يتم تمويل SE من خلال منحة Wellcome Trust 108906 / Z / 15 / Z ؛ يتم تمويل EE من خلال منحة UKRI / MRC MR / S005544 / 1 وزمالة المستشار من جامعة إدنبرة. يتم إنشاء الشكل 1A باستخدام BioRender.com.

تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل وزارة الداخلية في المملكة المتحدة وتم تنفيذها بموجب PPLs PB5FC9BD2 و PP0330540. تتوافق جميع التجارب مع إرشادات REACH وإرشادات جامعة إدنبرة.
تم الحصول على الفئران البرية تجاريا (انظر جدول المواد). Krt14كريير ؛ تم تربية الفئران R26mTmG في المنزل ، عن طريق عبور الفئران Krt14CreER / + 31 مع الفئران R26mTmG / mTmG 32. في جميع التجارب ، تم استخدام إناث الفئران البالغة من العمر 8-10 أسابيع.
1. جمع وتضمين SMG
<ol><li>القتل الرحيم للفأر / الفئران عن طريق تعريضها لتركيز متزايد من ثاني أكسيد الكربون (CO2). بعد ذلك ، قم برش منطقة الشق بنسبة 70٪ من الإيثانول (EtOH) واستخدم المقص والملقط لتشريح الرشاش (الرشاشات) بعناية من الأنسجة المحيطة (الشكل 1 أ). قم بإزالة أي دهون وأنسجة ضامة باستخدام الملقط ، وضع الغدة في أنبوب تجميع يحتوي على محلول ملح هانكس المتوازن المثلج (HBSS ، انظر جدول المواد).</li>
	<li>افصل الغدة إلى قطع قياس حوالي 1 سم2 لكل منها باستخدام ملقط.</li>
	<li>سخني 4٪ أغاروز إلى 50 درجة مئوية ، ثم اسكبيه مباشرة في طبق 35 مم.</li>
	<li>صب كمية صغيرة من الأغاروز المذاب 50 درجة مئوية في طبق منفصل وشطف الغدة جيدا عن طريق تحريكها في الأغاروز الزائد. ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية لإزالة السوائل الزائدة من الغدد. فائض السوائل يمكن أن يمنع الغدد من الالتصاق بشكل صحيح بالأغاروز.</li>
	<li>ضع 4-6 قطع من الغدة في الأغاروز ، مع التأكد من أنها مسطحة وتكون في نفس المستوى (الشكل 1 أ). ملاحظة: تأكد من أن الغدد لا تلمس سطح الآجار أو أسفل اللوحة.</li>
	<li>ضع الغطاء على طبق 35 مم وانقله إلى صندوق ثلج ، وقم بتغطية اللوحة بالثلج.</li>
	<li>انتظر لمدة 5-10 دقائق حتى يتجمد الأغاروز.</li>
</ol>2. التقسيم
<ol><li>استخدم مشرطا لقطع بعناية حول كتلة الأغاروز المضمنة في الغدة ، وإزالة الكتلة التي تحتوي على الأنسجة من الطبق. اترك حدا بحجم 5 مم تقريبا.</li>
	<li>قم بتوصيل كتلة الأغاروز بمرحلة الاهتزاز (انظر جدول المواد) عن طريق تطبيق قطرة من الغراء الفائق ، مما يضمن أن السطح السفلي للكتلة بالكامل ملامس للغراء الفائق.</li>
	<li>اترك الغراء الفائق يتصلب لمدة 5 دقائق تقريبا. بعد ذلك ، املأ حجرة الاهتزاز بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات المثلج 1x (PBS) يحتوي على 1٪ بنسلين-ستربتومايسين (P / S).</li>
	<li>أضف الثلج إلى كل من جانب وأسفل حجرة الاهتزاز. ملاحظة: حافظ على بيئة شديدة البرودة واستبدل الثلج حسب الحاجة.</li>
	<li>تقليم أي أغاروز زائد وخلق فجوات 5 مم بين كل قطعة من الغدة عن طريق عمل شقوق بمشرط. هذا سوف ينتج شرائح فردية.</li>
	<li>قم بمحاذاة شفرة الاهتزاز مع وجه كتلة الأغاروز واضبط نقطتي البداية والنهاية للأقسام لتحقيق سمك الشريحة المطلوب.</li>
	<li>قبل البدء في عملية القطع ، تأكد من أن الشفرة ليست ملامسة للكتلة. سيمنع هذا الاحتياط قطع قطع كبيرة من الأغاروز عن طريق الخطأ وفقدان أجزاء من العينة.</li>
	<li>قطع المقاطع بسمك 150 ميكرومتر بسرعة منخفضة واهتزاز عالي (على سبيل المثال ، سرعة 3 وإعداد اهتزاز من 8-10 على مقياس من 1-10 لكل معلمة) (الشكل 1 أ).</li>
	<li>بمجرد قطع القسم وإطلاقه في PBS المحيط ، اجمع الأقسام باستخدام فرشاة الرسم وضعها في طبق يحتوي على وسائط معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) الدافئة مسبقا مع P / S.</li>
</ol>3. زراعة وتلطيخ شرائح SMG
<ol><li>زراعة<ol><li>أضف 1.5 مل من وسائط RPMI إلى كل بئر من لوحة 6 آبار تحتوي على مرشح 0.4 ميكرومتر. تأكد من عدم وجود فقاعات هواء محاصرة أسفل الفلتر.</li>
		<li>انقل 1-6 شرائح إلى كل مرشح باستخدام فرشاة الرسم ، مع الحرص على عدم كسر الشرائح. ملاحظة: تأكد من أن الشرائح ليست مغمورة في الوسائط ولكن بدلا من ذلك تطفو على الفلتر. إذا كانت مغمورة بالكامل ، فقد تختنق أثناء الثقافة.</li>
		<li>احتضان عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 ، وتغيير الوسائط كل 3 أيام (الشكل 1A).</li>
		<li>قم بتشعيع الألواح التجريبية بجرعة واحدة من إشعاع جاما 10 جراي باستخدام جهاز تشعيع متاح تجاريا (انظر جدول المواد). بعد ذلك ، أعدهم إلى الحاضنة.</li>
	</ol></li>
	<li>تلطيخ للتصوير الحي<ol><li>باستخدام فرشاة الرسم ، ارفع الشرائح برفق من المرشح وضعها في لوحة 24 بئرا تحتوي على 500 ميكرولتر من وسائط الاستزراع لكل بئر ، حيث سيتم غمر الشرائح.</li>
		<li>أضف الأجسام المضادة المترافقة ذات الصلة والبقعة النووية (انظر جدول المواد) إلى الوسائط بتركيزات مناسبة27.</li>
		<li>احتضان الشرائح بالأجسام المضادة لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية مع تحريض لطيف.</li>
		<li>اغسل الشرائح عن طريق غمرها في وسائط الثقافة وغسلها لمدة 3 جولات لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية مع التقليب اللطيف.</li>
	</ol></li>
</ol>4. تصاعد والتصوير الحي
<ol><li>باستخدام الملقط ، قم بإزالة الشريط من جانب واحد من فاصل التصوير على الوجهين وألصقه ، الجانب اللاصق لأسفل ، إلى أسفل لوحة زجاجية ذات 6 آبار.</li>
	<li>ماصة 50 ميكرولتر من الوسائط في الفجوة الموجودة في وسط الفاصل.</li>
	<li>ضع الشريحة في الوسائط باستخدام فرشاة الرسم ، وتأكد من أنها مسطحة دون أي فقاعات هواء محاصرة.</li>
	<li>باستخدام ماصة ، قم بإزالة 20 ميكرولتر من الوسائط بعناية من الفجوة.</li>
	<li>قم بإزالة الشريط من الجانب العلوي للفاصل باستخدام ملقط وضع غطاء دائري مقاس 25 مم في الأعلى. اضغط حول حافة الفاصل للتأكد من أن غطاء الغطاء متصل بإحكام ، مع الحرص على عدم كسر انزلاق الغطاء عن طريق استخدام الكثير من القوة (الشكل 1 أ).</li>
	<li>تخيل الشريحة على مجهر متحد البؤر للفترة الزمنية أو الفترات الزمنية المطلوبة (على سبيل المثال ، كل 15 دقيقة لمدة 12 ساعة باستخدام هدف مائي 20x).</li>
</ol>

التصوير المباشر في الوقت الحقيقي لتجديد الغدة تحت الفك السفلي للفأر

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

تقدم القدرة على زراعة أنسجة الغدد اللعابية خارج الجسم الحي فرصة ممتازة لدراسة تفاعلات الخلايا الخلوية في سياق كل من التوازن والاستجابة للإصابة. على الرغم من أن التصوير داخل الجسم للغدة تحت الفك السفلي للفأر ممكن39,40 ، إلا أن هذه التقنية تعتمد على استخدام نماذج الفئران المراسل الفلورية لتسمية الخلايا ذات الأهمية داخليا ويجب إجراؤها تحت التخدير النهائي. هنا ، يتم وصف طريقة لزراعة شرائح الغدة تحت الفك السفلي خارج الجسم الحي ، والحفاظ على البنية الخلوية والتفاعلات بين الخلايا والخلايا. يعمل هذا النهج على تحسين تقنيات التصوير الحي الحالية ويوفر بديلا للتصوير داخل الجسم.
تعتمد صيانة الأنسجة على المدى الطويل باستخدام هذه التقنية على زراعة الشرائح في واجهة الهواء والسائل. من المحتمل أن تكون نماذج explant السابقة26,41 قد حققت ثقافة ناجحة لبضعة أيام فقط لأنها كانت مغمورة في وسائل الإعلام و "مخنوقة" بشكل أساسي. في المقابل ، يحافظ استخدام نظام ثقافة واجهة الهواء السائل على صحة الأنسجة وهيكلها لفترة طويلة ، مما يضمن تصويرا عالي الجودة. تعد طريقة تركيب شرائح SMG قبل التصوير ، مع كمية صغيرة من الوسائط وداخل غرفة محدودة المساحة للحفاظ على الشريحة مسطحة ، جزءا لا يتجزأ من نجاح التقنية. يعتمد تصور الخلايا في هذا الفحص على الفئران المراسلة المصنفة داخليا أو الأجسام المضادة المترافقة بالفلورسنت. إن وفرة نماذج الفئران المراسل الفلورية المعدلة وراثيا والأجسام المضادة المترافقة التي تستهدف أنواعا معينة من الخلايا ومجموعات فرعية تجعل هذه الطريقة مناسبة لاستكشاف التفاعلات المختلفة الخاصة بالخلايا.
في حين أن هذه الطريقة توفر نموذجا جيدا للأنسجة في الموقع وتؤدي الإصابة بالإشعاع خارج الجسم الحي إلى ضمور البنية العنيبية والقنوية ، على غرار ما يحدث في الجسم الحي13 ، لا يمكن تلخيص بعض العناصر خارج الجسم الحي. وتشمل هذه عدم وجود الأوعية الدموية العاملة والمدخلات العصبية ، فضلا عن عدم وجود خلايا التهابية متسللة. بالنظر إلى الدور الموثق جيدا للأوعية الدموية والأعصاب في توازن الغدد اللعابية وتجديدها26,42 وأهمية الخلايا المناعية المهاجرة43 ، مثل الخلايا التائية والبائية ، في وظيفة الغدد اللعابية ، والاستجابة للإصابة ، والعدوى ، والتسبب في متلازمة سجوجرن (SS) (كما تمت مراجعته في44) ، قد يفوت هذا الفحص بعض التفاعلات الخلوية المهمة. بالإضافة إلى ذلك ، قد يتم تفويت أحداث الهجرة السريعة جدا ، مثل الخلية القاتلة الطبيعية (NK)45 وحركة الخلايا المتغصنة (DC) 46 ، عن طريق التصوير كل 15 دقيقة. ومع ذلك ، يمكن تحسين فترات التصوير لدراسة تفاعلات الخلايا والخلايا المحددة ذات الأهمية ، والقدرة على التصوير في 3 أبعاد من خلال z-stacks تسمح بتقييم حركة الخلايا ثلاثية الأبعاد. يعد تركيب الأنسجة بشكل آمن أثناء التصوير أمرا بالغ الأهمية للقياس الكمي ، مثل قياسات تتبع الخلايا. علاوة على ذلك ، على الرغم من أن هذه الدراسة استخدمت أنسجة الفئران ، إلا أن البروتوكول يوفر طريقة قابلة للتطبيق لدراسة تفاعلات الخلايا الخلوية في الغدد اللعابية البشرية ، مما يولد معلومات متعدية قيمة لا يمكن الوصول إليها من خلال طرق أخرى.
في حين أن دور البلاعم المقيمة في الأنسجة في التوازن والتجديد قد تم إثباته في العديد من الأنسجة2،10،11،12 ، فإن دورها في الغدد اللعابية لا يزال دون إجابة إلى حد كبير. على الرغم من أنه من المعروف أن البلاعم ضرورية لتجديد الظهارة بعد إصابة التشعيع13 ، إلا أن الآليات الدقيقة الكامنة وراء هذا التأثير لا تزال غير معروفة. يتيح التصوير المباشر لشرائح الغدد اللعابية التصور في الوقت الفعلي وتحليل ديناميكيات الأنسجة المعقدة ، والتي غالبا ما يفوتها التصوير التقليدي متحد البؤر. بالإضافة إلى ذلك ، من الواضح أن البلاعم تخضع لتغييرات ديناميكية في الشكل أثناء أداء وظائف مختلفة في الجسم الحي47،48،49 ، ومن المحتمل أن يوفر هذا البروتوكول تمثيلا أفضل لهذه التغييرات من عرض ثابت نموذجي في الأنسجة الثابتة. يمكن للدراسات المستقبلية استخدام هذه التقنية للتحقق من كيفية تغير اتصال الخلية الخلوية عبر مسار التوازن والإصابة والتجديد / الحل. سيكون هذا النهج مفيدا لتوضيح مسارات الإشارات الرئيسية والأحداث التي قد تقدم في النهاية فوائد علاجية.

لقد ثبت أن البلاعم تلعب أدوارا متزايدة الأهمية في عمليات التجديد والإصلاح ، وتمتد إلى ما وراء وظيفتها المناعية الكلاسيكية1،2. في الواقع ، تشارك البلاعم في عدد كبير من العمليات المتعلقة بالتجديد ، وتظهر نشاطا تنظيميا حاسما في جميع مراحل الإصلاح ، بالإضافة إلى تكوين الندبة والتليف 3,4. البلاعم المقيمة في الأنسجة هي أنواع خلايا غير متجانسة للغاية مع آليات معقدة تقود الأنماط الظاهرية الخلوية المتنوعة ، وتلعب أدوارا أساسية في تطور الأعضاء ووظيفتها وتوازنها (كما تمت مراجعته في5). تنشأ البلاعم المقيمة في الأنسجة في البداية من السلائف في كيس الصفار وكبد الجنين ، ويتم استبدالها لاحقا بالانتشار أو عن طريق وحيدات الدم المشتقة من نخاع العظام بمعدلات متفاوتة ، اعتمادا على طول عمر البلاعم الموجودة والأنسجة أو المكانة التي يقيمون فيها 6,7.
الأهم من ذلك ، أن البلاعم المقيمة في الأنسجة منتشرة في جميع الأنسجة وتساهم في وظائف الأعضاء المتنوعة. يتم برمجتها بشكل فريد من خلال بيئتها الدقيقة لأداء وظائف متخصصة. لهذا السبب ، فإن توطين البلاعم داخل الأنسجة يوفر نظرة ثاقبة لوظيفتها ، مع وجود مجموعات فريدة لوحظت في الرئة والغدة الثديية والأمعاء والجلد والعضلات8،9،10. أثناء نمو الغدة الثديية ، ترتبط الضامة الأقنية ارتباطا وثيقا بشجرة الأقنية ، ويؤدي استنزافها إلى انخفاض كبير في التفرع11. علاوة على ذلك ، هناك حاجة إلى البلاعم للتشكل أثناء البلوغ والأسناخ في الحمل ، حيث يراقبون الظهارة بنشاط. في إصابة العضلات ، "تسكن" مجموعة معينة من البلاعم داخل موقع الإصابة ، مما يوفر مكانا عابرا توفر فيه الإشارات التي يسببها الانتشار اللازمة لتكاثر الخلايا الجذعية. وبالتالي ، فإنها تظهر الدور المتخصص لمجموعات البلاعم المتميزة في التحكم في عملية الإصلاح2. في الرئة ، تحدث ظاهرة مماثلة حيث تقوم الضامة الخلالية بالخلايا السنخية من النوع الثاني (AT2) بتحويل الخلايا السنخية من النوع الثاني (AT2) للتعبير عن الإنترلوكين (IL) - R1 لتحويلها إلى أسلاف عابرة مرتبطة بالضرر من خلال إطلاق IL-1B12. علاوة على ذلك ، أظهرت الأبحاث الحديثة أن البلاعم ضرورية لتجديد الغدة اللعابية تحت الفك السفلي للفأر (SMG) بعد إصابة التشعيع ، وفي غيابها ، يتعطل التجديد الظهاري13. مجتمعة ، تسلط هذه البيانات الضوء على أهمية تنشيط البلاعم ووظيفتها في المنافذ الالتهابية العابرة بعد إصابة الأنسجة ، وكذلك أثناء التوازن.
البلاعم هي خلايا نشطة ، وتتضمن وظائفها تفاعلات مع مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا المختلفة ، بما في ذلك الاتصال المباشر بين الخليةوالخلية 14,15 ، بالإضافة إلى المزيد من الطرق غير المباشرة مثل إفراز العوامل القابلة للذوبان 2,16 ، والتي تعتبر ضرورية للتنظيم المتخصص. في حين أن التصوير المناعي الكلاسيكي مفيد للبدء في كشف هذه التفاعلات ، إلا أنه محدود من خلال تصوير لقطة واحدة فقط في الوقت المناسب ، وبالتالي حذف العديد من النقاط الزمنية الحاسمة لعملية تجديد ديناميكية للغاية17,18. نظرا لأن أهمية التوقيت وظهور موجات مختلفة من التجديد أصبحت أكثر تركيزا ، فمن الضروري تشريح هذه العمليات بمزيد من التفصيل.
العلاج الإشعاعي هو علاج منقذ للحياة للعديد من الأشخاص المصابين بالسرطان. في حين أن العلاج الإشعاعي غالبا ما يكون فعالا في تقليص الورم (الأورام) أو القضاء عليه ، إلا أنه يمكن أن يتلف الأنسجة السليمة الموجودة في مجال الإشعاع ويثير استجابة مناعية. يمكن أن تؤدي الإصابة الإشعاعية إلى تجنيد البلاعم السريع ، والاستجابات المناعية المباشرة وغير المباشرة19,20. غالبا ما يتم تشعيع الغدد اللعابية عن غير قصد أثناء علاج سرطان الرأس والرقبة21,22 ، مما يؤدي إلى تلف الظهارة وضمور الخلايا والتليف23,24 ، مما يؤدي إلى جفاف الفم أو جفاف الفمالمزمن 25.
تتكون الغدة اللعابية من عدد كبير من أنواع الخلايا وهياكلها ، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر الخلايا الظهارية (كل من الخلايا العنيبية المنتجة للعاب والخلايا الأقنية الناقلة للعاب) ، والخلايا الظهارية العضلية ، والخلايا السلفية الظهارية ، والأعصاب ، والأوعية الدموية ، والخلايا المناعية ، والخلايا الليفية ، والمصفوفة خارج الخلية (ECM). تم وصف دور واستجابة العديد من أنواع الخلايا هذه في الاستجابة التجديدية سابقا26،27،28،29،30. ومع ذلك، فإن كيفية تفاعل هذه الخلايا المختلفة أثناء الاتزان الداخلي والتجدد، وخاصة سلوك الخلايا المناعية مثل الخلايا البلعمية الكبيرة، أقل دراسة. تصف هذه المخطوطة طريقة تم إنشاؤها حديثا لدراسة التفاعلات الحية بين الضامة الرشاشة والخلايا الأخرى ذات الأهمية في الأنسجة خارج الجسم الحي . يتم تقطيع SMG على اهتزاز ، ملطخة لعلامات السطح ، ويتم تصويرها لمدة تصل إلى 12 ساعة. باستخدام هذه الطريقة ، يمكن ملاحظة البلعمة للخلايا المحيطة بواسطة البلاعم ، ويمكن دراسة حركية هجرة البلاعم ، ويمكن إثبات التفاعلات المباشرة بين الخلايا الخلوية بين البلاعم والخلايا الظهارية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.4 &#181;m filter cell culture inserts (Nunc)</td>
			<td>Avantor/VWR</td>
			<td>734-2240</td>
			<td>Inserts pre-packed in 6-well multidishes, 20 mm &#215; 25 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Paul Marienfeld GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>111650</td>
			<td>Deckglaser Cover Glasses 25 mm diameter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided sticker</td>
			<td>Grace Bio-Labs</td>
			<td>654004</td>
			<td>SecureSeal Imaging Spacers SS1 x 13, 13 mm diameter x 0.12 mm depth, 25 mm x 25mm OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH</td>
			<td>Scientific Laboratories Supplies</td>
			<td>CHE1924</td>
			<td>Absolute ethanol (EtOH) AR, 99.7%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F4/80 antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17-4801-82</td>
			<td>F4/80 Monoclonal Antibody (BM8), APC, eBioscience</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91113-10</td>
			<td>Student Fine Forceps Straight Broad Shanks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom 6 well plate</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P06-1.5H-N</td>
			<td>6 well glass bottom plate with high performance #1.5 cover glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14025050</td>
			<td>+calcium +magnesium, no phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>14533</td>
			<td>Alternative name: bisBenzimide H 33342 trihydrochloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice box</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11339623</td>
			<td>Azlon Polyurethane Ice Buckets with Lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging and analysis software</td>
			<td>Harmony</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Melting Agarose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>&#160;A9414-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paintbrush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Watercolour brush, 10 mm x 2mm tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td>10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, 0.1 &#956;m filtered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>20012027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12634010</td>
			<td>Gibco Advanced DMEM/F-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td></td>
			<td>Disposable scalpels, No. 11 blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14088-10</td>
			<td>Extra Narrow Scissors 10.5 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shepherd Mark-I-68A 137Cs irradiator</td>
			<td>JL Shepherd &#38; Associates</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superglue</td>
			<td>Bostik</td>
			<td></td>
			<td>Multi-purpose superglue, fast setting, ultra strong</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Leica VT 1000 S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome blades</td>
			<td>Astra</td>
			<td></td>
			<td>Superior Platinum Double Edge blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild-type (C57BL/BJ) mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

interrogating cell-cell interactions in the salivary gland via ex vivo live cell imaging

تجديد الغدد اللعابية هو عملية معقدة تنطوي على تفاعلات معقدة بين أنواع الخلايا المختلفة. سلطت الدراسات الحديثة الضوء على الدور المحوري الذي تلعبه البلاعم في دفع الاستجابة المتجددة. ومع ذلك ، فقد اعتمد فهمنا لهذا الدور الحاسم في المقام الأول على وجهات النظر الثابتة التي تم الحصول عليها من خزعات الأنسجة الثابتة. للتغلب على هذا القيد واكتساب نظرة ثاقبة لهذه التفاعلات في الوقت الفعلي ، تحدد هذه الدراسة بروتوكولا شاملا لزراعة أنسجة الغدد اللعابية خارج الجسم الحي والتقاط صور حية لهجرة الخلايا.
يتضمن البروتوكول عدة خطوات رئيسية: أولا ، يتم تقطيع أنسجة الغدد اللعابية تحت الفك السفلي للفأر بعناية باستخدام اهتزاز ثم يتم زراعتها في واجهة الهواء والسائل. يمكن إصابة هذه الشرائح عمدا ، على سبيل المثال ، من خلال التعرض للإشعاع ، لإحداث تلف خلوي وتحفيز الاستجابة المتجددة. لتتبع خلايا معينة ذات أهمية ، يمكن تصنيفها داخليا ، مثل استخدام أنسجة الغدد اللعابية التي تم جمعها من الفئران المعدلة وراثيا حيث يتم تمييز بروتين معين ببروتين الفلورسنت الأخضر (GFP). بدلا من ذلك ، يمكن استخدام الأجسام المضادة المقترنة بالفلورسنت لتلطيخ الخلايا التي تعبر عن علامات سطح خلية معينة ذات أهمية. بمجرد تحضيرها ، تخضع شرائح الغدد اللعابية للتصوير المباشر باستخدام نظام تصوير متحد البؤر عالي المحتوى على مدار 12 ساعة ، مع التقاط الصور كل 15 دقيقة. ثم يتم تجميع الصور الناتجة لإنشاء فيلم ، والذي يمكن تحليله لاحقا لاستخراج معلمات سلوك الخلية القيمة. توفر هذه الطريقة المبتكرة للباحثين أداة قوية للتحقيق في تفاعلات البلاعم داخل الغدة اللعابية بعد الإصابة وفهمها بشكل أفضل ، وبالتالي تعزيز معرفتنا بعمليات التجدد التي تلعب دورا في هذا السياق البيولوجي الديناميكي.

Macrophages have been shown to play increasingly important roles in the processes of regeneration and repair, extending beyond their classical immune function1,2. Indeed, macrophages are involved in a plethora of processes related to regeneration, exhibiting critical regulatory activity in all stages of repair, as well as scar formation and fibrosis3,4. Tissue-resident macrophages are highly heterogeneous cell types with complex mechanisms driving diverse cellular phenotypes, and they play essential roles in organ development, function, and homeostasis (as reviewed in5). Tissue-resident macrophages initially arise from precursors in the yolk sac and fetal liver, and they are subsequently replaced by proliferation or by bone marrow-derived blood monocytes at varying rates, depending on the longevity of existing macrophages and the tissue or niche within which they reside6,7.
Importantly, tissue-resident macrophages are dispersed throughout all tissues and contribute to diverse organ functions. They are uniquely programmed by their microenvironment to perform niche-specific functions. For this reason, the localization of macrophages within the tissue offers insight into their function, with unique populations observed in the lung, mammary gland, intestine, skin, and muscle8,9,10. During mammary gland development, ductal macrophages are intimately associated with the ductal tree, and their depletion results in significantly reduced branching11. Furthermore, macrophages are required for morphogenesis during puberty and alveologenesis in pregnancy, where they actively monitor the epithelium. In muscle injury, a specific population of macrophages &#34;dwells&#34; within the injury site, providing a transient niche in which they supply proliferation-induced cues required for stem cell proliferation. Thus, they exhibit the specialized role of distinct macrophage populations in governing the repair process2. In the lung, a similar phenomenon occurs where interstitial macrophages prime interleukin (IL)-R1-expressing alveolar type II (AT2) cells for conversion into damage-associated transient progenitors through the release of IL-1B12. Furthermore, recent research has shown that macrophages are essential for the regeneration of the mouse submandibular salivary gland (SMG) after irradiation injury, and in their absence, epithelial regeneration is disrupted13. Taken together, this data highlights the importance of macrophage activation and function in transient inflammatory niches after tissue injury, as well as during homeostasis.
Macrophages are active cells, and their functions involve interactions with a variety of different cell types, including direct cell-cell contact14,15, as well as more indirect methods such as the secretion of soluble factors2,16, which are essential for niche regulation. While classical immunofluorescent imaging is useful to begin unraveling these interactions, it is limited by depicting only a single snapshot in time, thereby omitting numerous timepoints critical to a highly dynamic regenerative process17,18. As the importance of timing and the emergence of different waves of regeneration come into sharper focus, it is essential to dissect these processes in greater detail.
Radiotherapy is a life-saving treatment for many people diagnosed with cancer. While often effective at shrinking or eliminating the tumor(s), radiotherapy can also damage healthy tissues lying in the radiation field and elicit an immune response. Radiation injury can induce rapid macrophage recruitment, and direct and indirect immunomodulatory responses19,20. The salivary glands are often inadvertently irradiated during treatment for head and neck cancer21,22, leading to epithelial damage, cell atrophy, and fibrosis23,24, resulting in xerostomia or chronic dry mouth25.
The salivary gland is composed of a plethora of cell types and structures, including but not limited to epithelial cells (both saliva-producing acinar cells and saliva-transporting ductal cells), myoepithelial cells, epithelial progenitor cells, nerves, blood vessels, immune cells, fibroblasts, and extracellular matrix (ECM). The role and response of many of these cell types in the regenerative response have been previously described26,27,28,29,30. However, how these different cells interact during homeostasis and regeneration, and particularly how immune cells such as macrophages behave, is less well studied. This manuscript describes a newly established method to study the live interactions between SMG macrophages and other cells of interest in ex vivo tissue. The SMG is sliced on a vibratome, stained for surface markers, and imaged for up to 12 h. Using this method, phagocytosis of surrounding cells by macrophages can be observed, macrophage migration kinetics can be studied, and direct cell-cell interactions between macrophages and epithelial cells can be demonstrated.

تسليط الضوء على المؤلف: دراسة تفاعلات الخلايا الظهارية البلاعم في تجديد الغدة اللعابية بعد الإصابة 

استجواب تفاعلات الخلايا الخلوية في الغدة اللعابية عبر تصوير الخلايا الحية خارج الجسم الحي

My research delves into the immune system's role in regeneration and repair. I focus on understanding how macrophages interact with epithelial progenitor cells during salivary gland regeneration injury, and how this interaction shapes the repair process. Within the fields of immunology and regenerative medicine, recent clinical trials based at the University of Edinburgh have shown that delivery of macrophages as a therapy for liver psoriasis is effective in reducing liver scarring, and is a viable treatment for liver failure.Using and ex vivo precision cut slice culture model coupled with live imaging of fluorescent-labeled cells, allows us to explore cell-to-cell interactions in real-time, but in a state that closely resembles tissue in vivo. Understanding the localization of macrophages after injury gives us an idea of what cell types macrophages preferentially interact with after injury. This ultimately allows us to use other methods, such as single-cell RNA sequencing analysis, to try and unravel the molecular basis of such interactions to inform future therapeutic options.We will explore the bidirectional signaling between macrophages and epithelial cells and test whether saliva gland homeostasis can be rescued by exogenous replacement of these missing signals.

لا تزال استجابة الضامة للإصابة في الغدة اللعابية تحت الفك السفلي غير معروفة. وهذا يشمل ما إذا كانت تتمركز وتهاجر إلى هياكل محددة داخل الغدة ، وكذلك المسافة والسرعة التي تهاجر بها. كان من الصعب تحديد ذلك من خلال أساليب التصوير الثابت.
لمعالجة هذا ، تم تطوير نهج التصوير الحي لدراسة تفاعل الخلايا الظهارية البلاعم في الوقت الفعلي. تم دمج تلطيخ الشرائح المناعي مع نموذج فأر تتبع النسب المسمى داخليا (الشكل 1 أ والشكل 2 أ). في هذا النموذج ، تعرضت الشرائح ل 10 Gy من تشعيع جاما للحث على إصابة التشعيع وتم تصويرها في 2 ساعة و 3 أيام و 4 أيام بعد التشعيع (IR) ، مع شرائح غير مشعة تعمل كعناصر تحكم. تم الحصول على البيانات من أربع قنوات: Hoechst (باستخدام الليزر 425 لتقليل السمية الضوئية) ، GFP (488) ، dTomato (561) ، و Alexa 647 (640). تم إجراء مكدس z ، وتم التقاط صورة كل 2-3 ميكرومتر ، مع جمع ما مجموعه 30 إلى 40 طائرة ، مما أدى إلى ارتفاع إجمالي يتراوح بين 80 و 90 ميكرومتر.
باستخدام هذه التقنية وتحليل إشارة الطماطم المرتبطة بالغشاء (mT) ونشاط Caspase3 / 7 ، أصبح من الواضح أن شرائح النمط العضوي احتفظت بهيكلها الظهاري ، ونجت في الثقافة ، وأظهرت الحد الأدنى من موت الخلايا. أظهرت البيانات أن الشرائح غير المشععة من الغدة تحت الفك السفلي من الفئران R26mTmG 32 ، المستزرعة لمدة 7 أيام ، احتفظت بإشارة mT والبنية الظهارية (الشكل 1B). ومع ذلك ، في 3 أيام بعد التشعيع خارج الجسم الحي ، كان ضمور الخلايا العنيبية والقنوية واضحا (الشكل 1 ب ؛ هياكل العنيبات والأقنية التي أبرزتها خطوط بيضاء وخضراء متقطعة ، على التوالي) ، بما يتفق مع إصابة الإشعاع في الجسم الحي 13. كان موت الخلايا المبرمج ضئيلا في الشرائح غير المشععة ، ولكن كان هناك دليل على وجود خلايا Caspase 3/7+ في الشرائح المشععة في 4 أيام بعد التشعيع (الشكل 1C ؛ الأسهم الخضراء) ، على غرار الإصابة في الجسم الحي 33,34. علاوة على ذلك ، فإن الشرائح المشععة تلخص تلف الحمض النووي في الجسم الحي 34،35،36،37 ، كما هو موضح في ارتفاع γH2AX38 مقارنة بالضوابط غير المشععة (الشكل 1D ، E). وهكذا ، أظهرت شرائح الغدد اللعابية ذات النمط العضوي قابلية جيدة للحياة في الثقافة واستجابت بشكل مشابه للأنسجة في الجسم الحي للتشعيع.
بعد ذلك ، تم التحقيق في تفاعلات الخلايا الخلوية في الوقت الفعلي. لوحظت البلاعم التي تتفاعل مباشرة مع الخلايا السلفية الظهارية التي تحمل علامة GFP (Krt14CreER-GFP) على مدى فترة زمنية مدتها 12 ساعة في 3 أيام بعد الأشعة تحت الحمراء (الشكل 2A والفيديو 1). ومن اللافت للنظر أنه كان من الواضح أن البلاعم ظلت على مقربة من الخلايا السلفية الظهارية لساعات ، وغالبا ما بقيت على اتصال طوال فترة التصوير البالغة 12 ساعة. علاوة على ذلك ، لوحظ البلعمة في الوقت الحقيقي للخلايا الظهارية بواسطة البلاعم ، مما يؤكد أن البلاعم تؤدي وظيفتها التقليدية في نموذج زراعة الشرائح (الشكل 2B ومقاطع الفيديو 2 والفيديو 3). حددت هذه التقنية أيضا أن البلاعم ثابتة نسبيا أثناء كل من الاتزان الداخلي وبعد الإصابة بالإشعاع ، ويرجع ذلك على الأرجح إلى كثافتها العالية داخل الأنسجة. يوضح هذا ، لأول مرة ، أن بلاعم الغدد اللعابية لا تهاجر على نطاق واسع أثناء الاتزان الداخلي أو بعد الإصابة بالتشعيع. ومع ذلك ، في حين أن البلاعم لم تظهر هجرة كبيرة ، أظهرت الأنسجة المحيطة ديناميكيات متزايدة بعد التشعيع ، مع تفاعل الضامة المتعددة بنشاط حول مجموعات من الخلايا الظهارية الموصوفة. بالإضافة إلى ذلك ، استنادا إلى التلوين النووي فقط ، سمحت لنا هذه التقنية بتصور حركة الخلية داخل الشريحة بمرور الوقت ، غالبا مع ظهور قنوات كاملة "تهاجر" داخل الأنسجة (الفيديو 4). بمرور الوقت أثناء عملية الاستزراع ، أصبح من الواضح أن الشرائح تحولت من شكل مسطح إلى مورفولوجيا تشبه الكرة ، مما يشير إلى أن حركة الخلية داخل الشريحة من المحتمل أن تكون بسبب إعادة ترتيبها في بنية تشبه الكرة ، تشبه حدث إعادة التنظيم المحتمل.
أخيرا ، يمكن استخدام بيانات التصوير الحية الناتجة عن هذا الفحص لقياس سلوك الخلية كميا ، مثل الهجرة. يمكن اكتشاف الخلايا الفردية وتجزئتها (الشكل 3 أ) ، ويمكن قياس الهجرة باستخدام برنامج تصوير وتحليل متاح تجاريا (انظر جدول المواد والفيديو 5). علاوة على ذلك ، يمكن إجراء أقرب تحليل للكائن لتحديد ما إذا كانت الخلايا ، في هذه الحالة ، البلاعم ، تهاجر بالقرب من الخلايا الأخرى ذات الأهمية ، في هذه الحالة ، خلايا Krt14CreER-GFP + ، وكيف تتغير هذه الديناميكية بمرور الوقت (الشكل 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65819/65819fig1.jpg"> الشكل 1: تلخيص الاستجابة في الجسم الحي في شرائح أنسجة الغدد اللعابية المقطوعة بدقة. (أ) رسم تخطيطي للبروتوكول التجريبي. (ب) صور تمثيلية للطماطم المرتبطة بالغشاء التي تم الحصول عليها من أنسجة الغدة تحت الفك السفلي الطازجة (SMG) ، أو شرائح SMG غير المعالجة المزروعة لمدة 7 أيام ، أو شرائح SMG المشععة بجرعة واحدة من 10 Gy أشعة جاما قبل 3 أو 7 أيام. تشير الخطوط البيضاء المتقطعة إلى أمثلة الهياكل acinar ، وتشير الخطوط الخضراء المتقطعة إلى أمثلة الهياكل القنية. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (C) صور تمثيلية لتعبير Caspase-3/7 تم الحصول عليها من شرائح SMG غير المعالجة أو شرائح SMG المشععة بجرعة واحدة من 10 Gy أشعة جاما قبل 2 ساعة أو 4 أيام. تشير رؤوس الأسهم الخضراء إلى نوى موجبة. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (د) صور تمثيلية لتعبير γH2AX تم الحصول عليها من شرائح SMG غير المعالجة أو شرائح SMG المشععة بجرعة واحدة من إشعاع جاما 10 Gy قبل 3 أيام. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. (E) التعبير التمثيلي ل γH2AX في الخلايا الظهارية EpCAM + من شرائح SMG غير المعالجة أو شرائح SMG المشععة بجرعة واحدة من 10 Gy تشعيع جاما قبل 2 ساعة و 3 أيام. SSA = منطقة التشتت الجانبي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65819/65819fig1large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65819/65819fig2.jpg"> الشكل 2: التصوير الحي للتداخلات بين الخلايا الطلائية والبلعمة البلعمية. (أ) صور ثابتة متسلسلة للتفاعلات بين الخلايا السلفية KRT14+ وذريتها (خلايا Krt14CreER-GFP +) والبلاعم بعد التشعيع. يلتقط التصوير الخلوي الحي الديناميكيات الخلوية على مدار 90 دقيقة. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. الفيديو المرتبط هو الفيديو 1. (ب) صور ثابتة متسلسلة لخلية بلاعمية تبتلع خلية طلائية. يظهر التصوير الخلوي الحي العملية على مدى 60 دقيقة. تشير الأسهم البيضاء إلى البلاعم ، وتشير الأسهم الصفراء إلى نواة الخلية التي تمر بالبلعمة. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الفيديو المرتبط هو الفيديو 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65819/65819fig2large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65819/65819fig3.jpg"> الشكل 3: التصوير الحي لتحليل الديناميات الخلوية. (أ) صورة توضح تحديد الخلايا الفردية وتجزئتها لتحليل معلمات السلوك الخلوي، مثل الهجرة (انظر الفيديو 5). الخلايا شبه ملونة بشكل عشوائي للخلية الفردية وتمييز المسار. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (B) تحديد المسافة (بالميكرومتر) لأقرب كائن إلى خلايا Krt14CreER-GFP + الفردية المرسومة على مدى 10 نقاط زمنية (الصور الملتقطة كل 5 دقائق). البيانات المقدمة كمتوسط القيمة لكل بئر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65819/65819fig3large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
فيديو 1: تصوير حي يكشف عن تفاعلات ديناميكية بين الخلايا السلفية KRT14 + / النسل والبلاعم بعد التشعيع. تعرضت الشرائح لجرعة واحدة من تشعيع جاما 10 جراي قبل التصوير الحي. يتم تمثيل خلايا Krt14CreER-GFP + باللون الأخضر ، والبلاعم (F4 / 80+) باللون الأحمر ، والنوى باللون السماوي. يتكون الفيديو من مكدس z واحد ، يمتد على فترة ثقافة مدتها 12 ساعة مع التقاط الصور كل 15 دقيقة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65819/Elder%20et%20al_Video%201.mp4" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتحميل الفيديو.</a>
فيديو 2: تصوير حي يلتقط البلاعم التي تبتلع خلية ظهارية. تظهر البلاعم (F4 / 80+) باللون الأحمر ، وتظهر النوى باللون السماوي. يتكون الفيديو من مكدس z واحد ويمتد على فترة ثقافة مدتها 12 ساعة مع التقاط الصور كل 15 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65819/Elder%20et%20al_Video%202.wmv" target="_blank">دقيقة.يرجى النقر هنا لتنزيل الفيديو.</a>
فيديو 3: أقصى تصوير حي للإسقاط يظهر بلاعم تبتلع خلية ظهارية. يتم عرض البلاعم (F4 / 80+) باللون الأحمر ، وتظهر النوى باللون السماوي. يتميز الفيديو بحد أقصى لعرض صور z-stack يبلغ مجموعها 80 ميكرومتر (يتم تقديم مستوى واحد في الفيديو 2) ويمتد على فترة استزراع مدتها 12 ساعة مع التقاط الصور كل 15 دقيقة.يرجى <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65819/Elder%20at%20al_Video%203.wmv" target="_blank">النقر هنا لتنزيل الفيديو.</a>
فيديو 4: تصوير حي يوضح السلوك الديناميكي لظهارة الغدد اللعابية في الثقافة بعد التشعيع. تعرضت الشرائح لجرعة واحدة من تشعيع غاما 10 غراي قبل التصوير الحي. يتم تمثيل البلاعم (F4 / 80+) باللون الأحمر ، والنوى باللون السماوي. يتكون الفيديو من مكدس z واحد ، يمتد على فترة ثقافة مدتها 12 ساعة مع التقاط الصور كل 15 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65819/Elder%20et%20al_Video%204.wmv" target="_blank">دقيقة.يرجى النقر هنا لتنزيل الفيديو.</a>
فيديو 5: تتبع ترحيل الخلايا الكمي بمرور الوقت. يوضح هذا الفيديو التتبع الفردي لمسارات الخلايا من مقاطع فيديو التصوير المباشر. تشير الأسهم إلى مسارات الخلايا ، وتكون الخلايا شبه ملونة بشكل فردي. يتكون الفيديو من مكدس z واحد ويمتد على فترة ثقافة 1 ساعة مع التقاط الصور كل 15 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65819/Elder%20at%20al_Video%205.wmv" target="_blank">دقيقة.الرجاء النقر هنا لتنزيل الفيديو.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Studying Macrophage-Epithelial Cell Interactions in Salivary Gland Regeneration After Injury at JoVE.com

التصوير المناعي الفلوري مقيد بالقدرة على مراقبة العمليات البيولوجية المعقدة التي تعتمد على الوقت في لقطة واحدة فقط في الوقت المناسب. تحدد هذه الدراسة نهج التصوير المباشر الذي تم إجراؤه على شرائح الغدة تحت الفك السفلي للفأر المقطوعة بدقة. يسمح هذا النهج بالمراقبة في الوقت الفعلي للتفاعلات بين الخلايا الخلوية أثناء الاتزان الداخلي وعمليات التجديد والإصلاح.

Salivary gland regeneration is a complex process involving intricate interactions among various cell types. Recent studies have shed light on the pivotal ...

يتعمق بحثي في دور الجهاز المناعي في التجديد والإصلاح. أركز على فهم كيفية تفاعل البلاعم مع الخلايا السلفية الظهارية أثناء إصابة تجديد الغدد اللعابية ، وكيف يشكل هذا التفاعل عملية الإصلاح. في مجالات علم المناعة والطب التجديدي ، أظهرت التجارب السريرية الحديثة في جامعة إدنبرة أن توصيل البلاعم كعلاج لصدفية الكبد فعال في تقليل تندب الكبد ، وهو علاج قابل للتطبيق لفشل الكبد.يتيح لنا استخدام نموذج زراعة شرائح القطع الدقيقة خارج الجسم الحي إلى جانب التصوير الحي للخلايا ذات العلامات الفلورية استكشاف التفاعلات من خلية إلى خلية في الوقت الفعلي ، ولكن في حالة تشبه إلى حد كبير الأنسجة في الجسم الحي. إن فهم توطين البلاعم بعد الإصابة يعطينا فكرة عن أنواع الخلايا التي تتفاعل معها البلاعم بشكل تفضيلي بعد الإصابة. هذا يسمح لنا في النهاية باستخدام طرق أخرى ، مثل تحليل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية ، لمحاولة كشف الأساس الجزيئي لمثل هذه التفاعلات لإبلاغ الخيارات العلاجية المستقبلية.سنستكشف الإشارات ثنائية الاتجاه بين الخلايا البلعمية الكبيرة والخلايا الطلائية، ونختبر إذا ما كان يمكن إنقاذ الاتزان الداخلي لغدة اللعاب عن طريق الاستبدال الخارجي لهذه الإشارات المفقودة.

interrogating-cell-cell-interactions-salivary-gland-via-ex-vivo-live

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Interrogating Cell-Cell Interactions in the Salivary Gland via Ex Vivo Live Cell Imaging

905 Views.  The University of Edinburgh. يتعمق بحثي في دور الجهاز المناعي في التجديد والإصلاح. أركز على فهم كيفية تفاعل البلاعم مع الخلايا السلفية الظهارية أثناء إصابة تجديد الغدد اللعابية ، وكيف يشكل هذا التفاعل عملية الإصلاح. في مجالات علم المناعة والطب التجديدي ، أظهرت التجارب السريرية الحديثة في جامعة إدنبر?...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: دراسة تفاعلات الخلايا الظهارية البلاعم في تجديد الغدة اللعابية بعد الإصابة 

Salivary gland regeneration is a complex process involving intricate interactions among various cell types. Recent studies have shed light on the pivotal role played by macrophages in driving the regenerative response. However, our understanding of this critical role has primarily relied on static views obtained from fixed tissue biopsies. To overcome this limitation and gain insights into these interactions in real time, this study outlines a comprehensive protocol for culturing salivary gland tissue ex vivo and capturing live images of cell migration.
The protocol involves several key steps: First, mouse submandibular salivary gland tissue is carefully sliced using a vibratome and then cultured at an air-liquid interface. These slices can be intentionally injured, for instance, through exposure to radiation, to induce cellular damage and trigger the regenerative response. To track specific cells of interest, they can be endogenously labeled, such as by utilizing salivary gland tissue collected from genetically modified mice where a particular protein is marked with green fluorescent protein (GFP). Alternatively, fluorescently-conjugated antibodies can be employed to stain cells expressing specific cell surface markers of interest. Once prepared, the salivary gland slices are subjected to live imaging using a high-content confocal imaging system over a duration of 12 h, with images captured at 15 min intervals. The resulting images are then compiled to create a movie, which can subsequently be analyzed to extract valuable cell behavior parameters. This innovative method provides researchers with a powerful tool to investigate and better understand macrophage interactions within the salivary gland following injury, thereby advancing our knowledge of the regenerative processes at play in this dynamic biological context.

Immunofluorescent imaging is constrained by the ability to observe complex, time-dependent biological processes in just a single snapshot in time. This study outlines a live-imaging approach conducted on precision-cut mouse submandibular gland slices. This approach allows for the real-time observation of cell-cell interactions during homeostasis and the processes of regeneration and repair.

Collection, Embedding, Sectioning, and Staining of the Mouse Submandibular Salivary Gland for Live Cell Imaging of Cell-Cell Interactions

To begin, use forceps to remove any fat and connective tissue from the dissected submandibular salivary gland of a euthanized mouse. Then place the gland in a collection tube with ice cold HBSS solution. Next, use forceps to cut the gland into one centimeter square pieces.Heat 4%agarose to 50 degrees Celsius, and pour the solution into a 35 millimeter dish. Pour a small amount of the agarose solution into a separate dish and add the gland pieces into it. Then swirl the pieces in the excess agarose to coat it.Next place four to six pieces of the gland flat in the first dish with agarose. Place the lid on the dish and transfer it to an ice box, covering the plate with ice to cool and set. To section the gland pieces, first, use a scalpel to carefully cut around the gland embedded agarose block.Next, apply a drop of super glue to the agarose block and attach it to the stage of a vibratome. Now fill the vibratome chamber with ice cold PBS containing 1%penicillin streptomycin. With a scalpel, trim off any excess agarose and create five millimeter gaps between each piece of gland.Align the vibratome blade with the agarose block and set the start and end points of the sections. Cut the tissue block into 150 micrometer thick sections at a low speed and high vibration. Once the sections have been cut, use a paintbrush to pick up the slices and place them in a dish with prewarmed RPMI media containing the antibiotics.To culture the submandibular slices, first, add 1.5 milliliters of RPMI media to the wells of a six well plate. Place 0.4 micrometer filters into the wells. Next, with the help of a paintbrush, carefully transfer one to six slices onto each filter.Then incubate the plate at 37 degrees Celsius under 5%carbon dioxide. After irradiating some experimental plates with gamma radiation to induce injury, return the plates to the incubator. Next, fill the wells of a 24 well plate with 500 microliters of culture media.With a paintbrush, lift the slices from the filter and gently submerge them in the wells. Incubate the slices in the relevant nuclear stains. Then incubate the slices with antibodies for two hours at 37 degrees Celsius under gentle agitation.Submerge the slices in culture media three times to wash them. Let the slices incubate in each wash solution for 10 minutes at room temperature under gentle agitation. Next, use forceps to remove the tape from a double-sided imaging spacer.Stick the spacer to the bottom of a glass-bottomed six well plate, then pipette 50 microliters of media into the gap in the center of the spacer. Place the slice into the media ensuring it lays flat. Then with a pipette, carefully remove 20 microliters of the media from the gap.Use forceps to carefully remove the tape from the top side of the spacer and place a 25 millimeter circular cover slip over it. Press around the spacer edges to ensure firm attachment of the cover slip. Image the slice on a confocal microscope.Non-irradiated slices of the submandibular gland cultured for seven days retained their MT signal and epithelial architecture. However, at three days post-irradiation, acinar and ductal cell atrophy was observed. Caspase positive cells were seen at four days post-irradiation.Elevated gamma H2AX was observed in irradiated slices, indicative of in vivo DNA damage. Realtime imaging of macrophages confirmed phagocytosis of epithelial cells in the slice culture model. Individual cells can be detected and segmented for subsequent analysis of cell behavior, such as migration.