بدون بروتوكول، من الممكن التحقيق في العملية الديناميكية لتمايز myoblast وتشكيل myofiber، ولا سيما تحديد المواقع النووية عن طريق استغلال التصوير الخلية الحية. التصوير الخلية الحية من myoblast مع نواة الخلية الأجنبية تسمح لدراسة تمايز myoblast في الخلايا الحية والتتبع التلقائي للنيات. يساعد العرض التوضيحي المرئي في فهم كيفية الجمع بين عزل الخلايا الأساسية مع التصوير الحي وتحليل التصوير.
إظهار الإجراء مع فريدريكا كولومبو، سيكون جيوغا Careccia، طالب دكتوراه في مختبرنا. تبدأ عن طريق حصاد soleus tibialis، extensororum لونجوس، gastrocnemius، رباعية، والعضلات ثلاثية الرؤوس من كلا الأطراف الخلفية من الماوس الكبار في طبق بيتري من برنامج تلفزيوني على الجليد. استخدام مقص معقمة والملاقط لإزالة بعناية الأوتار والدهون من كل عضلة ونقل العضلات إلى طبق بيتري فارغة.
باستخدام مقص منحني معقم قطع و mince العضلات حتى يتم الحصول على كتلة موحدة ونقل القطع العضلية إلى أنبوب 50 ملليلتر. ثم إضافة 10 ملليلتر من الهضم المتوسط لقطع العضلات لاحتضان لمدة 30 دقيقة في حمام الماء 37 درجة مئوية في 250 دوران في الدقيقة الواحدة. في نهاية الهضم الأنزيمي ، أوقف التفاعل مع 10 ملليلتر من الحجب المتوسط.
وتدور أسفل العينة عن طريق الطرد المركزي. ضع الأنبوب على الجليد ونقل المابير إلى أنبوب جديد 50 ملليلتر. جهاز طرد مركزي المُتفوّع مرة أخرى.
وإعادة تعليق بيليه في ملليمتر واحد من DMEM. تكملة ذلك مع عشرة في المئة مصل البقر الجنين، أو FBS، على الجليد. هضم بيليه محفوظة في 10 ملليلتر من طازج هضم المتوسطة كما أظهرت للتو والجمع بين بيليه هضم مع تعليق الخلية الاحتياطية, على الجليد.
سلالة الخلايا المسحوبة من خلال مرشح 70 ميكرومتر، تليها مرشح 40 ميكرومتر. وغسل الخلايا في 15 ملليمتر من DMEM الطازجة، تستكمل مع 10 في المئة FBS. في نهاية الطرد المركزي، إعادة تعليق بيليه في ثلاثة ملليلتر من خلايا الدم الحمراء العازلة في درجة حرارة الغرفة.
وقف التحلل بعد خمس دقائق مع 40 ملليلتر من برنامج تلفزيوني وطارد مركزي إضافي. إعادة تعليق بيليه في 20 ملليلتر من DMEM تكمل مع 10 في المئة FBS وطبقة قبل الخلايا في طبق بيتري غير المصقول. بعد ساعة واحدة في 37 درجة مئوية وخمسة في المئة ثاني أكسيد الكربون جمع الخلية الساتلية التي تحتوي على افر.
وقبل لوحة تعليق الخلية مرتين أكثر كما هو موضح. بعد الطلاء الماضي، وجمع الخلايا الأقمار الصناعية عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق بيليه في 40 ملليلتر من متوسطة الانتشار الطازجة. تقسيم الخلايا بين اثنين من الكولاجين المغلفة 150 ملليلتر أطباق بيتري مع ميكروغرام واحد لكل ملليلتر من دوكسيسيكلين في الطبق الواحد للحث على التعبير H2BGFP.
وتعيد الخلايا إلى حاضنة ثقافة الخلية لمدة يومين أو ثلاثة أيام. عندما وصلت myoblasts كثافة التجريبية المناسبة، وغسل الخلايا في كل طبق مع خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني وفصل الخلايا من قيعان لوحة مع مليلترين من التربسين في طبق في 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. تأكيد انفصال عن طريق المجهر الخفيفة ووقف رد الفعل مع خمسة ملليلتر من DMEM بالإضافة إلى عشرة في المئة FBS لكل لوحة.
للتصوير الخلية الحية، لوحة مرتين عشرة إلى الخلايا الخامسة في كل بئر من لوحة 12 جيدا المغلفة مع 350 ميكروليتر من التمايز المتوسطة، وتستكمل مع مصفوفة غشاء الطابق السفلي في بئر لمدة ساعتين. عندما تلتزم الخلايا بأسفل اللوحة ، ضع اللوحة في 37 درجة مئوية وحاضنة 5 في المئة لثاني أكسيد الكربون في مرحلة المجهر confocal واستخدام هدف جاف 20 مرة للحصول على حقول الرؤية مع مئات الخلايا للحصول على صور 16 بت مع 1024 بكسل في الإطار الواحد كل ست دقائق لمدة 16 ساعة. لكل موضع المكتسبة، إنشاء ملف متعددة الإطار نقطة tif وتحميل واستخراج برنامج zip نقطة المقدمة في مجلد محدد.
فتح مثال مجلد تتبع التجزئة وانقر فوق do تجزئة نقطة M لفتح إطار الأوامر في Matlab. تغيير البرامج النصية لتجزئة المستحق M بحيث مسار اسم ملف المتغير هو اسم ملف tif والمسار مسار الإدخال هو المجلد حيث يتم تضمين tif نقطة. انقر فوق تشغيل لتشغيل البرنامج النصي.
سيتم حفظ نتيجة تجزئة كصعرة نقطة ملف، في حين يمكن تصور تجزئة النوى في الرقم الناتج. لإنشاء المسارات ، أول انقر نقرا مزدوجا توليد المسارات نقطة M في نفس مجلد العمل. بعد ذلك، قم بتغيير اسم الملف إلى اسم الملف نقطة ملف Mat نقطة المناسبة للنيات المجزأة.
انقر فوق تشغيل لتشغيل البرنامج النصي. سيتم حفظ نتيجة التتبع كملف آخر من النقاط و سيتم رسم المسارات التي تم إنشاؤها. لتقييم جودة المسارات.
انقر أولاً مزدوج نقطة تعقب الاختيار M وتعديل اسم الملف إلى اسم tif نقطة المناسبة. ثم انقر فوق ملف اسم المسار لاستخدام ملف حصيرة نقطة من المسارات وانقر فوق تشغيل. في إطار الشكل استخدام شريط التمرير السفلي لتحديد النواة.
سيتم نقل النواة المحددة باللون الأحمر، ويمكن اتباع مسار الخلية المحددة في الوقت المناسب باستخدام شريط التمرير العلوي. تشير الصلبان الخضراء إلى النوى المكتشفة. ضعفت انتشار وتمايز بقوّة في myoblasts يُزرع مع هويشست.
بالمقارنة مع myoblast معزولة عن الفئران H2BGFP وزرع مع دوكسيسكلين أو نوع البرية، سلسلة الميوسين الثقيلة المسمى myoblasts. التصوير الخلية الحية مع myoblasts الأولية التي تعبر عن بروتين H2BGFP يسمح تتبع النوى أثناء التمايز. الصور المدمجة من انتقال في قنوات GFP في نقطة الوقت الأولي والأخير من فترة التمايز، تسمح بتحديد ميوتيوب وبالتالي النوى التي ينتهي الاندماج في ميوتيوب أو التي لا تنصهر في ميوتوب.
بعد التصوير عن طريق المجهر الفلوري confocal، يمكن تقسيم النوى كما أظهرت وتحويل مستجمعات المياه يمكن استخدامها لفصل الأجسام القريبة. مع هذا النهج، يتم تحديد معظم النوى في الصورة، مما يسمح للحركة النووية أن يتم تعقب كما هو موضح. على سبيل المثال، يبدو أن الطول الإجمالي للمسارات أعلى قليلاً بالنسبة للخلايا الملطخة بـ Hoechst.
على الرغم من أن الفرق ليس كبيرا. ومع ذلك ، فإن حساب النزوح الكلي خلال فترة زمنية يكشف عن أن النزوح الكلي للخلايا الملطخة بهيشت أصغر بكثير من الخلايا غير المطّهية. كما هو متوقع فإن الاختلاف السنوي الإجمالي للخلايا غير المطّطة أصغر بكثير مقارنة بالخلايا الملطخة بـ Hoechst.
من المهم اتباع البروتوكول تماما كما هو موضح على وجه الخصوص عند الجمع بين المهارات التقنية من الخطوات البيولوجية مع المجهر confocal والبرمجيات المستخدمة الخطوات. لدراسة التمايز myoblast وتحديد المواقع النووية في نموذج آخر من العضلات الفائدة فمن الممكن لنقل myoblast معزولة مع البروتين النووي الفلورسنت. وقد مهدت هذه التقنية الطريق لاستكشاف الديناميات الخلوية والنووية أثناء تمايز العضلات ومواصلة التحقيق في العيوب في هذه العمليات.
تحت ظروف مرضية مختلفة مثل dystrophies العضلات.
