 כדי לעזור לו להיצמד לסרט / גומי סיליקון - PET; זאת כדי להימנע משבירת סיבים. בשלב זה, סרטי VACNF מוכנים לשימוש מיידי.</li>
		<li>להכנת מחזיק גומי סיליקון/PET, בצעו את הפעולות הבאות: בעזרת ערכה בת 2 חלקים לגומי סיליקון, ערבבו את שני החלקים יחד (האלסטומר והקרוסלינקר). לאחר מכן, לחתוך ריבוע של PET ולהדביק אותו בצלחת פלסטיק שקופה. יוצקים שכבה דקה מאוד של גומי סיליקון על גבי ה-PET ומרפאים אותה בטמפרטורה של 80°C למשך 1-2 שעות.</li>
	</ol></li>
</ol>3. שיטה על-צמחית (שבה טיפת תמיסה להעברה מונחת על משטח הצמח) באמצעות סיבים במצע קשיח (איור 1A)
<ol><li>יש להסיר את photoresist בשטיפות מצטברות של אצטון (100%, 5 דקות), IPA (100%, 5 דקות) ו-ddH2O (5 דקות) לפני השימוש.</li>
	<li>הניחו את רקמת הצמח על משטח קשיח לתמיכה.</li>
	<li>הניחו טיפת 1 μL של צבע או DNA (200 ננוגרם) על פני השטח של רקמת הצמח.</li>
	<li>מניחים שבב VACNF עם מצע קשיח בחלק העליון של הטיפה, כאשר הסיבים מכוונים כך שהם יבואו במגע עם הטיפה. הערה: הכיוון של השבבים יכול להיקבע על ידי "מבריק" של רקיק. בצד המבריק של השבב יש סיבים, ובצד האטום אין.</li>
	<li>באמצעות הצד השטוח של זוג פינצטה, הקש על השבב. סמן את אזור הצמח שהשבב בא איתו במגע באמצעות טוש רך. הסר את שבבי VACNF לאחר המסירה. הערה: כמות הכוח המופעלת בעת הקשה תשתנה בהתאם לסוג רקמת הצמח שבה נעשה שימוש. מומלץ לתרגל הקשה על שבבים לפני ביצוע ההדבקה של סיבים. יש להימנע מנזק לרקמות הצמח. הנזק ניכר כאשר ניתן לראות את קווי המתאר של שבב VACNF ברקמת הצמח.</li>
	<li>חזור על שלבים 3.1-3.5 לבקרות (+צבע/DNA, -סיבים; -צבע/DNA, +סיבים; ו-צבע/DNA, -סיבים). סיבים הם הצד נטול הסיבים של השבב.</li>
	<li>יש לאחסן צמחים שלמים או איברי צמח שנכרתו בתאים לחים בתנאי יום ארוכים (16 שעות אור, 8 שעות כהות) במידת הצורך. עבור איברים שנכרתו, השתמשו בכלי פטרי מפלסטיק עם מגבות נייר רטובות.</li>
</ol>4. שיטת On-chip (שבה טיפת תמיסה למסירה מונחת על שבב VACNF), מצע קשיח (איור 1B)
<ol><li>יש להסיר את photoresist בשטיפות מצטברות של אצטון (100%, 5 דקות), IPA (100%, 5 דקות) ו-ddH2O (5 דקות) לפני השימוש.</li>
	<li>יש להטיל טיפת 1 μL של DNA של צבע או פלסמיד (200 ננוגרם) על צד הסיבים של שבב VACNF עם מצע קשיח. הקפידו למקם את הטיפה במרכז השבב ולכסות מספר סיבים. תנו לטיפה להתייבש במשך 15 דקות. הערה: הכיוון של השבבים יכול להיקבע על ידי "מבריק" של רקיק. בצד המבריק של השבב יש סיבים, ובצד האטום אין.</li>
	<li>כאשר עובדים עם עלים או איברים נכרתו אחרים, מניחים אותם על גבי משטח קשה. כאשר עובדים עם צמחים שלמים, מניחים משטח קשה מתחת לאיבר שאליו מוחלים VACNFs.</li>
	<li>לאחר שלב הייבוש בן 15 הדקות, מקמו את שבב ה-VACNF כך שצד הסיב יבוא במגע עם רקמת הצמח. הקש על השבב עם הקצה האחורי של זוג פינצטה. הערה: כמות הכוח המופעלת בעת הקשה תשתנה בהתאם לסוג רקמת הצמח שבה נעשה שימוש. מומלץ לתרגל הקשה על שבבים.</li>
	<li>חזור על שלבים 3.6-3.7 של השיטה על הצמח.</li>
</ol>5. יישום VACNFs ביריעות SU-8 על רקמת צמח בשיטת on-chip (איור 1C)
<ol><li>הניחו טיפת 1 μL של צבע או DNA (200 ננוגרם) על צד הסיבים של סרט SU-8 והניחו לו להתייבש במשך 10 דקות. הקפד למקם את הטיפה במרכז השבב. הערה: ישנם זמני ייבוש שונים בהתאם למצע בו משתמשים.</li>
	<li>בעזרת זוג פינצטות חדות, הניחו את סרט ה-VACNF על פני הצמח. הערה: ככל שסרטי SU-8 נשארים באוויר זמן רב יותר, כך הסרטים הופכים לשבירים יותר. כדי להגביל את הסיכון לאבד את יריעות SU-8, ודא שיש לך את כל הצמחים/דגימות והציוד ליד יריעות SU-8.</li>
	<li>גלגלו בעדינות אפליקטור איפור קטן מעל סרט VACNF. סמן את האזורים שבהם ממוקמים המצעים הגמישים בטוש רך. הסר את המצע הגמיש משטח הצמח באמצעות סרט הדבקה. הערה: כמות הכוח המופעלת בעת גלגול המוליך תשתנה בין רקמות הצמח בהן נעשה שימוש. התמחו ביישום יריעות VACNF לפני ביצוע ביומולקולה או אספקת צבע. נזק נראה לעין לרקמות הצמח ניכר כאשר ניתן לראות את קווי המתאר של סרט VACNF ברקמת הצמח.</li>
	<li>חזור על שלבים 5.1-5.3 עבור בקרות ואחסון צמחים כמתואר בשלב 3.7 של השיטה על הצמח.</li>
</ol>6. מיקרוסקופיה וניתוח תמונה לכל שיטות המסירה
<ol><li>דמיינו את הדגימות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי באמצעות אורכי גל פליטה ועירור המתאימים לגשושית/כתב הפלואורסצנטי הנמסר. הערה: הזמן הדרוש לטרנספורמציה הארעית משתנה בהתאם למיני הצמחים ולסמן הנמסר. לדוגמה, ביטוי של סמנים פלואורסצנטיים זוהה לאחר 48 שעות בארבידופסיס לעומת 96 שעות בעלי חסה7.</li>
	<li>בעת ההדמיה, נסו להתמקד באזור עם סיבים מנותקים. סיבים יהיו כיוונים שונים. הצלחת המשלוח אינה תלויה במראה של סיבים שבורים. הערה: סיבים יהיו פלואורסצנטיים עם הגדרות העירור/פליטה הנפוצות ביותר עקב היווצרות שכבת סיליקון ניטריד כתוצאה מהיווצרות סיבים ב-PECVD18.</li>
	<li>צלם לפחות 5 תמונות עבור כל דגימה. האות המתקבל ישתנה.</li>
	<li>מדוד את ערכי הפלואורסצנטיות כפלואורסצנטיות כוללת (צפיפות משולבת) באזורי תמונה קונפוקליים7 בגודל 20 מיקרומטר x 20 מיקרומטר באמצעות ImageJ19.</li>
</ol>

שימוש במערכי ננו-סיבי פחמן להעברה יעילה של ביומולקולות וצבעים לצמחים

<ol>
	<li>Canto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+expression+systems+in+plants:+potentialities+and+constraints.">Transient expression systems in plants: potentialities and constraints.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 896, 287-301 (2016).</li><li>Gou, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+protoplast+transient+expression+system+for+gene+functional+studies+in+strawberry+(Fragaria+vesca).">Optimization of the protoplast transient expression system for gene functional studies in strawberry (Fragaria vesca).</a> Plant Cell, Tissue, and Organ Culture. 141, 41-53 (2020).</li><li>Baltes, N. J., Gil-Humanes, J., Voytas, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+and+agriculture:+Opportunities+and+challenges.">Genome engineering and agriculture: Opportunities and challenges.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 149, 1-26 (2017).</li><li>Ren, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+protoplast+isolation+and+transient+expression+system+for+functional+characterization+of+flowering+related+genes+in+Cymbidium+orchids.">Highly efficient protoplast isolation and transient expression system for functional characterization of flowering related genes in Cymbidium orchids.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), 2264 (2020).</li><li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanovehicles+for+plant+modifications+towards+pest-and+disease-resistance+traits.">Nanovehicles for plant modifications towards pest-and disease-resistance traits.</a> Trends in Plant Science. 25 (2), 198-212 (2020).</li><li>Davern, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbon+nanofiber+arrays:+a+novel+tool+for+microdelivery+of+biomolecules+to+plants.">Carbon nanofiber arrays: a novel tool for microdelivery of biomolecules to plants.</a> PLoS One. 11 (4), e0153621 (2016).</li><li>Morgan, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+and+broadly+applicable+method+for+transient+transformation+of+plants+using+vertically+aligned+carbon+nanofiber+arrays.">An efficient and broadly applicable method for transient transformation of plants using vertically aligned carbon nanofiber arrays.</a> Frontiers in Plant Science. 13, 1051340 (2022).</li><li>Melechko, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertically+aligned+carbon+nanofibers+and+related+structures:+Controlled+synthesis+and+directed+assembly.">Vertically aligned carbon nanofibers and related structures: Controlled synthesis and directed assembly.</a> Journal of Physics D: Applied Physics. 97, 041301 (2005).</li><li>Melechko, A. V., Desikan, R., McKnight, T. E., Klein, K. L., Rack, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+vertically+aligned+carbon+nanofibres+for+interfacing+with+live+systems.">Synthesis of vertically aligned carbon nanofibres for interfacing with live systems.</a> Journal of Physics D: Applied Physics. 42 (19), 193001 (2009).</li><li>Nelson-Fitzpatrick, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Novel Materials for the Design of Cantilever Transducers [dissertation]. , (2011).</li><li>Fletcher, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+flexible+arrays+of+vertically+aligned+carbon+nanofiber+electrodes+to+temperature-sensitive+substrates.">Transfer of flexible arrays of vertically aligned carbon nanofiber electrodes to temperature-sensitive substrates.</a> Advanced Materials. 18 (13), 1689-1694 (2006).</li><li>Keller, S., Blagoi, G., Lillemose, M., Haefliger, D., Boisen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+thin+SU-8+films.">Processing of thin SU-8 films.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 18 (12), 125020 (2008).</li><li>Wouters, K., Puers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusing+and+swelling+in+SU-8:+insight+in+material+properties+and+processing.">Diffusing and swelling in SU-8: insight in material properties and processing.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 20 (9), 095013 (2010).</li><li>Jamal, M., Zarafshar, A. M., Gracias, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentially+photo-crosslinked+polymers+enable+self-assembling+microfluidics.">Differentially photo-crosslinked polymers enable self-assembling microfluidics.</a> Nature Communications. 2, 527 (2011).</li><li>Williams, R., Goodman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wetting+of+thin+layers+of+SiO2+by+water.">Wetting of thin layers of SiO2 by water.</a> Applied Physics Letters. 25 (10), 531-532 (1974).</li><li>Kundu, A., Nogueira Campos, M. G., Santra, S., Rajaraman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+vascular+delivery+of+agrochemicals+with+micromilled+microneedles+(&#181;MMNs).">Precision vascular delivery of agrochemicals with micromilled microneedles (&#181;MMNs).</a> Scientific Reports. 9, 14008 (2019).</li><li>Acanda, Y., Welker, S., Orbovi&#263;, V., Levy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+efficient+agroinfiltration+method+for+transient+gene+expression+in+Citrus.">A simple and efficient agroinfiltration method for transient gene expression in Citrus.</a> Plant Cell Reports. 40 (7), 1171-1179 (2021).</li><li>Pearce, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+properties+of+SiNx+coatings+as+stable+fluorescent+markers+on+vertically+aligned+carbon+nanofibers.">Synthesis and properties of SiNx coatings as stable fluorescent markers on vertically aligned carbon nanofibers.</a> AIMS Materials Science. 1 (2), 87-102 (2014).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Crafts, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+in+plants.">Translocation in plants.</a> Plant Physiology. 13 (4), 791 (1938).</li><li>Martens, H. J., Hansen, M., Schulz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caged+probes:+a+novel+tool+in+studying+symplasmic+transport+in+plant+tissues.">Caged probes: a novel tool in studying symplasmic transport in plant tissues.</a> Protoplasma. 223, 63-66 (2004).</li><li>Liu, J., Essner, J., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+supercapacitor+based+on+coaxially+coated+manganese+oxide+on+vertically+aligned+carbon+nanofiber+arrays.">Hybrid supercapacitor based on coaxially coated manganese oxide on vertically aligned carbon nanofiber arrays.</a> Chemistry of Materials. 22 (17), 5022-5030 (2010).</li><li>Saleem, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+temperature+and+cost-effective+growth+of+vertically+aligned+carbon+nanofibers+using+spin-coated+polymer-stabilized+palladium+nanocatalysts.">Low temperature and cost-effective growth of vertically aligned carbon nanofibers using spin-coated polymer-stabilized palladium nanocatalysts.</a> Science and Technology of Advanced Materials. 16, 015007 (2015).</li><li>Merkulov, V. I., Lowndes, D. H., Wei, Y. Y., Eres, G., Voelkl, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+growth+of+individual+and+multiple+vertically+aligned+carbon+nanofibers.">Patterned growth of individual and multiple vertically aligned carbon nanofibers.</a> Applied Physics Letters. 76 (24), 3555-3557 (2000).</li><li>Retterer, S. T., Melechko, A., Hensley, D. K., Simpson, M. L., Doktycz, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positional+control+of+catalyst+nanoparticles+for+the+synthesis+of+high+density+carbon+nanofiber+arrays.">Positional control of catalyst nanoparticles for the synthesis of high density carbon nanofiber arrays.</a> Carbon. 46 (11), 1378-1383 (2008).</li><li>Rooks, M. J., Wind, S., McEuen, P., Prober, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+30-nm-scale+structures+for+electron+transport+studies+using+a+polymethylmethacrylate+bilayer+resist.">Fabrication of 30-nm-scale structures for electron transport studies using a polymethylmethacrylate bilayer resist.</a> Journal of Vacuum Science &amp; Technology B: Microelectronics Processing and Phenomena. 5 (1), 318-321 (1987).</li><li>Lee, G., Sohn, D. K., Seok, S. H., Ko, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+hole+density+variation+in+the+PECVD+reactor+showerhead+on+the+deposition+of+amorphous+carbon+layer.">The effect of hole density variation in the PECVD reactor showerhead on the deposition of amorphous carbon layer.</a> Vacuum. 163, 37-44 (2019).</li><li>Fowlkes, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+catalyst+particle+crystallographic+orientation+in+vertically+aligned+carbon+nanofiber+synthesis.">Control of catalyst particle crystallographic orientation in vertically aligned carbon nanofiber synthesis.</a> Carbon. 44 (8), 1503-1510 (2006).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

במאמר זה הצגנו שיטות לבניית מערכי ננו-סיבי פחמן מיושרים אנכית, העברת הסיבים למצע גמיש ויישום סיבים במצע קשיח או גמיש על צמחים לשימוש בהעברת ביומולקולות או צבעים לצמחים. תיארנו שתי גישות כלליות, שיטת ה-on-chip והשיטות on-plant, לשיקוע החומרים שהוכנסו והראינו תוצאות מוצלחות בסיבים על מצע קשיח וכן בשיטת on-chip באמצעות יריעות VACNF. היישום של סיבים אלה פשוט יותר בפרקטיקה ובתיאוריה מאשר שיטות טרנספורמציה מסורתיות של צמחים (הפצצת חלקיקים, טרנספורמציה של פרוטופלסט באמצעות PEG או אלקטרופורציה) וניתן להשתמש בהם עבור צמחים סרבנים להתמרה בתיווך אגרובקטריום. עם זאת, רק תאים מעטים עוברים טרנספורמציה.
ננו-סיבי פחמן מיושרים אנכית יוצרו במרכז המעבדה הלאומית אוק רידג' למדעי החומרים הננופאזיים באמצעות תוכנית המשתמש שלהם. משתמשים יכולים להגיש בקשה להשתמש במתקן זה לייצור VACNFs. לחלופין, ניתן לייצר שבבי VACNF בחדרים נקיים עם מכונות שקיעת אדים כימיים משופרות פלזמה בזרם ישר עם מקור פחמן22,23. עם השיטות המתוארות, ישנם מספר שלבים קריטיים לייצור הסיבים, העברת סיבים ויישום שבבים/יריעות VACNF. כדי שיישום סיבים יעבוד, סיבים חייבים להיות ישרים ולהיות בעלי קוטר מתחדד של <200 ננומטר בקצה כדי שהאספקה בתאי הצמח תהיה מוצלחת 6,7 (איור 3). כדי ליצור ננו-סיבי פחמן בגודל וגובה מסוימים, ישנם מגוון פרמטרים שניתן לשנות, כולל גודל הנקודה, המגרש הרוחבי וכמות הזרז שהושקע. כדי לבחור את גודל הנקודה האופטימלי שישמש לייצור ננו-סיבי פחמן, גידלו סיבים מגדלי נקודות שונים (כפי שמוצג באיור 5). מצאנו שקוטר של 300 ננומטר מייצר את הסיבים הטובים ביותר, ולכן גודל הנקודה הזה נבחר (איור 5). לאחר שמצאנו את הפרמטרים הנכונים, חיפשנו להשתמש בשבבים שיש להם >50% מהסיבים עם הגיאומטריה האידיאלית (ישר וקוטר קצה <200 ננומטר). כדי לבדוק את הגיאומטריה של הסיבים, השתמשנו במיקרוסקופ אלקטרונים סורק כדי לצלם שדות ראייה אקראיים על דגימה של שבבים/יריעות VACNF.
בנוסף, הסיבים חייבים להיות באורך מינימלי מסוים כדי להשיג אספקה בתוך תאי הצמח. החשיבות של ייצור סיבים באורכים שונים היא שניתן להשתמש בסיבים ארוכים יותר כדי לחדור לשכבות רקמות עמוקות יותר. סיבים ארוכים יותר (>40 מיקרומטר אורך) חיוניים עבור יריעות גמישות כמו העברת סיבים עובד על ידי שבירת הסיבים מבסיסם דורש שכבות SU-8 על גבי הסיבים. עובי העבודה של שכבת SU-8 המשמשת לפרוטוקול זה הוא 20-35 מיקרומטר. הגובה המינימלי הדרוש כדי להשיג משלוח בתוך האפידרמיס של צמחים שונים (מעוקל או שטוח) הוא 10-15 מיקרומטר 6,7. כתוצאה מכך, סיבים באורכים >40 מיקרומטר נחוצים עבור יריעות VACNF. ישנם מספר פרמטרים שונים שיש לקחת בחשבון בעת ייצור ננו-סיבי פחמן: חומר זרז, גיאומטריית זרז, עובי חומר זרז וכן תנאים בתוך תא PECVD (יחס גז, לחץ, טמפרטורה, זרם, גובה ראש מקלחת וזמן גידול)8,9,24,25. כדי לייצר ננו-סיבי פחמן ארוכים מ-25 מיקרומטר המשמשים את Morgan et al.7 ו-Davern et al.6, הגדלנו את כמות הזרז Ni, שינינו את יחס האצטילן: אמוניה, והגדלנו את הזרם ואת זמן הגידול. בנוסף, הקדשנו תשומת לב רבה יותר לגיאומטריה של חומר הזרז. כדי לייצר סיבים ישרים גבוהים, הזרז שהושקע היה צריך להיות בעל צורת פאק הוקי ולא צורה שמזכירה הר געש (איור 4). מבני הר געש נובעים משאריות של photoresist לאחר המראה. כדי למנוע היווצרות הרי געש, נעשה שימוש בשכבה כפולה של PMMA ליצירת חתך תחתון במהלך ליתוגרפיית קרן אלקטרונים26. החתך התת-קרקעי מסייע בהתרוממות של זרז המתכת שהושקע (איור 2). השכבה העבה של הזרז חשובה לצמיחה של VACNF גבוהים. המורפולוגיה של VACNFs נבדקה על ידי Merkulova et al.24. היישור האנכי של VACNFs נובע הן מהצמיחה מסוג קצה זרז Ni והן מהיישור של פוטנציאל DC בניצב למצע (איור 6). ראש המקלחת מתאר את הגיאומטריה של כור PECVD (איור 6) ומשמש כמקור לפוטנציאל לשדה החשמלי27.
כדי להגדיר את מערך נקודות הזרז עם ליתוגרפיית קרן אלקטרונים, יישמנו התנגדות לקרן אלקטרונים (פולימתיל מתקרילט), ולאחר מכן השתמשנו באלומת האלקטרונית כדי ליצור חורים קטנים בהתנגדות עם צורה מסוימת ובמיקומים ספציפיים על רקיק. חורים בקוטר הרצוי הונחו על רשת רגילה עם המרווח המוגדר (גובה) וקובץ המציין את התבנית הרצויה נטען בכלי הליתוגרפיה של קרן אלקטרונים לפני טעינת המצע למכונה. בנוסף לגובה הסיבים, פרמטר קריטי נוסף להעברת סיבים מוצלחת הוא משך הזמן המושקע באמבט אצטון. סרטי VACNF צריכים להישאר באמבט אצטון מספיק זמן כדי שהקצוות שלהם יתחילו להתעקל; אם הם נשארים באמבט אצטון מעט מדי זמן, קשה יותר להרים אותם מהשבבים והם עלולים להישבר. ככל שהצ'יפס ישן יותר, כך הם יצטרכו להישאר זמן רב יותר באמבט אצטון. לאחר אמבט האצטון, הסרטים / שבבים הוכנסו לאיזופרופנול ומים כדי להסיר אצטון גישה וכן כדי להסיר את הפוטו-התנגדות המגנה על הסיבים.
כדי לבצע ציפוי ספין, ופלים או חתיכות רקיק ממוקמים על צ'אק ואקום בקואטר הסחיטה, והמיקום המרכזי של הפרוסות מאומת באמצעות פונקציית הבדיקה של קואטר הסחרור. שלולית קטנה (~ 2.5 ס"מ קוטר) של התנגדות מוחלת על מרכז רקיק ומסובבת (3000 סל"ד במשך 45 שניות) תמונות של הסיבים לפני ואחרי ציפוי הסחרור כלולות באיור 8 המראות את שימור גיאומטריית הסיבים (גובה, כיוון וגובה). נוכחות הסיבים גורמת להתנגדות להצטברות בבסיס הסיבים והתוצאה היא שכבות עבות מהצפוי. ציפוי ספין לאחר צמיחת VACNF נבדק על ידי קבוצות אחרות11,18.
צעד נוסף בתהליך שהוא בעל חשיבות מכרעת הוא לוודא שכמות הכוח הנכונה מופעלת על שבבים/יריעות VACNF. מנגנון ההולכה תלוי בסיבים היוצרים נקבים קטנים בדפנות התא באמצעות כוח הדחף של הפינצטה המקישים על מצעים קשיחים 6,7 או מתגלגלים עם המוליך המיני איפור על מצעים גמישים. סיבים עשויים להישבר או לא להישבר ולהישאר טבועים בתאי הצמח6,7 ללא השפעה על התוצאה, אך תרגול בשילוב עם בדיקת ספיגת צבע ונזק לרקמות הוא הכרחי כדי לקבל את הלחץ הנכון. נוסף על כך, חשוב לבחור נקודות זמן מתאימות להדמיה לאחר מסירת דנ"א עם שבבים/יריעות VACNF מאחר שהזמן לביטוי ניתן לזיהוי משתנה בין מיני צמחים לבין סוגי הווקטורים המועברים7 (איור 16).
עד כמה ששיטה זו ישימה באופן רחב על צמחים, יש לה כמה מגבלות. לדוגמה, הוספת שכבה דקה של תחמוצת סיליקון ליריעות VACNF לא תמיד גורמת לכך שהיריעות יהיו הידרופיליות לחלוטין בגלל שכבת ההגנה של התנגדות האור שנוספה על גבי SU-8. אם בעיה זו תתממש, שכבות עבות יותר של תחמוצת סיליקון יכולות להיות מיושמות על VACNFs. כדי לבדוק אם הסרטים הם הידרופוביים או הידרופיליים, הם יכולים להיות ממוקמים במים. אם היריעות שוקעות, הן הידרופיליות, ואם הן צפות, הן הידרופוביות. בנוסף, יכולה להיות שונות בין אצוות של סיבים המיוצרים. ישנם מספר פרמטרים שניתן לשנות בעת גידול הסיבים במכונת dc -PECVD; מה שמתואר בפרוטוקול זה הוא קבוצה של פרמטרים עבור שתי כמויות שונות של זרז Ni. בנוסף, לא ניתן לשלוט בכיוון הגבישי של זרז Ni28 והסתעפות מסוימת תגרום בהכרח לסיבים.
בעוד שהדגמנו העברה של צבע פלואורסצאין ודנ"א לתאי צמחים באמצעות מצעים קשיחים וגמישים עבור מאמר זה, השיטה צריכה להיות ישימה באופן נרחב עבור ביומולקולות אחרות וגישות שינוי גנטי, לדוגמה, השתקת RNAi עבור מערכות צמחים כמו תפוחים או פירות אחרים, שם ייקח שנים לייצר קווים טרנסגניים יציבים. יתר על כן, סיבים אלה יכולים לשמש גם להעברת חומרי עריכה גנטיים או לטרנספורמציות יציבות בצמחים.

טרנספורמציה של צמחים (הן חולפת והן יציבה) עדיין לא הפכה להשגה נרחבת בכל רקמות הצמחים והמינים. הטרנספורמציה הארעית של צמחים היא תהליך שבו גנים המקודדים בפלסמידים מוחדרים באופן זמני לצמחים, אך אינם משולבים באופן יציב בגנום. שיטות מסורתיות המשתמשות בהפצצת חלקיקים, אגרובקטריה, אלקטרופורציה או פוליאתילן גליקול הטיפול בפרוטופלסטים הוא איטי או יכול להיות מסורבל. יתר על כן, הם אינם חלים על כל מיני צמחים 1,2,3,4. השימוש בננו-חומרים להעברת דנ"א הוא תחום מתפתח שנמצא עדיין בחיתוליו5. ננו-חומרים, במיוחד ננו-סיבי פחמן, שימשו בהצלחה גם להעברת חלבונים, דקסטרנים וצבעים לעלי הצמח מבלי לגרום לתגובת פצע6. מטרת עבודה זו היא לספק פרוטוקול מפורט לשימוש בסוג אחד של ננו-חומר, ננו-סיבי פחמן, להעברת ביומולקולות או צבעים לצמחים. כאן אנו מתמקדים בדנ"א כביומולקולה המועדפת, המאפשרת טרנספורמציה חולפת של תאים באיברי צמחים שונים.
בעבר, Morgan et al.7 הדגימו את השימוש בננו-סיבי פחמן המודבקים על מצע סיליקון קשיח כדי לשנות באופן זמני עלים של חסה, N. benthamiana , צפצפה, וגם עלים ושורשים של Arabidopsis. למרות שהטרנספורמציות היו מוצלחות על מגוון איברים, סיבים היו קשים יותר ליישום על רקמות צמחים עם משטחים מעוקלים, כגון שורשים או פירות. הנחנו כי גב גמיש לננו-סיבים עשוי לשפר את יעילות ההעברה שלהם על ידי התאמה טובה יותר לצורת האיבר.
במאמר זה, אנו מפרטים שיטות המשמשות לייצור ועיצוב ננו-סיבי פחמן מיושרים אנכית, העברת VACNFs למצעים גמישים, ויישום VACNFs על מצעים קשיחים וגמישים לצמחים כדי לספק ביומולקולות וצבעים. ננו-סיבי פחמן יוצרו באמצעות שקיעת אדים כימית משופרת פלזמה בזרם ישר (dc C-PECVD) עם זרז Ni. המיקום, הקוטר והגובה של נקודות זרז Ni נשלטו באמצעות שילוב של ליתוגרפיה של קרן אלקטרונים, אידוי מתכת ותהליכי הרמה כפי שתוארו על ידי Melechko et al.8,9. באמצעות התנגדות קרן אלקטרונית דו-שכבתית, ניתן להניח זרז Ni עבה יותר על המצע כדי לתת סיבים ארוכים יותר10. העברת סיבים ממצע קשיח לגמיש מבוססת על שינוי של שיטות המתוארות בפלטשר ואחרים 11, כאשר השיטות הנוכחיות מוותרות על שימוש בשכבת פחמן אמורפית או שכבת פוטו-התנגדות להקרבה. הרמת SU-8 עם העברת סיבים מושגת על ידי ניצול לחץ המתיחה הפנימי הנובע מתת-אפייה ותת-חשיפה של SU-812,13,14. SU-8, פולימר מורכב, הוא הידרופובי באופן טבעי, מה שהופך את השימוש בו להקל על העברת DNA קשה. כדי לנטרל את האופי ההידרופובי של SU-8, אנו מיישמים שכבה דקה של תחמוצת סיליקון באמצעות שקיעת שכבה אטומית15 לאחר שסיבים מוטמעים ב- SU-8. יישום סיבים על מצע קשיח להעברת ביומולקולה/צבע מנצל את כוח ההשפעה של הקשה בפינצטה המתוארת ב- Davern et al.6 ובשיטות על הצמח ועל השבב המתוארות ב- Morgan et al.7. יריעות VACNF גמישות מיושמות על משטחי צמחים מעוקלים על ידי ייבוש למחצה של טיפות DNA או צבע על היריעה, כמו בשיטת On-Chip של Morgan et al.7ולאחר מכן גלגול היריעות על משטחי צמחים מעוקלים באמצעות אפליקטור איפור קטן16,17. איור 1 מתאר גישות שונות ליישום סיבים במצעים קשיחים וגמישים על צמחים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>13&#34; x 13&#34; White 1/4-fold heavy duty Brawny industrial shop towel 70Ct</td>
			<td>Fastenal&#160;</td>
			<td>690535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol (IPA)&#160;</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A451-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#34; Lid</td>
			<td>Entegris</td>
			<td>H22-401-0615</td>
			<td>Wafer Carriers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#34; tray</td>
			<td>Entegris</td>
			<td>H22-40-0615</td>
			<td>Wafer Carriers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accretech SS10 dicing saw</td>
			<td>Accreteck</td>
			<td>SS10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A18-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone used in the cleanroom at ORNL</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>9005-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apples</td>
			<td>Grocery store</td>
			<td>No product number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabidopsis thaliana&#160;</td>
			<td>Seeds of accession Columbia from the laboratory of Professor Jean Greenberg at the University of Chicago</td>
			<td>No product number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon direct current plasma enhanced chemical vapor deposition machine</td>
			<td>Oak Ridge National Laboratory&#160;</td>
			<td>Custom-built</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobham Green lettuce&#160;</td>
			<td>Seeds from the laboratory of Professor Richard Michelmore at the University of California, Davis</td>
			<td>No product number</td>
			<td>Butterhead lettuce</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein dye</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2456-2.5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel-box&#160;</td>
			<td>Gel-Pak</td>
			<td>&#160;AD-23C-00-X4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heidelberg DWL 66 direct-write lithography tool&#160;</td>
			<td>Heidelberg</td>
			<td>DWL 66</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institues of Health&#160;</td>
			<td>No product number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoproponal (IPA) used in the cleanroom at ORNL</td>
			<td>Doe and Ingalls</td>
			<td>CMOS Grade 9079-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEOL 9300FS 100kV electron beam lithography system</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>8100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional 34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kord-Valmark disposable polystyrene petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>11019-554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Layout Editor&#160;</td>
			<td>&#160;juspertor GmbH</td>
			<td>No product number&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 710 confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>No product number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 800 confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>No product number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Make-up applicator&#160;</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>G2PLUS</td>
			<td>500 PCS Disposable Micro Applicators Brush for Makeup and Personal Care (Head Diameter: 1.5 mm)- 5 x 100 PCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Merlin field emission scanning electron microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Merlin</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIBK/IPA&#160; (methyl isobutyl ketone/isopropanol) (1:3)</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>M089025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Onions</td>
			<td>Grocery store</td>
			<td>No product number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxford FlexAl atomic layer deposition</td>
			<td>Oxford</td>
			<td>FlexAl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMMA 495 A4</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>M130004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMMA 950 A4</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>M230004</td>
			<td>Can dilute down to A2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene terephthalate (PET)</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>KS-6304-21-11</td>
			<td>Type D Clear PET (Polyester) Sheet .0005&#34; Thick x 27&#34; Width x 10 Ft Length 1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision tweezers</td>
			<td>Aven Inc.&#160;</td>
			<td>18032TT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pUBQ10:YFP-GW</td>
			<td>Arabidopsis Biological Resource Center</td>
			<td>CD3-1948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon etcher (used for descum)&#160;</td>
			<td>Oxford</td>
			<td>Plasmalab</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon rubber kit</td>
			<td>Smooth-On Inc</td>
			<td>Ecoflex 00-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafers</td>
			<td>Pure Wafer</td>
			<td>4N0.001-.005SSP-INV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>Brewer Sciences</td>
			<td>Model 100CB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPR 955cm 0.7&#160;</td>
			<td>Megaposit</td>
			<td>10018314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strawberries</td>
			<td>Grocery store</td>
			<td>No product number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2015</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>SU-8 2000 Series</td>
			<td>Toxic. Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>SU-8 2000 Series</td>
			<td>Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suss MicroTec contact aligner</td>
			<td>Suss MicroTec</td>
			<td>MA6/BA6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top microscope</td>
			<td>Phenom XL</td>
			<td>used for checking Ni catalysts after metal deposition</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermionics VE-240 e-beam evaporator</td>
			<td>Thermionics</td>
			<td>VE-240</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using vertically aligned carbon nanofiber arrays on rigid or flexible substrates for delivery of biomolecules and dyes to plants

אספקת ביומולקולות וצבעים בלתי חדירים לצמחים שלמים היא אתגר גדול. ננו-חומרים הם כלים מתקדמים להעברת דנ"א לצמחים. עד כמה שהכלים החדשים האלה מרגשים, הם עדיין לא יושמו באופן נרחב. ננו-חומרים המיוצרים על מצע קשיח (גב) קשים במיוחד ליישום מוצלח על מבני צמחים מעוקלים. מחקר זה מתאר את התהליך לייצור מיקרו-ייצור של מערכי ננו-סיבי פחמן מיושרים אנכית והעברתם ממצע קשיח למצע גמיש. אנו מפרטים ומדגימים כיצד סיבים אלה (על מצעים קשיחים או גמישים) יכולים לשמש לטרנספורמציה חולפת או להעברת צבע (למשל, פלואורסצאין) לצמחים. אנו מראים כיצד ניתן להעביר VACNF ממצע סיליקון קשיח למצע אפוקסי SU-8 גמיש ליצירת מערכי VACNF גמישים. כדי להתגבר על האופי ההידרופובי של SU-8, סיבים בסרט הגמיש היו מצופים בשכבת תחמוצת סיליקון דקה (2-3 ננומטר). כדי להשתמש בסיבים אלה להעברה לאיברי צמח מעוקלים, אנו מפקידים טיפת 1 μL של צבע או תמיסת DNA בצד הסיבים של יריעות VACNF, ממתינים 10 דקות, מניחים את היריעות על איבר הצמח ומשתמשים במטוש בתנועה מתגלגלת כדי להניע סיבים לתוך תאי הצמח. בשיטה זו השגנו העברת צבע ודנ"א באיברי צמחים בעלי משטחים מעוקלים.

Plant transformation (both transient and stable) has yet to become widely achievable in all plant tissues and species. The transient transformation of plants is a process by which genes encoded in plasmids are temporarily introduced into plants but are not stably incorporated into the genome. Traditional methods that use particle bombardment, Agrobacteria, electroporation, or polyethylene glycol treatment of protoplasts are slow or can be cumbersome. Furthermore, they are not applicable to every plant species1,2,3,4.&#160;The use of nanomaterials for DNA delivery is a burgeoning field that is still in its infancy5. Nanomaterials, specifically carbon nanofibers have also successfully been used to deliver proteins, dextrans and dyes to plant leaves without causing wound response6. The goal of this work is to provide a detailed protocol for using one type of nanomaterial, carbon nanofibers, for delivering biomolecules or dyes to plants. Here, we focus on DNA as the biomolecule of choice, which permits the transient transformation of cells in various plant organs.
Previously, Morgan et al.7 demonstrated the use of carbon nanofibers affixed to rigid silicon substrate to transiently transform leaves of lettuce, N. benthamiana, and poplar, and both leaves and roots of Arabidopsis. Although transformations were successful on a variety of organs, fibers were more difficult to apply to plant tissues with curved surfaces, such as roots or fruits. We reasoned that a flexible backing for nanofibers might improve their efficiency of delivery by conforming better to the shape of the organ.
Herein, we detail methods utilized for fabricating and designing vertically aligned carbon nanofibers, transferring VACNFs to flexible substrates, and applying VACNFs on both rigid and flexible substrates to plants to deliver biomolecules and dyes. Carbon nanofibers were produced using direct current catalytic plasma-enhanced chemical vapor deposition (dc C-PECVD) with Ni catalyst. The position, diameter, and height of Ni catalyst dots were controlled using a combination of electron beam lithography, metal evaporation, and lift-off processes as described by Melechko et al.8,9. Using a double-layer e-beam resist, a thicker Ni catalyst can be deposited on the substrate to give longer fibers10. Fiber transfer from a rigid to a flexible substrate is based on a modification of methods described in Fletcher et al.11, with the current methods foregoing the use of an amorphous carbon layer or a sacrificial photoresist layer. SU-8 lift-off with fiber transfer is achieved by utilizing the intrinsic tensile stress resulting from underbaking and underexposing the SU-812,13,14. SU-8, a complex polymer, is naturally hydrophobic, which makes its use for facilitating DNA delivery difficult. To counteract the hydrophobic nature of SU-8, we apply a thin layer of silicon oxide via atomic layer deposition15 after fibers are embedded in SU-8. Application of fibers on a rigid substrate for biomolecule/dye delivery utilizes the impact force of tweezer tapping described in Davern et al.6 and the on-plant and on-chip methods described in Morgan et al.7. Flexible VACNF films are applied to curved plant surfaces by first semidrying DNA or dye droplets on the film as with the on-chip method from Morgan et al.7and then rolling the films on curved plant surfaces using a small makeup applicator16,17. Figure 1 depicts various approaches for applying fibers in rigid and flexible substrates to plants.

מחבר זרקור: שחרור טרנספורמציה של צמחים על ידי חדשנות עם מערכי ננו-סיבי פחמן 

שימוש במערכי ננו-סיבי פחמן מיושרים אנכית על מצעים קשיחים או גמישים להעברת ביומולקולות וצבעים לצמחים

We are trying to demonstrate a general method for delivery of dye or DNA into plants using carbon nanofiber arrays. Many plants are recalcitrant to traditional transformation methods. Our method can solve this problem using carbon nanofiber arrays on flexible rigid substrates.Our technique is fast and user-friendly. It can be applied to virtually any plant species or plant organ. It can also be used to deliver other reagents such as dyes and proteins.

Watch this Scientific Journal Video about Unlocking Plant Transformation by Innovating with Carbon Nanofiber Arrays at JoVE.com

במאמר זה אנו מתארים שיטות לייצור מיקרו-ייצור של ננו-סיבי פחמן מיושרים אנכית (VACNFs), העברת VACNFs למצעים גמישים, ויישום VACNFs על מצעים קשיחים וגמישים לצמחים לצורך העברת ביומולקולות וצבעים.

The delivery of biomolecules and impermeable dyes to intact plants is a major challenge. Nanomaterials are up-and-coming tools for the delivery of DNA to ...

אנו מנסים להדגים שיטה כללית להעברת צבע או דנ"א לצמחים באמצעות מערכי ננו-סיבי פחמן. צמחים רבים עקשנים לשיטות טרנספורמציה מסורתיות. השיטה שלנו יכולה לפתור בעיה זו באמצעות מערכי ננו-סיבי פחמן על מצעים קשיחים גמישים.הטכניקה שלנו מהירה וידידותית למשתמש. זה יכול להיות מיושם כמעט על כל מיני צמחים או איבר הצמח. זה יכול לשמש גם כדי לספק ריאגנטים אחרים כגון צבעים וחלבונים.

using-vertically-aligned-carbon-nanofiber-arrays-on-rigid-or-flexible

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Using Vertically Aligned Carbon Nanofiber Arrays on Rigid or Flexible Substrates for Delivery of Biomolecules and Dyes to Plants

927 Views.  The University of Chicago. אנו מנסים להדגים שיטה כללית להעברת צבע או דנ"א לצמחים באמצעות מערכי ננו-סיבי פחמן. צמחים רבים עקשנים לשיטות טרנספורמציה מסורתיות. השיטה שלנו יכולה לפתור בעיה זו באמצעות מערכי ננו-סיבי פחמן על מצעים קשיחים גמישים.הטכניקה שלנו מהירה וידידותית למשתמש. זה יכול להיות מיושם ?...

Video: מחבר זרקור: שחרור טרנספורמציה של צמחים על ידי חדשנות עם מערכי ננו-סיבי פחמן 

The delivery of biomolecules and impermeable dyes to intact plants is a major challenge. Nanomaterials are up-and-coming tools for the delivery of DNA to plants. As exciting as these new tools are, they have yet to be widely applied. Nanomaterials fabricated on rigid substrate (backing) are particularly difficult to successfully apply to curved plant structures. This study describes the process for microfabricating vertically aligned carbon nanofiber arrays and transferring them from a rigid to a flexible substrate. We detail and demonstrate how these fibers (on either rigid or flexible substrates) can be used for transient transformation or dye (e.g., fluorescein) delivery to plants. We show how VACNFs can be transferred from rigid silicon substrate to a flexible SU-8 epoxy substrate to form flexible VACNF arrays. To overcome the hydrophobic nature of SU-8, fibers in the flexible film were coated with a thin silicon oxide layer (2-3 nm). To use these fibers for delivery to curved plant organs, we deposit a 1 &#181;L droplet of dye or DNA solution on the fiber side of VACNF films, wait 10 min, place the films on the plant organ and employ a swab with a rolling motion to drive fibers into plant cells. With this method, we have achieved dye and DNA delivery in plant organs with curved surfaces.

Here we describe methods for microfabricating vertically aligned carbon nanofibers (VACNFs), transferring VACNFs to flexible substrates, and applying VACNFs on both rigid and flexible substrates to plants for biomolecule and dye delivery.

On-Chip Method to Deliver Dye or Biomolecules to Plants Using VACNFs in a Flexible Substrate

Begin by preparing vertically aligned carbon nano fibers, or VACNFs. To transfer the VACNFs to a flexible substrate, first place the individual chips in acetone to separate the flexible substrate from the rigid substrate. Then, wash SU-8 films with IPA for five minutes, followed by washing with water for five minutes.Place the chips in a commercial box with a sticky pad when transporting them. Prepare a silicone rubber PET holder by mixing the elaststomer and the crosslinker from a two-part kit. Cut out a square of PET and tape it down in a clear plastic dish.Then, pour a very thin film of silicone rubber on top of the PET and cure it at 80 degrees Celsius for one to two hours. Transfer the SU-8 film to the PET holder using a pair of tweezers, and place the fiberless side of the SU-8 film on the silicone rubber. Press on the edges of the SU-8 square to help it stick to the silicone rubber PET and avoid breaking off fibers.Then, place a one microliter droplet of dye onto the fiber side of the SU-8 film and let it dry for 10 minutes. After drying, place the VACNF film onto the plant surface using a pair of sharp tweezers. Then, gently roll a small makeup applicator over the VACNF film.Mark the areas where the flexible substrates are placed with a soft tipped marker. Then remove the flexible substrates from the plant surface using tape. Repeat VACNF application for controls, such as placing dye on the fiberless side of a film, using the film without dye, and using the fiberless side of a film.The on-chip method was used to deliver fluorescein dye to curved surfaces, such as strawberries, in which a strong fluorescein signal was observed immediately. Whereas in apples, a strong fluorescein signal was seen after two hours of delivery. Similarly, delivery of a plasmid containing yellow fluorescent protein was achieved in apples.Also, a successful transient transformation of onions was done by delivering the plasmid containing yellow fluorescent protein using VACNF films.

שיטה על שבב להעברת צבע או ביומולקולות לצמחים באמצעות VACNFs במצע גמיש

On-Plant Method to Deliver Dye or Biomolecules Using VACNFs in a Rigid Substrate

To begin, remove the photo resist from the VACNFs by washing with 100%acetone for five minutes, followed by a five minute wash with 100%IPA, and then double distilled water for five minutes. Then, place the plant tissue to be impaled on a hard surface for support. Place a one microliter droplet of dye onto the surface of the plant tissue.Place a VACNF chip with a rigid substrate down the top of the droplet, with the fibers oriented such that they will come into contact with the droplet. Using the flat side of a pair of tweezers, tap the chip, mark the area of the plant that the chip came into contact with using a soft tipped marker. Remove the VACNF chips after delivery.Repeat these steps for controls, such as placing dye on the fiberless side of a film, using the film without dye, and using the fiberless side of a film. Store intact plants or excised plant organs in humid chambers in long day conditions. For excised organs, use a plastic Petri dish with wet paper towels.Using this method, fluorescein dye was delivered to Arabidopsis leaves. Images taken at different time points, showed that the fluorescein dye was observed immediately after delivery. Similarly, delivery of a plasmid containing yellow fluorescent protein was achieved in Arabidopsis leaves.