حصلت آنا جيمين تشوي على دعم من راتب من برنامج الدكتوراه الدولي بجامعة باستور - باريس (PPU).

تحضير عينة عالية الجودة لتحليل الجينوم Multiome 10X

<ol>
	<li>Clark, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=scNMT-seq+enables+joint+profiling+of+chromatin+accessibility+DNA+methylation+and+transcription+in+single+cells.">scNMT-seq enables joint profiling of chromatin accessibility DNA methylation and transcription in single cells.</a> Nature Communications. 9 (1), 781 (2018).</li><li>Lee, J., Hyeon, D. Y., Hwang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+multiomics:+technologies+and+data+analysis+methods.">Single-cell multiomics: technologies and data analysis methods.</a> Experimental &amp; Molecular Medicine. 52 (9), 1428-1442 (2020).</li><li>Cerrizuela, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+scNMT+protocol+for+multiomics+profiling+of+single+cells+from+mouse+brain+and+pancreatic+organoids.">High-throughput scNMT protocol for multiomics profiling of single cells from mouse brain and pancreatic organoids.</a> STAR Protocols. 3 (3), 101555 (2022).</li><li>Dimitriu, M. A., Lazar-Contes, I., Roszkowski, M., Mansuy, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+multiomics+techniques:+From+conception+to+applications.">Single-cell multiomics techniques: From conception to applications.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 854317 (2022).</li><li>Stoeckius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+epitope+and+transcriptome+measurement+in+single+cells.">Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells.</a> Nature Methods. 14 (9), 865-868 (2017).</li><li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Joint profiling of chromatin accessibility and gene expression in thousands of single cells. 361 (6409), 1380-1385 (2018).</li><li>Narayanan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclei+Isolation+from+Fresh+Frozen+Brain+Tumors+for+Single-Nucleus+RNA-seq+and+ATAC-seq.Journal+of+Visualized+Experiments.">Nuclei Isolation from Fresh Frozen Brain Tumors for Single-Nucleus RNA-seq and ATAC-seq.Journal of Visualized Experiments.</a> JoVE. 162, 61542 (2020).</li><li>Kim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-nucleus+transcriptomics+reveals+functional+compartmentalization+in+syncytial+skeletal+muscle+cells.">Single-nucleus transcriptomics reveals functional compartmentalization in syncytial skeletal muscle cells.</a> Nature Communications. 11 (1), 6375 (2020).</li><li>Santos, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+and+sequencing+of+single+nuclei+from+murine+skeletal+muscles.">Extraction and sequencing of single nuclei from murine skeletal muscles.</a> STAR Protocols. 2 (3), 100694 (2021).</li><li>Safabakhsh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+nuclei+from+frozen+human+heart+tissue+for+single-nucleus+RNA+sequencing.">Isolating nuclei from frozen human heart tissue for single-nucleus RNA sequencing.</a> Current Protocols. 2 (7), (2022).</li><li>Lau, S. -. F., Cao, H., Fu, A. K. Y., Ip, N. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-nucleus+transcriptome+analysis+reveals+dysregulation+of+angiogenic+endothelial+cells+and+neuroprotective+glia+in+Alzheimer's+disease.">Single-nucleus transcriptome analysis reveals dysregulation of angiogenic endothelial cells and neuroprotective glia in Alzheimer's disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (41), 25800-25809 (2020).</li><li>Armand, E. J., Li, J., Xie, F., Luo, C., Mukamel, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+sequencing+of+brain+cell+transcriptomes+and+epigenomes.">Single-cell sequencing of brain cell transcriptomes and epigenomes.</a> Neuron. 109 (1), 11-26 (2021).</li><li>Morabito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-nucleus+chromatin+accessibility+and+transcriptomic+characterization+of+Alzheimer's+disease.">Single-nucleus chromatin accessibility and transcriptomic characterization of Alzheimer's disease.</a> Nature Genetics. 53 (8), 1143-1155 (2021).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+resolved+transcriptomics+reveals+genes+associated+with+the+vulnerability+of+middle+temporal+gyrus+in+Alzheimer's+disease.">Spatially resolved transcriptomics reveals genes associated with the vulnerability of middle temporal gyrus in Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica Communications. 10 (1), (2022).</li><li>Paul, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+heterogeneity+and+lineage+commitment+in+myeloid+progenitors.">Transcriptional heterogeneity and lineage commitment in myeloid progenitors.</a> Cell. 163 (7), 1663-1677 (2015).</li><li>Kaufmann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BCG+educates+hematopoietic+stem+cells+to+generate+protective+innate+immunity+against+tuberculosis.">BCG educates hematopoietic stem cells to generate protective innate immunity against tuberculosis.</a> Cell. 172 (1-2), 176-190 (2018).</li><li>Christ, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=diet+triggers+NLRP3-dependent+innate+immune+reprogramming.">diet triggers NLRP3-dependent innate immune reprogramming.</a> Cell. 172 (1-2), 162-175 (2018).</li><li>Moorlag, S. J. C. F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-Glucan+Induces+protective+trained+immunity+against+mycobacterium+tuberculosis+infection:+A+key+role+for+IL-1.">&#946;-Glucan Induces protective trained immunity against mycobacterium tuberculosis infection: A key role for IL-1.</a> Cell Reports. 31 (7), 107634 (2020).</li><li>de Laval, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C/EBP&#946;-dependent+epigenetic+memory+induces+trained+immunity+in+hematopoietic+stem+cells.">C/EBP&#946;-dependent epigenetic memory induces trained immunity in hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 26 (5), 657-674 (2020).</li><li>Renthal, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+human+mosaic+Rett+syndrome+brain+tissue+by+single-nucleus+RNA+sequencing.">Characterization of human mosaic Rett syndrome brain tissue by single-nucleus RNA sequencing.</a> Nature Neuroscience. 21 (12), 1670-1679 (2018).</li><li>Yang, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+brain+vascular+atlas+reveals+diverse+mediators+of+Alzheimer's+risk.">A human brain vascular atlas reveals diverse mediators of Alzheimer's risk.</a> Nature. 603 (7903), 885-892 (2022).</li><li>Lee, D. R., Zhang, Y., Rhodes, C. T., Petros, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+single-cell+and+single-nuclei+suspensions+from+embryonic+and+adult+mouse+brains.">Generation of single-cell and single-nuclei suspensions from embryonic and adult mouse brains.</a> STAR Protocols. 4 (1), 101944 (2022).</li><li>Corces, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage-specific+and+single-cell+chromatin+accessibility+charts+human+hematopoiesis+and+leukemia+evolution.">Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution.</a> Nature Genetics. 48 (10), 1193-1203 (2016).</li><li>Ranzoni, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+single-cell+RNA-seq+and+ATAC-seq+analysis+of+human+developmental+hematopoiesis.">Integrative single-cell RNA-seq and ATAC-seq analysis of human developmental hematopoiesis.</a> Cell Stem Cell. 28 (3), 472-487 (2021).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=10X+Genomics+Chromium+Next+GEM+Single+Cell+Multiome+ATAC+++Gene+Expression+User+Guide.">10X Genomics Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression User Guide.</a> Document Number CG000338 Rev F. At. , (2022).</li><li>J, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdissection+of+mouse+brain+into+functionally+and+anatomically+different+regions.">Microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. 168, 61941 (2021).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 10X Genomics 10X Genomics Demonstrated Protocol - Nuclei Isolation for Single Cell Multiome ATAC + GEX sequencing (CG000365 - Rev C). At. , (2022).</li><li>Haag, S., Murthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+monocyte+and+macrophage+culture.">Murine monocyte and macrophage culture.</a> Bio-Protocol. 11 (6), (2021).</li><li>Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., L&#246;nnberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+single-cell+RNA-sequencing+for+biomedical+research+and+clinical+applications.">A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications.</a> Genome Medicine. 9 (1), (2017).</li><li>Jiang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+control+of+single-cell+RNA-seq.">Quality control of single-cell RNA-seq.</a> Methods in Molecular Biology. , 1-9 (1935).</li><li>Regan, C., Preall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+considerations+for+single-cell+genomics.">Practical considerations for single-cell genomics.</a> Current Protocols. 2 (8), (2022).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 10X Genomics 10X Genomics Demonstrated Protocol - Nuclei Isolation for Single Cell ATAC Sequencing (CG000169 - Rev E). At. , (2022).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=10X+Genomics+10X+Genomics+Demonstrated+Protocol+-+Nuclei+Isolation+from+Complex+Tissues+for+Single+Cell+Multiome.">10X Genomics 10X Genomics Demonstrated Protocol - Nuclei Isolation from Complex Tissues for Single Cell Multiome.</a> ATAC + Gene Expression Sequencing. (CG000375 - Rev C). At. , (2022).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 10X Genomics 10X Genomics - Chromium Nuclei Isolation Kit (CG000505 - Rev A). AT. , (2022).</li><li>Shomroni, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+single-cell+RNA-sequencing+approach+and+its+applicability+connecting+genotype+to+phenotype+in+ageing+disease.">A novel single-cell RNA-sequencing approach and its applicability connecting genotype to phenotype in ageing disease.</a> Scientific Reports. 12 (1), 4091 (2022).</li><li>Oca&#241;as, S. R., Pham, K. D., Blankenship, H. E., Machalinski, A. H., Chucair-Elliott, A. J., Freeman, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimizing+the+ex+vivo+confounds+of+cell-isolation+techniques+on+transcriptomic+and+translatomic+profiles+of+purified+microglia.">Minimizing the ex vivo confounds of cell-isolation techniques on transcriptomic and translatomic profiles of purified microglia.</a> 9 (2), 0348-0321 (2022).</li><li>G&#233;rard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+single-cell+activity-based+screening+and+sequencing+of+antibodies+using+droplet+microfluidics.">High-throughput single-cell activity-based screening and sequencing of antibodies using droplet microfluidics.</a> Nature Biotechnology. 38 (6), 715-721 (2020).</li><li>Vandereyken, K., Sifrim, A., Thienpont, B., Voet, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+and+applications+for+single-cell+and+spatial+multi-omics.">Methods and applications for single-cell and spatial multi-omics.</a> Nature Reviews. Genetics. 24, 494-515 (2023).</li></ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

يعد تحضير معلق خلية أو نوى عالي الجودة ذا أهمية حاسمة لنجاح تحليل RNA-Seq أحادي الخلية أو أحادي النوىوتحليلات متعددة الخلايا أحادية الخلية 29،30،31. هنا ، وصفنا بروتوكولات تحضير العينات وعزل النوى لمقايسات multiome من نوعين من الأنسجة: الدماغ ونخاع العظام.
يسمح بروتوكول الدماغ الموصوف في هذه الورقة باستعادة نوى عالية الجودة من أنسجة المخ الطازجة المجمدة. ويشمل الخطوات التالية: تعطيل الأنسجة المجمدة ، وعزل النوى ، وتنقية النوى ، ومراقبة جودة المواد المحضرة. يتكون نسيج المخ من العديد من أنواع الخلايا المختلفة ، ويجب أن يحافظ إجراء تفكك الأنسجة وعزل النوى على نسب مجموعات الخلايا الموجودة في الأنسجة الأولية. هنا ، تم تحسين تكوين المخزن المؤقت للتحلل ووقت الحضانة لتمكين التحلل الكامل واللطيف لجميع مجموعات الخلايا التي تشكل الأنسجة.
يختلف بروتوكول HSPCs لنخاع العظم إلى حد ما لأنه يتطلب خطوة إضافية واحدة في بداية التجربة لعزل مجموعة الخلايا ذات الأهمية من تعليق خلوي غير متجانس. بعد جمع الأنسجة الطازجة ، يتم تحليل خلايا الدم الحمراء ، ويتم إثراء العينة لمجموعة فرعية من الخلايا ذات الأهمية. يتم تحليل الخلايا المستهدفة ، ويتم عزل النوى ، ويتم التحكم في جودة المواد المعدة.
يوفر 10X Genomics العديد من البروتوكولات التي تم التحقق من صحتها لعزل النوى في العديد من الأنسجة المختلفة32,33. تقوم الشركة أيضا بتسويق مجموعة عزل النوى مع خط أنابيب مباشر لعزل النوى من الأنسجة التي تم التحقق من صحتها34. ومع ذلك ، تحتاج هذه البروتوكولات إلى تحسين إضافي لتكييف خصوصيات عينات معينة. مثال على ذلك هو العينات التي تتطلب العمل مع إدخال خلية منخفضة. بالنسبة لهذه العينات ، فإن الخطوات الأكثر تحديا هي أجهزة الطرد المركزي التي يجب أن تكون صارمة بما يكفي لتنظيف العينة ولطيفة بما يكفي لتجنب فقدان الخلية / النوى. باستخدام البروتوكول الموضح هنا ، قمنا بتكييف بروتوكول 10X Genomics الموضح - عزل النوى لتسلسل ATAC + GEX متعدد الخلية أحادي الخلية (CG000365 - Rev C) 27 لإيجاد توازن دقيق بين هذين المتطلبين. كما هو موضح في مثال تحضير النوى من HSPCs المصنفة ، قمنا بتحسين استعادة النوى دون أي تأثير على جودة العينة.
التحدي الإضافي هو خطوة تحلل الخلايا النقية لعزل النوى. يمكن أن تؤدي ظروف التحلل الأكثر قسوة وأوقات الحضانة الأطول إلى إتلاف النوى وبالتالي التأثير على جودة بيانات التسلسل. يوضح الشكل 5 تصوير النوى التمثيلية من عينات نخاع العظم في أوقات حضانة مختلفة باستخدام مخزن التحلل، ويوضح مدى اختلاف حالة النوى اعتمادا على تحلل الخلية. في مثال HSPCs ، حددنا تحلل 3 دقائق كحالة تؤدي إلى أعلى نسبة من النوى السليمة ذات المظهر الصحي وأقل نسبة من النوى التالفة. يجب تحسين أوقات حضانة التحلل لكل نوع جديد من العينات.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65715/65715fig05.jpg"> الشكل 5: مراقبة جودة النوى عن طريق الفحص المجهري. تظهر صور برايت فيلد تمثيلية لنوى معزولة من نخاع عظم الفأر مع (أ) سليمة و (ب) نوى تالفة. مقياس الرسم 5 ميكرومتر. تم التقاط الصور باستخدام مجهر مقلوب باستخدام هدف 40x ELWD NA 0.60 وتقريب رقمي 1.5x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65715/65715fig05large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
يعتمد كلا البروتوكولين المفصلين في هذا العمل على تنقية الخلايا أو النوى المستهدفة بواسطة أدوات FACS عالية الإنتاجية. هذه الخطوة ذات أهمية حاسمة لبروتوكولات تحضير الخلية الواحدة / النوى حيث يتم عزل مجموعات فرعية نادرة من الخلايا من المعلقات غير المتجانسة. في هذه ، كما هو الحال في المثال الموضح هنا لفرز HSPCs ، قد تكون هناك حاجة إلى لوحة قياس التدفق الخلوي عالية الأبعاد لتمكين "البوابة" على مجموعة الخلايا ذات الأهمية. الفرز سريع ودقيق للغاية ، مما يؤدي إلى نقاء أكثر من 95٪ من المجموعات الفرعية للخلايا التي تم فرزها. يعرض هذا النهج التعليق الخلوي لضغط يصل إلى 70 رطل لكل بوصة مربعة ، وبالتالي قد يكون مقيدا لفرز الخلايا الهشة (على سبيل المثال ، الخلايا المتغصنة ، العدلات) لأنه قد يتسبب في تمزق غشاء الخلية. وفي هذه الحالات، ينبغي اختيار حلول بديلة للتنقية الخلوية، بما في ذلك الفرز المغناطيسي، وتطبيق أدوات الجيل الجديد (مثل CellenOne، وCellenion؛ وCellenion؛ وCellenion). MACSQuant Tyto، Miltenyi)35,36، أو الأنظمة القائمة على القطيرات (على سبيل المثال، ODIN، Sensific)37. ومع ذلك ، فإن سرعة الفرز البطيئة لهذه التقنيات ، مع فرز الخلايا الذي يستمر لساعات بدلا من دقائق ، هو عامل مقيد قوي لتطبيق هذه الأساليب في إعداد خلايا قابلة للحياة ل Multiome وغيرها من تطبيقات الخلية المفردة بناء على تحليل أعداد الخلايا الكبيرة.
لتنقية النوى المعزولة من الأنسجة ، FACS هي الطريقة المفضلة بسبب إنتاجيتها ونقاء المادة المعزولة. النوى ليست حساسة للضغط ، ويمكن بسهولة تنقية عزلات الأنسجة المفلترة من خلال فارز الخلايا. وإذا لم يكن المختبر مجهزا بأداة من أدوات نظام مراقبة الأصول الميدانية، توجد بدائل أخرى، أقل كفاءة إلى حد ما ولكنها جيدة بما فيه الكفاية. ومن الأمثلة على ذلك الطرد المركزي الفائق أو استخدام معدات صغيرة مثل MARS (الخلية التطبيقية) التي تفصل الجسيمات بناء على اختلافها في الحجم ، باستخدام الموجات الصوتية. غسالة CURIOX الصفائحية التي تستخدم خصائص كارهة للماء لمعلقات الخلية / النوى ؛ أو LEVITAS bio الذي يعتمد على الخصائص الفيزيائية للخلايا (الرفع) لفصلها عن الحطام.
هنا ، نصف البروتوكولات للحصول على عدد كبير من النوى وأفضل نقاء لبروتوكول Multiome النهائي. ويؤدي فرز نظام مراقبة الأصول الميدانية وخطوات الطرد المركزي المتكررة إلى خسارة كبيرة في المواد الأولية. لهذا السبب ، في بروتوكول تحضير النوى من الدماغ الذي نصفه هنا يتطلب مواد أولية وفيرة بما فيه الكفاية لينتج عنها جمع ما لا يقل عن 500000 نواة بعد فرز FACS. يجب تطبيق بروتوكولات بديلة إذا لم يكن من الممكن مطابقة هذا المعيار. عند العمل مع مجموعات الخلايا النادرة أو أقسام الأنسجة الصغيرة ، يمكن أن تكون الكمية المتاحة من المواد الأولية عاملا مقيدا. لمعالجة هذه المشكلة ، من الممكن تحسين استعادة النوى عن طريق (أ) تقليل حجم التحلل ، (ب) تقليل حجم الغسيل ، (ج) استخدام غسلة واحدة مع وقت طرد مركزي ممتد لمحاولة تحسين الاسترداد كما هو موضح في بروتوكولات الجينوم 10X لعزل نوى مدخلات الخلايا المنخفضة. بالنسبة للتحليل متعدد الألوان للمواد منخفضة المحتوى ، يجدر النظر في التطبيقات القائمة على الألواح مثل scNMT و SNARE-seq و Paired-seq38 التي تتطلب عينات إدخال أقل بكثير.
باختصار ، لقد وصفنا بروتوكولين قويين لإعداد النوى من الدماغ ونخاع العظم HSPCs لتحليل Multiome في اتجاه مجرى النهر. هذه البروتوكولات قابلة للتطبيق في أي مشروع علمي يتطلب معلقات نوى مفردة عالية الجودة من هذين النوعين من الأنسجة ، بغض النظر عن السؤال العلمي المطروح. تقوم مجموعتنا بتطبيق بروتوكول عزل نوى الدماغ في دراسات نمو الدماغ عند تعطيل مختلف الجينات المستهدفة وفي دراسات الاستجابة المناعية في سياق الأمراض العصبية. نحن نستخدم بروتوكول عزل نوى نخاع العظم لفك رموز مشاركة مختلف المجموعات السكانية الفرعية المكونة للدم في إنشاء جهاز المناعة.

لسنوات عديدة ، كانت تقنيات الخلية الواحدة هي المعيار الذهبي لتحليل العمليات البيولوجية. كانت تقتصر في البداية على التنميط الظاهري أحادي الخلية من خلال الفحص المجهري وقياس التدفق الخلوي والمقايسات المماثلة. جاء اختراق في تحليل الخلية الواحدة مع تطوير مناهج التنميط الجزيئي أحادي الخلية ، ولا سيما تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-Seq) الذي مكن من توصيف النسخ الكامل للخلايا الفردية. قوي للغاية ، يولد scRNA-Seq معلومات حول حالة النسخ للخلية في حالة ونقطة زمنية معينة. ومع ذلك ، فإنه لا يوفر رؤية حول تنظيم الجينات الذي يدفع النسخ ، أو على التعديلات الجزيئية التي تحدث بمرور الوقت. للتغلب على هذا القيد ، تم استثمار العديد من الجهود في تطوير مقايسات متعددة الخلايا أحادية الخلية تمكن من تحليل عوامل وعمليات متعددة من نفس الخلية1،2،3،4. جاء أول قياس ناجح لطريقتين داخل الخلايا المفردة من خلال ربط أنماط تعبير البروتين السطحي المتعدد مع النسخ الكامل للخلايا الفردية في نهج CITE-Seq5. تجمع التطورات الحديثة بين التعبير الجيني وإمكانية الوصول إلى الكروماتين (فحص الكروماتين الذي يمكن الوصول إليه باستخدام التسلسل ، ATAC-Seq) ، وبالتالي التقاط طرائق النسخ وفوق الجينوم في نفس الخلايا في نفس الخلايا (على سبيل المثال ، sci-CAR) 6. جاءت الحلول التجارية الأولى التي سمحت بربط النسخ بالنمط الظاهري للخلية أو بالتغيرات اللاجينية لنفس الخلية من 10X Genomics.
تحتوي تجارب التنميط الجزيئي أحادي الخلية على الخطوات التالية: (1) تفكك الأنسجة أو تحضير معلقات أحادية الخلية. (2) تنقية الخلايا و / أو عزل النوى ؛ (3) التقسيم والترميز الشريطي ؛ (4) بناء المكتبة ومراقبة الجودة ؛ (5) تسلسل الجيل التالي ؛ (6) تحليل البيانات. في حين أن الخطوات (3) - (6) قد تختلف اختلافا كبيرا اعتمادا على التكنولوجيا المستخدمة ، فإن الخطوات الأولية مشتركة بشكل عام مع كل منهم. ستحدد جودة تعليق الخلية / النوى المحضرة النتيجة الإجمالية للتجربة. اعتمادا على نوع الأنسجة ، قد يكون الحصول على معلقات أحادية الخلية / نوى عالية الجودة أمرا صعبا. تتطلب خصوصيات بعض الأنسجة ، مثل القلب والعضلات والدماغ والرئة والأمعاء وغيرها ، طرقا لتعطيل الأنسجة وعزل النوى تتكيف مع كل نوع من العينات من أجل ضمان إنتاج نوى عالية الجودة للتحليل الجزيئي7،8،9،10. يمكن أن تكون طرق تعطيل الأنسجة وبروتوكولات التفكك ميكانيكية أو إنزيمية (على سبيل المثال ، مزيج من الكولاجين و DNase) ، أو مزيج من الاثنين ، ويمكن إجراؤها يدويا أو بواسطة أدوات (على سبيل المثال ، Qiagen DSC-400 ، gentleMACS).
أصبحت تقنيات الخلية الواحدة أداة مفضلة للبحوث الطبية الحيوية. في علم الأعصاب ، يتطلب تنوع الخلايا في الدماغ وتعقيد وظائفها تحليلا عالي الدقة وعالي الإنتاجية لتصور مجموعات الخلايا النادرة ولتقييم عدم تجانسها11،12،13،14. يوفر ربط الهوية الخلوية والآليات التنظيمية الجينية للخلايا الفردية نظرة ثاقبة لنمو الدماغ وعلم وظائف الأعضاء. مثال آخر هو دراسات الاستجابة المناعية في سياق الأمراض المعدية أو المناعة الذاتية أو السرطان ، والتي تعتمد بشدة على تحليلات الخلية الواحدة. يتطلب عدم تجانس المجموعات الفرعية للخلايا المناعية وتعقيد نشاطها وتفاعلاتها مع أنواع الخلايا الأخرى دقة خلية واحدة في فك رموز الآليات الكامنة وراء الاستجابة المناعية. تنشأ الخلايا المناعية من نخاع العظم ، حيث تتكون الأسلاف المكونة للدم من خلايا متمايزة تدريجيا تكتسب وتفقد علامات سطح الخلية خلال عملية تدريجية قبل الخروج من نخاع العظم إلى المنزل في المحيط. يسمح تحليل الخلية الواحدة بالتوصيف الدقيق لمراحل النمو الخلوي. يمكن تحقيق ذلك من خلال التنميط الظاهري أحادي الخلية ، والذي يتم إجراؤه تقليديا بواسطة قياس التدفق الخلوي متعدد المعلمات. ومع ذلك ، فقد ثبت أن التوقيعات النسخية أحادية الخلية تكشف عن تحديد أكثر دقة للأنواع الفرعية للخلايا السلفية نظرا لأن هذه الخلايا موزعة في مجموعات تقع في بعضها البعض وبالتالي يمكن التعرف عليها بشكل خاطئ عند استخدام نهج علامة سطح الخليةالخشنة 15. يكشف عدد متزايد من الدراسات عن التعديلات اللاجينية التي يمكن أن تكتسبها الخلايا الجذعية والسلفية المكونة للدم (HSPCs) من التعرض لعوامل مختلفة ، مما يؤدي إلى تأثير كبير على الاستجابة طويلة المدى لجهاز المناعة16،17،18،19. تتيح تقنيات multi-omics الجديدة دراسة هذه العمليات بدقة خلية واحدة.
تم وصف العديد من بروتوكولات عزل الخلايا والنوى للدماغ11،20،21،22 وعينات نخاع العظم23،24. لتقليل التحيز بسبب التباين التجريبي ، من الضروري التحقق من صحة بروتوكولات تحضير النوى المفردة المحسنة للتسلسل النسخي وفوق الجيني المشترك أحادي الخلية ، وبالتالي ضمان قابلية استنساخ المقايسات متعددة الخلايا أحادية الخلية.
هنا ، يتم وصف بروتوكولين قويين لإعداد النوى من (1) أنسجة المخ المجمدة الطازجة و (2) HSPCs لنخاع العظم الطازج لتحليل Multiome أحادي الخلية في المصب (الشكل 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65715/65715fig01.jpg"> الشكل 1: تمثيل تخطيطي لبروتوكولات عزل النوى من أنسجة الدماغ ونخاع العظم المجمدة حديثا. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65715/65715fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 G x 1 &#189; (1.2 mm x 38 mm) Agani needles</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>AN*1838S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL round bottom FACS tube with cell strainer cap 35 &#181;m</td>
			<td>falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-AAD</td>
			<td>BD pharmagen</td>
			<td>559925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10492-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD117 (c-Kit)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>105812</td>
			<td>Clone: 2B8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cyanine 7 anti-mouse CD16/32 (Fc&#947;R)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101328</td>
			<td>Clone: 93</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria III</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>non-applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva Software v8.0.1</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>non-applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin&#160; stock solution 10%</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell staining buffer</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Suprplan Fluor ELWD 40XC ON 0.6</td>
			<td>Nikon&#160;</td>
			<td>non-applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMOS camera Prime 95B 25 mm</td>
			<td>Photometrix</td>
			<td>non-applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AMQAF1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess cell counting chamber slide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass 24 mm x 24 mm 0.13-0.17 mm</td>
			<td>Brand</td>
			<td>BR470819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonine 5%</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>BN2006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpels&#160;</td>
			<td>Swann-Morton&#160;</td>
			<td>0508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (1x) + GlutaMAX-I</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31966-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14200-067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>646563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence inverted microscope Nikon Ti2 -E</td>
			<td>Nikon&#160;</td>
			<td>non-applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes 0.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30123603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83801.290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse CD34</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11-0341-85</td>
			<td>Clone: RAM34</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps for dissection</td>
			<td>FST</td>
			<td>11152-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11533387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce Homogeniser 2 mL</td>
			<td>Bellco glass</td>
			<td>1984-10002</td>
			<td>Pestle &#8220;A&#8221; Large Clearance: .0030-.0050&#8243; and Pestle &#8220;B&#8221; Small Clearance: .0005-.0025&#8243;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD fixable aqua dead cell stain kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L34957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride solution 1 M</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium Fluoromount-G&#160;</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>00-4958-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P40 substitute</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free water</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td>AM9932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei buffer 20x&#160;</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>2000153/2000207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei isolation kit EZ prep</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>NUC-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneComp eBeads compensation beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>01-1111-41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-mouse lineage cocktail 
			(including anti-mouse CD3, Ly-6G/Ly-6C, CD11b, CD45R/B220, TER-119)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>133310</td>
			<td>Clones (in the same order as the antibodies listed): 17A2, RB6-8C5, M1/70, RA3-6B2, Ter-119</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Tube Strips 0.2 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951010022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>122507</td>
			<td>Clone: E13-161.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 100 mm x 20 mm OPTILUX</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ply-L-lysine 0.01% sterile-filtered suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Printed microscope slides 8 well 6 mm numbered</td>
			<td>Epredia</td>
			<td>ER-301B-CE24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind Tubes 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rnase inhibitor 5000 U</td>
			<td>Takara</td>
			<td>2313A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors for dissection</td>
			<td>FST</td>
			<td>14090-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride solution 5 M</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>59222C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filters, PES, 0.2 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15206869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent nail polish&#160;</td>
			<td>any</td>
			<td>non-applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Hydrochloride solution pH 7.4</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>T2194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue 0.4%</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Biorad&#160;</td>
			<td>1662404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Distilated Water Dnase/Rnase Free</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-035</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-quality brain and bone marrow nuclei preparation for single nuclei multiome assays

أصبح تحليل الخلية الواحدة هو النهج المفضل لكشف تعقيد العمليات البيولوجية التي تتطلب تقييم تباين الاستجابات الخلوية الفردية للعلاج أو العدوى بدقة خلية واحدة. 
تم تطوير العديد من التقنيات للتنميط الجزيئي أحادي الخلية على مدى السنوات ال 10 الماضية ، وتم تسويق العديد من التقنيات المخصصة. يعد التنميط أحادي الخلية القائم على قطرات 10X Genomics تقنية واسعة الانتشار توفر كواشف جاهزة للاستخدام للتنميط أحادي الخلية النسخي ومتعدد الأوميك. تتضمن التقنية سير العمل لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية وأحادي النوى (scRNA-Seq و snRNA-Seq ، على التوالي) ، scATAC-Seq ، التنميط المناعي أحادي الخلية (تسلسل BCR / TCR) ، و multiome. يجمع الأخير بين النسخ (scRNA-Seq) والمعلومات اللاجينية (scATAC-Seq) القادمة من نفس الخلية. 
تعد جودة (الجدوى والسلامة والنقاء) للمعلقات أحادية الخلية أو أحادية النوى المعزولة من الأنسجة وتحليلها بواسطة أي من هذه الأساليب أمرا بالغ الأهمية لتوليد بيانات عالية الجودة. لذلك ، يجب تكييف بروتوكولات تحضير العينات مع خصوصيات كل نسيج بيولوجي وضمان توليد معلقات عالية الجودة للخلايا والنوى.
توضح هذه المقالة بروتوكولين لإعداد عينات الدماغ ونخاع العظام لخط أنابيب Multiome 10X Genomics في اتجاه مجرى النهر. يتم تنفيذ البروتوكولات بشكل تدريجي وتغطي تفكك الأنسجة ، وفرز الخلايا ، وعزل النوى ، ومراقبة جودة تعليق النوى المحضر الذي يستخدم كمواد أولية لتقسيم الخلايا والترميز الشريطي وإعداد المكتبة والتسلسل. تنتج هذه البروتوكولات الموحدة مكتبات نوى عالية الجودة وبيانات قوية وموثوقة.

For many years, single-cell techniques have been the gold standard for the analysis of biological processes. They were initially restricted to single-cell phenotyping through microscopy, flow cytometry, and similar assays. A breakthrough in single-cell analysis came with the development of approaches for single-cell molecular profiling, in particular single-cell RNA sequencing (scRNA-Seq) that enabled characterizing the entire transcriptome of individual cells. Highly powerful, scRNA-Seq generates information about the transcriptional status of a cell in a specific condition and time point. However, it does not provide visibility on the gene regulation that drives transcription, or on the molecular modifications that occur over time. To overcome this limitation, many efforts have been invested in the development of single-cell multi-omics assays that enable the analysis of multiple factors and processes from the same cell1,2,3,4. The first successful measurement of two modalities within single cells came through linking multiplex surface protein expression patterns with the full transcriptome of individual cells in the CITE-Seq approach5. More recent evolutions combine gene expression with chromatin accessibility (Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing, ATAC-Seq), thereby simultaneously capturing transcriptomic and epigenomic modalities in the same cells (e.g., sci-CAR)6. The first commercial solutions that allowed associating transcriptomics with cell phenotype or with epigenetic changes of the same cell came from 10X Genomics.
Experiments for single-cell molecular profiling contain the following steps: (1) tissue dissociation or preparation of single-cell suspensions; (2) cell purification and/or nuclei isolation; (3) partitioning and barcoding; (4) library construction and quality control; (5) next-generation sequencing; (6) data analysis. While steps (3)-(6) may significantly vary depending on the technology employed, the initial steps are generally common to all of them. The quality of the prepared cell/nuclei suspension will determine the overall outcome of the experiment. Depending on the type of tissue, obtaining high-quality single-cell/nuclei suspensions may be challenging. The particularities of some tissues, such as the heart, the muscle, the brain, the lung, the intestine, and others, require methods for tissue disruption and nuclei isolation adapted to each type of sample in order to guarantee the production of high-quality nuclei for molecular analysis7,8,9,10. The tissue disruption methods and dissociation protocols can be mechanical, enzymatic (e.g., a mix of collagenases and DNase), or a combination of the two, and can be performed manually or by instruments (e.g., Qiagen DSC-400, gentleMACS).
Single-cell techniques have become a tool of choice for biomedical research. In neurobiology, the cell diversity in the brain and the complexity of their functions require high-resolution and high-throughput analysis for visualization of rare cell populations and for assessing their heterogeneity11,12,13,14. Linking cellular identity and gene regulatory mechanisms of individual cells provides insights into brain development and physiology. Another example is studies of immune response in the context of infectious, autoimmune, or cancer diseases, which strongly rely on single-cell analyses. The heterogeneity of immune cell subsets and the complexity of their activity and interactions with other cell types require single-cell resolution in deciphering the mechanisms underlying immune response. The immune cells originate from the bone marrow, where hematopoietic progenitors are composed of gradually differentiating cells that acquire and lose cell surface markers throughout a stepwise process prior to exiting the bone marrow to home in the periphery. Single-cell analysis allows for minute characterization of cellular developmental stages. It can be achieved through single-cell phenotyping, conventionally performed by multi-parameter flow cytometry. However, single-cell transcriptomic signatures have been shown to reveal a more precise identification of progenitor cell subtypes since these cells are distributed in clusters that fall into one another and can therefore be misidentified when using a coarse cell surface marker approach15. An increasing number of studies uncover the epigenetic modifications that hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) can acquire from exposure to various agents, leading to a significant impact on the long-term responsiveness of the immune system16,17,18,19. The novel multi-omics technologies enable studying these processes with single-cell resolution.
Many protocols for cell and nuclei isolation have been described for brain11,20,21,22 and bone marrow samples23,24. To minimize bias due to experimental variability, it is necessary to validate optimized single-nuclei preparation protocols for joint single-cell transcriptomic and epigenomic sequencing, thereby ensuring the reproducibility of single-cell multiomic assays.
Here, two robust protocols for nuclei preparation from (1) fresh-frozen brain tissue and (2) fresh bone marrow HSPCs for downstream single-cell Multiome analysis are described (Figure 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65715/65715fig01.jpg" /> 
Figure 1: Schematic representation of protocols for nuclei isolation from fresh-frozen brain and bone marrow tissues. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65715/65715fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

تسليط الضوء على المؤلف: تطوير البحوث الطبية الحيوية من خلال تحليل الخلية الواحدة 

تحضير نوى الدماغ ونخاع العظم عالي الجودة لمقايسات النوى المتعددة أحادية النوى

The Cytometry and Biomarkers Technology Unit supports biomedical projects through state-of-the-art technologies and pipelines for cell phenotyping and molecular profiling with single-cell resolution. In this context, we use different tools for single-cell multiomic analysis to obtain insights into gene expression and gene regulation in health and disease. Flow cytometry identify and source individual cells based on unique characteristic.Recent advance include high-throughput, image-based spectral sorters, and those technology offer flexibility in panel design, enable simultaneous use of similar dyes, and the managing of autofluorescence. A major experimental challenge when using cutting-edge, single-cell technologies is working with particularly fragile or rare cell populations. Each tissue or cell type needs to undergo fine-tuned protocol optimization to obtain enough highly viable cells that translate into high-quality sequencing data.Our modified single nuclei preparation protocol improves nuclei recovery and minimizes stress on the nuclei. It is specifically optimized for brain and bone marrow tissues and covers all the steps from sample dissociation to nuclei purification.

يوضح البروتوكولان الموصوفان أعلاه عزل النوى بدءا من نوعين مختلفين من الأنسجة. يتم تمثيل الاختلافات والتشابهات بين البروتوكولين بشكل تخطيطي في الشكل 1.
تنقية النوى من دماغ الفأر في البروتوكول الموصوف هنا ، نقترح طريقة لطيفة لإعداد النوى من عينات الدماغ. يبدأ بتفكك ميكانيكي لأنسجة المخ في مخزن مؤقت للتحلل ، تليها خطوات الغسيل وتصفية المصفاة التي تزيل الأنسجة المتبقية من التعليق. يتم تحقيق الإزالة اللاحقة للحطام والخلايا غير المحللة والجسيمات الصغيرة بواسطة FACS لضمان تحميل النوى النقية فقط لبروتوكول Multiome النهائي. يوضح الشكل 2 صورة النوى قبل الفرز وبعده. بعد الترشيح وقبل فرز النوى ، تحتوي العينة على كمية عالية من الحطام ، مع أكثر من 99٪ من "المفردات" الإيجابية للبقع النووية (7-AAD) ، مما يشير إلى تحلل الخلية الأمثل (الشكل 2 أ). يتم فرز النوى بناء على البوابة الموجبة 7-AAD. يتم الحصول على جزء من المواد التي تم فرزها للتحقق من نقاء النوى المعدة. يوضح الشكل 2 ب ملف تعريف نوى الدماغ بعد الفرز. سمح فرز النوى بزيادة نقاء النوى من 36٪ الأولية (الشكل 2 أ) إلى ما يقرب من 100٪ (الشكل 2 ب).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65715/65715fig02.jpg"> الشكل 2: استراتيجية البوابات لفرز النوى واختبار النقاء بعد الفرز. تم تلطيخ النوى ب 7-AAD وتم الحصول عليها بواسطة فارز الخلية. (أ) يتم أولا بوابات النوى بناء على حجمها ودقتها (FSC-A و SSC-A ، على التوالي). ثم يتم اختيار الجسيمات المفردة بناء على خصائص FSC-A / FSC-H وتلطيخ 7-AAD. (ب) بعد فرز الخلايا، يختبر جزء من النوى من أنبوب التجميع للتأكد من نقائه باستخدام استراتيجية البوابات نفسها المستخدمة في الخيار (أ). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65715/65715fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
تنقية أسلاف الخلايا الجذعية المكونة للدم في نخاع عظم الفأر (HSPCs) عند العزل عن نخاع العظم ، يتم فرز ما يصل إلى 2 × 105 HSPCs بواسطة FACS ، وفقا لاستراتيجية البوابات الموضحة في الشكل 3A. يتم تقييم فعالية الفرز ونقاء العينة (الشكل 3 ب).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65715/65715fig03v2.jpg"> الشكل 3: استراتيجية البوابات لفرز HSPCs نخاع العظم. (أ) استراتيجية بوابة FACS تمثيلية لفرز الخلايا الجذعية المكونة للدم LKS + القابلة للحياة وأسلاف CD34 + النخاعية لعزل النوى. (ب) مخططات FACS التمثيلية المستخدمة للتحقق من نقاء مجموعات الخلايا المصنفة. تظهر نسب مجموعات الخلايا الفرعية المختلفة بالنسبة إلى المجتمع الأصلي. * السكان المصنفون. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65715/65715fig03largev2.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
يسمح بروتوكول "عزل نوى إدخال الخلايا المنخفضة" بعزل النوى من العينات بحد أقصى 105 خلايا. يتضمن عددا منخفضا من خطوات الطرد المركزي ، وبالتالي تقليل فقد الخلية / النوى. لقد قمنا بتعديل حجم التحلل وغسل المخازن المؤقتة بشكل متناسب مع مدخلات الخلية وزدنا وقت الطرد المركزي لاستعادة النوى إلى أقصى حد. لقد أجرينا تجربة تجريبية لتقييم كمية النوى المستعادة عن طريق العد وجودتها عن طريق قياس التدفق الخلوي والتصوير المجهري. يوضح الشكل 4 عينة HSPCs بعد تحلل الخلية. ولد هذا البروتوكول نوى عالية الجودة ، كما لوحظ في الشكل 5 أ ، دون أي حطام يمكن أن يؤثر على بروتوكول المصب متعدد الليومات.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65715/65715fig04.jpg"> الشكل 4: فرز اختبار نقاء نوى HSPC لنخاع العظم المعزول. تم تلطيخ النوى ب 7-AAD وتم الحصول عليها بواسطة فارز الخلية. تم إدخال النوى أولا بناء على حجمها ودقتها (FSC-A و SSC-A ، على التوالي) لتقييم نقاء العينة. يشار إلى نسبة النوى فيما يتعلق بالسكان الأصليين. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65715/65715fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>رقم الأنبوب</td>
			<td>اسم الأنبوب</td>
			<td>كيان ملطخ</td>
			<td>مقدار الكيان الملطخ</td>
			<td>الجسم المضاد / الصبغة (ميكرولتر)</td>
			<td>المخزن المؤقت للتجميع (ميكرولتر)</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>غير ملوثة</td>
			<td>خلايا</td>
			<td>5,00,000</td>
			<td>غير متوفر</td>
			<td rowspan="7">200</td>
		</tr><tr><td>2</td>
			<td>LIVE / DEAD قابل للإصلاح أكوا الخلايا الميتة وصمة عار</td>
			<td>خلايا</td>
			<td>5,00,000</td>
			<td>0.5</td>
		</tr><tr><td>3</td>
			<td>APC / سيانين 7 مضاد للماوس CD16 / 32 (FcγR)</td>
			<td>OneComp eBeads</td>
			<td>15 ميكرولتر</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>4</td>
			<td>المحيط الهادئ الأزرق مكافحة الماوس كوكتيل النسب</td>
			<td>OneComp eBeads</td>
			<td>15 ميكرولتر</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>5</td>
			<td>PE المضادة للماوس Ly-6A / E (SCA-1)</td>
			<td>OneComp eBeads</td>
			<td>15 ميكرولتر</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>6</td>
			<td>APC المضادة للماوس CD117 (c-Kit)</td>
			<td>OneComp eBeads</td>
			<td>15 ميكرولتر</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>7</td>
			<td>مكافحة الماوس FITC CD34</td>
			<td>OneComp eBeads</td>
			<td>15 ميكرولتر</td>
			<td>1</td>
		</tr></tbody></table>الجدول 1: ضوابط بقعة واحدة لإعدادات التعويض على مقياس التدفق الخلوي. يشار إلى عناصر التحكم المطلوبة في البقع المفردة ، وعدد الخلايا أو الخرزات المراد تلطيخها ، وكميات الأجسام المضادة.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>ماستر ميكس</td>
			<td>الكاشف</td>
			<td>التخفيف النهائي</td>
			<td>الجسم المضاد / الصبغة (ميكرولتر)</td>
			<td>نوع المخزن المؤقت</td>
			<td>العازلة (ميكرولتر)</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">ميكس 1</td>
			<td>APC / سيانين 7 مضاد للماوس CD16 / 32 (FcγR)</td>
			<td>1/500</td>
			<td>1.2</td>
			<td rowspan="2">دب ب س</td>
			<td rowspan="2">300</td>
		</tr><tr><td>LIVE / DEAD قابل للإصلاح أكوا الخلايا الميتة وصمة عار</td>
			<td>1/250</td>
			<td>2.4</td>
		</tr><tr><td rowspan="4">ميكس 2</td>
			<td>المحيط الهادئ الأزرق مكافحة الماوس كوكتيل النسب</td>
			<td>1/20</td>
			<td>30</td>
			<td rowspan="4">المخزن المؤقت FACS</td>
			<td rowspan="4">300</td>
		</tr><tr><td>PE المضادة للماوس Ly-6A / E (SCA-1)</td>
			<td>1/200</td>
			<td>3</td>
		</tr><tr><td>APC المضادة للماوس CD117 (c-Kit)</td>
			<td>1/200</td>
			<td>3</td>
		</tr><tr><td>مكافحة الماوس FITC CD34</td>
			<td>1/50</td>
			<td>12</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>إجمالي حجم التلوين</td>
			<td>600</td>
		</tr></tbody></table>الجدول 2: تكوين مزيج تلطيخ لنخاع العظم HSPCs. تظهر كميات الكواشف اللازمة لتلطيخ عينة واحدة تحتوي على 40 مليون خلية. لتلطيخ عدد أكبر من العينات ، اضرب الحجم المشار إليه في العدد المطلوب من العينات وأضف نصف حجم عينة إضافي لضمان حجم كاف من المزيج الرئيسي.
الشكل التكميلي 1: بروتوكول عزل خلايا نخاع العظم. أ: افتح الصفاق. تشير الخطوط المنقطة البيضاء إلى الخط الذي يجب قطعه. (ب) بعد تقشير الجلد من الساق الخلفية، قم بتبطين المقص على طول العمود الفقري عند مفصل الورك لقطع الساق دون قطع عظم الفخذ. ج: ظهور الساق منفصلة عن الجسم قبل استئصال العضلات. د: ظهور الساق بعد إزالة العضلات. ه: إجراء فصل عظم الفخذ عند مفصل الركبة، ثم عند مفصل الورك، مع الحرص على عدم فتح عظم الفخذ. تظهر الأسهم البيضاء المنحنية الحركة المطلوبة. تشير الأسهم المنقطة البيضاء إلى المنطقة المراد فصلها برفق باستخدام المقص للقرص. (و) إجراء لفتح الجزء البعيد من عظم الفخذ (أي الجزء المتصل سابقا بالساق عند مفصل الركبة) عن طريق الإمساك بإحكام بالغضروف والمشاش البعيد بالمقص وقلبه للخلف لكشف نخاع العظم. (ز) يجب أن تكون أربعة نتوءات ، يشار إليها بأسهم سوداء ، مرئية في نهاية الجسم المكشوف. (ح) ظهور عظم الفخذ مع توجيه الطرف المفتوح لأسفل في الأنبوب المحضر سعة 0.5 مل الموضوع داخل أنبوب سعة 1.5 مل يحتوي على 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول المعرضة للرقابة المالية. (I) ظهور خلايا نخاع العظم المحببة وعظم الفخذ الأبيض الآن بعد الطرد المركزي السريع عند 12000 × جم. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65715/Moraes-Cabe%20et%20al_Supplementary%20Figure1.pdf" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Advancing Biomedical Research Through Single Cell Analysis at JoVE.com

يعتمد نجاح النسخ أحادي الخلية / أحادي النوى ومتعدد الأوميكس إلى حد كبير على جودة الخلايا / النوى. لذلك ، يجب أن يكون عزل الخلايا / النوى عن الأنسجة وتنقيتها موحدا للغاية. يصف هذا البروتوكول تحضير النوى من الدماغ ونخاع العظم لمقايسة النوى المتعددة أحادية النوى في اتجاه مجرى النهر.

Single-cell analysis has become the approach of choice for unraveling the complexity of biological processes that require assessing the variability of ...

تدعم وحدة تكنولوجيا قياس الخلايا والمؤشرات الحيوية المشاريع الطبية الحيوية من خلال أحدث التقنيات وخطوط الأنابيب للتنميط الظاهري للخلايا والتنميط الجزيئي بدقة خلية واحدة. في هذا السياق ، نستخدم أدوات مختلفة للتحليل متعدد الخلايا أحادي الخلية للحصول على رؤى حول التعبير الجيني وتنظيم الجينات في الصحة والمرض. يحدد قياس التدفق الخلوي الخلايا الفردية ومصدرها بناء على خاصية فريدة.تشمل التطورات الحديثة الفرز الطيفي عالي الإنتاجية والقائم على الصور ، وتوفر هذه التكنولوجيا المرونة في تصميم الألواح ، وتمكن من الاستخدام المتزامن للأصباغ المماثلة ، وإدارة التألق الذاتي. يتمثل التحدي التجريبي الرئيسي عند استخدام أحدث التقنيات أحادية الخلية في العمل مع مجموعات الخلايا الهشة أو النادرة بشكل خاص. يحتاج كل نوع من الأنسجة أو الخلايا إلى الخضوع لتحسين بروتوكول مضبوط بدقة للحصول على ما يكفي من الخلايا القابلة للحياة للغاية والتي تترجم إلى بيانات تسلسل عالية الجودة.يعمل بروتوكول تحضير النوى المفردة المعدل الخاص بنا على تحسين استعادة النوى وتقليل الضغط على النوى. تم تحسينه خصيصا لأنسجة الدماغ ونخاع العظام ويغطي جميع الخطوات من تفكك العينة إلى تنقية النوى.

high-quality-brain-bone-marrow-nuclei-preparation-for-single-nuclei

Research

JoVE Journal

Biology

High-Quality Brain and Bone Marrow Nuclei Preparation for Single Nuclei Multiome Assays

1.5K Views.  Institut Pasteur, Université Paris Cité. تدعم وحدة تكنولوجيا قياس الخلايا والمؤشرات الحيوية المشاريع الطبية الحيوية من خلال أحدث التقنيات وخطوط الأنابيب للتنميط الظاهري للخلايا والتنميط الجزيئي بدقة خلية واحدة. في هذا السياق ، نستخدم أدوات مختلفة للتحليل متعدد الخلايا أحادي الخلية للحصول على رؤى حول التعبير ا?...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: تطوير البحوث الطبية الحيوية من خلال تحليل الخلية الواحدة 

Single-cell analysis has become the approach of choice for unraveling the complexity of biological processes that require assessing the variability of individual cellular responses to treatment or infection with single-cell resolution. 
Many techniques for single-cell molecular profiling have been developed over the past 10 years, and several dedicated technologies have been commercialized. The 10X Genomics droplet-based single-cell profiling is a widespread technology that offers ready-to-use reagents for transcriptomic and multi-omic single-cell profiling. The technology includes workflows for single-cell and single-nuclei RNA sequencing (scRNA-Seq and snRNA-Seq, respectively), scATAC-Seq, single-cell immune profiling (BCR/TCR sequencing), and multiome. The latter combines transcriptional (scRNA-Seq) and epigenetic information (scATAC-Seq) coming from the same cell. 
The quality (viability, integrity, purity) of single-cell or single-nuclei suspensions isolated from tissues and analyzed by any of these approaches is critical for generating high-quality data. Therefore, the sample preparation protocols should be adapted to the particularities of each biological tissue and ensure the generation of high-quality cell and nuclei suspensions.
This article describes two protocols for preparing brain and bone marrow samples for the downstream multiome 10X Genomics pipeline. The protocols are performed stepwise and cover tissue dissociation, cell sorting, nuclei isolation, and quality control of prepared nuclei suspension that is used as starting material for cell partitioning and barcoding, library preparation, and sequencing. These standardized protocols produce high-quality nuclei libraries and robust and reliable data.

The success of single-cell/single-nuclei transcriptomics and multi-omics largely depends on the quality of cells/nuclei. Therefore, isolating cells/nuclei from tissue and their purification must be highly standardized. This protocol describes the preparation of nuclei from the brain and bone marrow for downstream single-nuclei multiome assay.

Purification of Nuclei from Mouse Brain for Single-Cell Multiome Analysis

To begin, fill a glass Dounce with two milliliters of ice-cold nuclei lysis buffer containing 0.01%digitonin, and add the dissected mouse brain tissue pieces into it. Using a glass Dounce tissue homogenizer, homogenize the tissue 25 times each with pestles A and B, and transfer the resulting homogenate into a 15-milliliter tube. Add two milliliters of ice-cold nuclei lysis buffer containing 0.01%digitonin to the homogenate and incubate on ice for five minutes.Then, centrifuge the nuclei at 500 G for five minutes at four degrees Celsius. Using a micropipette, remove the supernatant and add four milliliters of ice-cold nuclei lysis buffer containing 0.01%digitonin. Filter the nuclei suspension through a 40-micrometer cell strainer.Centrifuge the nuclei again, remove the supernatant and add four milliliters of staining buffer to wash the nuclei. After filtering the suspension through a 40-micrometer cell strainer, pellet the nuclei by centrifugation and resuspend the nuclei in one milliliter of PBS containing 0.04%BSA and RNase inhibitors. To count the cells, mix 10 microliters of 0.4%trypan blue with 10 microliters of the nuclei in a 0.5-milliliter tube.Count the nuclei using an automated cell counter. Transfer 100 microliters of the nuclei to a FACS tube for the unstained control. Add 10 microliters of 7-AAD to the remaining nuclei and incubate for five minutes at four degrees Celsius, and proceed with nuclei sorting using FACS.Then, transfer 10 microliters of the sorted nuclei into a new FACS tube containing 90 microliters of DPBS with 2%heat-inactivated FBS. After centrifuging the sorted nuclei, remove the supernatant using a micropipette and resuspend the nuclei in 100 microliters of diluted nuclei buffer. Before sorting, the sample contains substantial debris with over 99%of singlets positive for nuclear stain, indicating effective cell lysis.Brain nuclei after sorting demonstrated an increase in purity from the initial 36%to nearly 100%

تنقية النوى من دماغ الفأر لتحليل الخلايا المتعددة أحادية الخلية

Purification of Nuclei from Mouse Bone Marrow Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs)

To begin, take a vial containing the mouse bone marrow hematopoietic stem and progenitor cells. Using a micropipette, resuspend the pellet in one milliliter of ACK lysing buffer and incubate for one to two minutes at room temperature. Transfer the resuspended mixture into a 50 milliliter tube through the pre-wetted 70 micrometer cell strainer.Then add 10 milliliters of FACS buffer to dilute the ACK lysing buffer. Centrifuge the mixture at 400 G for five minutes at four degrees Celsius and resuspend the pellet in 10 milliliters of FACS buffer by first resuspending it in one milliliter of buffer and then topping up with nine milliliters of buffer. Now, mix 10 microliters of 0.4%trypan blue with 10 microliters of the cells in a 0.5 milliliter tube, and count the cells using an automated cell counter.To stain the cells, centrifuge the cells at 400 G for five minutes at four degrees Celsius. Resuspend the pellet in FACS buffer to achieve a final concentration of one times 10 to the seven cells per milliliter by first resuspending the pellet in one milliliter of buffer and then topping up with the remaining volume. Using a P1000 micropipette, transfer the suspension into a FACS tube through a 35 micrometer cell strainer cap.Next, prepare staining mix as shown here. After centrifugation, resuspend the cell suspension in 300 microliters of staining mix one in a sample tube and incubate on ice for 15 minutes protected from light. Then add 300 microliters of mix two into the sample tube and incubate for 20 minutes on ice protected from light.Add three milliliters of the FACS buffer to the single stained and mixed stained sample tubes. Now centrifuge the cell suspension. After discarding the supernatant, resuspend the pellet in 500 microliters of the FACS buffer.Prepare a 1.5 milliliter tube prefilled with 500 microliters of collection medium. Once the FACS instrument has been calibrated, add 500 microliters of FACS buffer to the cell suspension and then transfer one milliliter of the sample through a 35 micrometer cell strainer cap into a new FACS tube. After cell sorting, transfer 10 microliters of the sorted cells into a new FACS tube containing 90 microliters of FACS buffer.Pellet the cell suspension by centrifugation and resuspend in 50 microliters of PBS with 0.04%BSA. Transfer the suspension to a 0.2 milliliter tube and add 50 microliters of PBS with BSA to the original tube to collect any leftover cells. Transfer the cells to the 0.2 milliliter tube to reach a total volume of 100 microliters.Run a pilot experiment to identify the best lysis time for nuclei isolation. After pelleting the nuclei, resuspend the nuclei pellet in 12 microliters of diluted nuclei buffer. Add two microliters of nuclei to a tube containing 0.4%trypan blue and eight microliters of PBS with 0.04%BSA and count the nuclei using an automated cell counter.After completing the nuclei isolation, transfer six microliters of nuclei resuspension into a new FACS tube pre-filled with 150 microliters of FACS buffer. Add three microliters of 7-AAD and incubate for five minutes on ice.