저자들은 고품질 다중 면역형광 및 IHC 처리를 위한 기술 지침을 제공한 임상 병리학 연구소 West China Hospital의 구성원에게 감사의 뜻을 전합니다. 이 프로토콜은 중국 국립 자연 과학 재단(82200078)의 지원을 받았습니다.

이 프로토콜은 중국 쓰촨 대학교 화경 병원 윤리 위원회의 지침에 의해 승인되었습니다. 폐암 조직 샘플은 West China Hospital의 폐암 센터에서 수술 중에 획득되었으며 각 환자로부터 정보에 입각한 동의를 얻었습니다.
1. 조직 절편 준비
<ol><li>FFPE 준비<ol><li>임상 조직을 중성 포르말린 용액에 72시간 이상 담그십시오.</li>
		<li>크실렌과 등급이 매겨진 알코올 용액을 사용하여 조직을 탈수하는 과정을 완료하십시오20.</li>
		<li>4μm 절편 두께에서 수동 파라핀 포매 및 조직 절편을 수행합니다. 접착 현미경 슬라이드를 사용하여 조직 조각이 떨어지지 않도록 합니다.</li>
		<li>슬라이드를 65°C의 오븐에서 2시간 동안 굽고 티슈와 슬라이드가 건조되도록 합니다. 실온의 슬라이드 박스에 보관하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>조직 절편 전처리<ol><li>티슈 슬라이드를 65°C의 오븐에서 5분 동안 전처리한 후 2 x 15분 동안 크실렌 용액, 2 x 15분 동안 무수 에탄올 용액, 10분 동안 90% 에탄올 용액, 10분 동안 85% 에탄올 용액, 10분 동안 80% 에탄올 용액, 10분 동안 75% 에탄올 용액에 순차적으로 담그고, 그런 다음 살균수로 슬라이드를 3 x 1분 동안 세척합니다. 주: 이 실험적인 기술은 FFPE 조직을 위해서서만 사용될 수 있습니다, 다수 고열 항원 수선 과정으로 인해 조직이 활주에서 떨어지기 때문에, 얼거나 신선한 조직을 위해 아닙니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 1차 항체의 최적화
참고: 기존의 IHC 실험은 주로 항체 농도 및 항원 복구 조건을 포함하여 개별 항체의 배양 조건을 결정하는 데 사용되었습니다. 항체 사용 설명서의 조건을 참조하십시오.
<ol><li>권장 농도 범위 및 중간 값보다 약간 높은 항체 농도를 사용하십시오.</li>
	<li>단백질 발현 위치에 따라 항원 회수 완충액 루틴 PH6 및 PH9를 최적화합니다. 핵에서 발현되는 단백질에는 PH9을 사용하고 다른 단백질에는 루틴(PH6 또는 PH9)을 사용합니다.</li>
</ol>3. mIHC 염색 방법
참고: 오팔 mIHC 염색은 사용 가능한 mIHC 방법 중 하나입니다. 이 실험적인 5색 프로토콜에서는 각 조직 샘플을 4개의 항체로 염색해야 하므로 4개의 1차 항체 배양, 2차 항체 배양 및 TSA 신호 증폭 발색 배양과 5개의 항원 수복물이 필요합니다. 마지막으로, 4'6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI) 염색 및 항 형광 파열제 밀봉을 수행합니다.
<ol><li>주요 시약 준비 알림: 조직 슬라이드의 크기에 따라 추가할 시약의 양을 결정하십시오. 조직 섹션을 완전히 덮을 수 있는 충분한 양을 사용합니다(일반적으로 슬라이드당 50-150μL). 실험에 필요한 작업 솔루션은 다음과 같이 준비됩니다.<ol><li>세척 완충액 작업 용액: 20x 세척 완충액을 이중 증류수로 1:20에 희석하고 실온에서 보관합니다.</li>
		<li>PH6 완충액 작업 용액: 100x PH6 완충액을 이중 증류수로 1:100으로 희석합니다. 사용하기 전에 준비하고 실온에서 보관하십시오.</li>
		<li>PH9 완충액 작업 용액: PH9 완충액 50배를 이중 증류수로 1:50에 희석합니다. 사용하기 전에 준비하고 실온에서 보관하십시오.</li>
		<li>폴리머 HRP: 토끼 및 생쥐 유래의 1차 항체에만 바로 사용할 수 있는 이 용액을 준비합니다.</li>
		<li>형광단 작업 용액: 각 형광단 분말(형광단 780 제외)을 75μL의 DMSO로 재구성합니다. 각 절차 전에 형광단을 1:100에 1x 증폭 희석액으로 희석합니다. 형광단 작업 용액의 사용하지 않은 부분은 모두 폐기하십시오.</li>
		<li>형광단 780 작업 용액: TSA-DIG를 DMSO 75μL에서 재구성하고 형광단 분말 780을 이중 증류수 300μL로 재구성합니다. 시술 전에 TSA-DIG를 1:100에 1x 증폭 희석제로 희석하고 형광단 780을 Ab 희석제로 1:25에 희석합니다.</li>
		<li>DAPI 작업 용액: DAPI 용액을 이중 증류수 또는 PBS로 1:50에 희석합니다. 사용하기 전에 준비하고 4 °C에서 48 시간 이상 보관하지 마십시오. 메모. 이 다중 라벨 형광 염색 실험 동안 이중 증류수와 갓 준비된 세척 완충액 작업 용액으로만 슬라이드를 세척하십시오. 조직 절편이 수돗물과 접촉해서는 안 됩니다. 수돗물의 오염 물질은 조직 절편에 부착되어 자가형광을 유발할 수 있습니다. 실험 내내 샘플을 빛으로부터 멀리 두십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>항원 검색<ol><li>슬라이드를 염색 및 수리 상자에 넣고 PH6 또는 PH9 버퍼 작업 용액으로 채우고 뚜껑을 덮은 다음 전자레인지에서 2% 전력으로 8 x 100분 동안 가열합니다. 알림: 가열 과정에서 수리 상자에 이중 증류수를 추가하여 슬라이스를 건조시킬 수 있는 과도한 증발을 방지하십시오.</li>
		<li>진행하기 전에 슬라이드를 실온에서 식히십시오(30-60분).</li>
		<li>이중 증류수로 슬라이드를 3 x 2분 동안 세척합니다. 소수성 배리어 펜을 사용하여 슬라이드의 조직 부분을 둘러쌉니다.</li>
	</ol></li>
	<li>블로킹<ol><li>조직 절편을 세척 완충액에 담그고 차단 용액으로 덮고 실온의 가습 챔버에서 10분 동안 슬라이드를 배양합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>1차 항체 배양<ol><li>슬라이드에서 차단 용액을 제거하고 1차 항체 작용 용액으로 조직 부분을 덮습니다. 슬라이드를 가습 챔버에서 인큐베이터에서 37°C에서 1시간 동안 또는 냉장고에서 4°C에서 밤새 배양합니다. 알림: 슬라이드가 마르지 않도록 하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>폴리머 HRP 소개<ol><li>세척 완충액 작업 용액에서 슬라이드를 3 x 2분 동안 세척합니다. 폴리머 HRP를 조직 절편에 직접 적가하고 실온에서 15분 동안 배양합니다. 알림: 냉장고에 보관된 슬라이드의 경우 세척하기 전에 약 30분 동안 실온에 보관하여 1차 항체를 제거하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>티라민 신호 증폭(TSA) 생성<ol><li>세척 완충 작업 용액으로 슬라이드를 3 x 2분 동안 세척하고 형광단 작업 용액을 조직 섹션에 직접 적하 방향으로 추가하고 실온에서 10분 동안 배양합니다. 세척 버퍼 작업 용액으로 슬라이드를 3 x 2분 동안 세척합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>fluorophore 780을 위한 특수 절차 참고: 형광단 780은 약하며 전체 실험의 색상 일치 체계에서 일상적으로 마지막에 배치됩니다. Fluorophore 780은 일반적으로 이 실험 프로토콜에서 사용되지 않지만 특이성으로 인해 실험 단계가 나열되어 있습니다.<ol><li>TSA-DIG 소개<ol><li>세척 완충 작업 용액으로 슬라이드를 3 x 2분 동안 세척하고 TSA-Drg 작업 용액을 조직 섹션에 적하 방향으로 첨가하고 실온에서 10분 동안 배양합니다.</li>
		</ol></li>
		<li>마이크로파 처리<ol><li>세척 버퍼 작업 용액으로 슬라이드를 3 x 2분 동안 세척합니다.</li>
			<li>슬라이드를 염색 및 수리 상자에 넣고 수리 용액으로 채우고 뚜껑을 덮고 전자레인지에서 2% 전력으로 8 x 100분 동안 가열합니다. 진행하기 전에 슬라이드를 실온에서 식히십시오(30-60분).</li>
			<li>이중 증류수로 슬라이드를 3 x 2분 동안 세척합니다.</li>
		</ol></li>
		<li>Fluorophore 780 신호 발생<ol><li>섹션을 세척 버퍼에 담그고 형광단 780 작업 용액으로 덮고 실온에서 1시간 동안 가습 챔버에서 슬라이드를 배양합니다.</li>
			<li>세척 버퍼 작업 용액으로 슬라이드를 3 x 2분 동안 세척합니다. 알림: 이 단계 후에 마이크로파 처리를 수행하지 마십시오.</li>
		</ol></li>
		<li>fluorophore 780을 전체 워크플로우의 마지막 단계로 사용한 다음 DAPI 작업 용액으로 핵을 직접 염색합니다. 알림: 형광단 780을 사용하지 않는 경우 3.7단계를 건너뜁니다.</li>
	</ol></li>
	<li>마이크로파 처리 참고: 이 마이크로파 단계는 1차-2차 HRP 복합체를 제거하고 항원을 다시 노출시켜 다음 1차 항체를 도입할 수 있도록 합니다.<ol><li>슬라이드를 염색 및 수리 상자에 넣고 PH6 또는 PH9 완충 작업 용액으로 채우고 뚜껑을 덮은 다음 전자레인지에서 2% 전력으로 8 x 100분 동안 가열합니다.</li>
		<li>진행하기 전에 슬라이드를 실온에서 식히십시오(30-60분). 이중 증류수로 슬라이드를 3 x 1분 동안 세척합니다.</li>
		<li>세척 버퍼 작업 용액에 2분 동안 담그십시오. 다음 항체 배양을 수행합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>다음 항체 배양<ol><li>3.2-3.8단계를 반복합니다(3.7단계 제외).</li>
	</ol></li>
	<li>세포 핵 염색 및 조직 밀봉<ol><li>DAPI 작업 용액으로 조직 절편을 덮고 실온에서 5분 동안 가습 챔버에서 슬라이드를 배양합니다. 이중 증류수로 슬라이드를 3 x 2분 동안 세척합니다.</li>
		<li>슬라이드에서 물방울을 제거하고 각 슬라이드에 10-20μL의 항형광 소광제를 추가한 다음 현미경 커버 유리로 슬라이드를 밀봉합니다.</li>
		<li>완성된 슬라이드를 빛으로부터 보호하여 4°C에서 1개월 이상 보관합니다. 알림: 기포가 발생하지 않도록 주의하십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>4. 네거티브 컨트롤 설정
<ol><li>필름 스캔 시 조직 자가형광을 제거하는 데 사용되는 1차 항체, 2차 항체, TSA 시약 및 DAPI와 같은 시약을 추가하지 않고 조직 함유 슬라이드와 같이 음성 대조군 슬라이드를 처리합니다.</li>
</ol>5. 조직 슬라이드의 완전 자동 스캐닝
참고: 스펙트럼 이미징에 사용되는 장비는 완전 자동화된 다중 스펙트럼 조직 정량 분석기이며, 참조 시스템을 사용하여 5색 슬라이드의 이미징 및 분석 시각화를 수행할 수 있습니다( 재료 표 참조). 이 시스템은 다중 형광단 및 조직 자가형광의 정량적 불혼합을 위해 다중 스펙트럼 이미징을 사용합니다.
<ol><li>각 형광 채널에 대한 노출 시간과 스캐닝 프로그램을 수동으로 설정하고 기기가 조직 슬라이드의 완전 자동 노출 및 스캐닝을 완료했는지 확인합니다. 알림: 슬라이드 표면은 깨끗하고 수막이 없어야 합니다. 실러의 양에 주의하십시오: 너무 많으면 커버슬립이 미끄러지고 기기가 오류를 보고할 수 있습니다.</li>
</ol>6. 형광 분석
<ol><li>소프트웨어를 두 번 클릭하고( 재료 표 참조) 원본 스캔에서 얻은 다색 형광 이미지 파일을 소프트웨어로 드래그한 다음 이미지 유형을 형광으로 설정합니다.</li>
	<li>밝기 및 대비 버튼을 클릭하고 패널에서 채널을 확인합니다. 바깥쪽을 클릭한 다음 채널을 클릭하여 관심 있는 형광 채널을 선택합니다. 최소 디스플레이와 최대 디스플레이를 드래그하여 각 채널의 밝기와 대비를 조정합니다.</li>
	<li>분석 후 저장할 뷰를 결정하고 슬라이드 개요 표시 및 커서 위치 표시 를 클릭하여 이 두 내용을 제거하고 축척 막대를 유지한 다음 파일 | 스냅샷 내보내기 | 현재 뷰어 콘텐츠를 사용하여 png 파일을 내보낼 수 있습니다. 참고: 모든 형광 채널과 병합된 그림은 향후 분석을 위해 내보내야 합니다.</li>
	<li>표적 세포 양성의 추가 분석을 위해, 세포 동정 및 분할 소프트웨어(21 )를 사용한다( 재료 표 참조).</li>
</ol>

폐 편평 암종에서 mIHC를 사용한 종양 미세환경 해독

<ol>
	<li>Zaidi, A. U., Enomoto, H., Milbrandt, J., Roth, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+fluorescent+in+situ+hybridization+and+immunohistochemical+detection+with+tyramide+signal+amplification.">Dual fluorescent in situ hybridization and immunohistochemical detection with tyramide signal amplification.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 48 (10), 1369-1375 (2000).</li><li>Lovisa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-to-mesenchymal+transition+induces+cell+cycle+arrest+and+parenchymal+damage+in+renal+fibrosis.">Epithelial-to-mesenchymal transition induces cell cycle arrest and parenchymal damage in renal fibrosis.</a> Nature Medicine. 21 (9), 998-1009 (2015).</li><li>Nghiem, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+blockade+with+pembrolizumab+in+advanced+Merkel-cell+carcinoma.">PD-1 blockade with pembrolizumab in advanced Merkel-cell carcinoma.</a> The New England Journal of Medicine. 374 (26), 2542-2552 (2016).</li><li>Zaretsky, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+associated+with+acquired+resistance+to+PD-1+blockade+in+melanoma.">Mutations associated with acquired resistance to PD-1 blockade in melanoma.</a> The New England Journal of Medicine. 375 (9), 819-829 (2016).</li><li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heterogeneous+immune+landscape+between+lung+adenocarcinoma+and+squamous+carcinoma+revealed+by+single-cell+RNA+sequencing.">The heterogeneous immune landscape between lung adenocarcinoma and squamous carcinoma revealed by single-cell RNA sequencing.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 7 (1), 289 (2022).</li><li>Becheva, Z. R., Gabrovska, K. I., Godjevargova, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+between+direct+and+indirect+immunofluorescence+method+for+determination+of+somatic+cell+count.">Comparison between direct and indirect immunofluorescence method for determination of somatic cell count.</a> Chemical Papers. 72, 1861-1867 (2018).</li><li>Niedenberger, B. A., Geyer, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+immunostaining+approaches+to+study+early+male+germ+cell+development.">Advanced immunostaining approaches to study early male germ cell development.</a> Stem Cell Research. 27, 162-168 (2018).</li><li>Granier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tim-3+expression+on+tumor-infiltrating+PD-1+CD8++T+cells+correlates+with+poor+clinical+outcome+in+renal+cell+carcinoma.">Tim-3 expression on tumor-infiltrating PD-1+CD8+ T cells correlates with poor clinical outcome in renal cell carcinoma.</a> Cancer Research. 77 (5), 1075-1082 (2017).</li><li>Badoual, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1-expressing+tumor-infiltrating+T+cells+are+a+favorable+prognostic+biomarker+in+HPV-associated+head+and+neck+cancer.">PD-1-expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer.</a> Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).</li><li>Meany, D. L., Hackler, L., Zhang, H., Chan, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyramide+signal+amplification+for+antibody-overlay+lectin+microarray:+a+strategy+to+improve+the+sensitivity+of+targeted+glycan+profiling.">Tyramide signal amplification for antibody-overlay lectin microarray: a strategy to improve the sensitivity of targeted glycan profiling.</a> Journal of Proteome Research. 10 (3), 1425-1431 (2011).</li><li>Surace, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+multiplex+immunofluorescence+panel+for+immuno-oncology+studies+on+formalin-fixed+carcinoma+tissue+specimens.">Automated multiplex immunofluorescence panel for immuno-oncology studies on formalin-fixed carcinoma tissue specimens.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), 58390 (2019).</li><li>Lazarus, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization,+design+and+avoiding+pitfalls+in+manual+multiplex+fluorescent+immunohistochemistry.">Optimization, design and avoiding pitfalls in manual multiplex fluorescent immunohistochemistry.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), 59915 (2019).</li><li>Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+immunohistochemistry,+imaging,+and+quantitation:+a+review,+with+an+assessment+of+Tyramide+signal+amplification,+multispectral+imaging+and+multiplex+analysis.">Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis.</a> Methods. 70 (1), 46-58 (2014).</li><li>Mansfield, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multispectral+imaging:+a+review+of+its+technical+aspects+and+applications+in+anatomic+pathology.">Multispectral imaging: a review of its technical aspects and applications in anatomic pathology.</a> Veterinary Pathology. 51 (1), 185-210 (2014).</li><li>Gustavson, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+unsupervised+pixel-based+clustering+algorithm+for+compartmentalization+of+immunohistochemical+expression+using+Automated+QUantitative+Analysis.">Development of an unsupervised pixel-based clustering algorithm for compartmentalization of immunohistochemical expression using Automated QUantitative Analysis.</a> Applied Immunohistochemistry &amp; Molecular Morphology. 17 (4), 329-337 (2009).</li><li>Lu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+biomarker+modalities+for+predicting+response+to+PD-1/PD-L1+checkpoint+blockade:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Comparison of biomarker modalities for predicting response to PD-1/PD-L1 checkpoint blockade: a systematic review and meta-analysis.</a> JAMA Oncology. 5 (8), 1195-1204 (2019).</li><li>Humphries, M. P., Maxwell, P., Salto-Tellez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=QuPath:+The+global+impact+of+an+open+source+digital+pathology+system.">QuPath: The global impact of an open source digital pathology system.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 19, 852-859 (2021).</li><li>Bankhead, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=QuPath:+Open+source+software+for+digital+pathology+image+analysis.">QuPath: Open source software for digital pathology image analysis.</a> Scientific Reports. 7 (1), 16878 (2017).</li><li>Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+immunohistochemistry,+imaging,+and+quantitation:+a+review,+with+an+assessment+of+Tyramide+signal+amplification,+multispectral+imaging+and+multiplex+analysis.">Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis.</a> Methods. 70 (1), 46-58 (2014).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4,+Experimental+Pathology+Techniques+of+Respiratory+System.">Chapter 4, Experimental Pathology Techniques of Respiratory System.</a> Atlas of Experimental Pathology Techniques. , 125-126 (2012).</li><li>Wilson, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+opportunities+in+the+statistical+analysis+of+multiplex+immunofluorescence+data.">Challenges and opportunities in the statistical analysis of multiplex immunofluorescence data.</a> Cancers. 13 (12), 3031 (2021).</li><li>Mori, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+tumor+immune+microenvironment+with+Tyramide-based+multiplex+immunofluorescence.">Characterizing the tumor immune microenvironment with Tyramide-based multiplex immunofluorescence.</a> Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 25 (4), 417-432 (2020).</li><li>Mansfield, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+context+in+epigenetics:+quantitative+multicolor+imaging+and+automated+per-cell+analysis+of+miRNAs+and+their+putative+targets.">Cellular context in epigenetics: quantitative multicolor imaging and automated per-cell analysis of miRNAs and their putative targets.</a> Methods. 52 (4), 271-280 (2010).</li></ol>

모든 저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

mIHC는 단일 조직 절편에서 단일 세포 수준에서 여러 단백질 마커의 정량적 및 공간적 분석을 위한 과학 연구 분야에서 없어서는 안될 실험 기법으로, 원래 조직의 맥락에서 상세한 조직 구조와 세포 상호 작용에 중점을 두어 질병 병리학 연구를 위한 직관적이고 정확한 데이터를 제공합니다. mIHC 기술이 널리 채택되려면 최적화되고 효과적인 실험 프로토콜이 필요합니다. 실험에서 발생할 수 있는...

20년 이상의 역사를 가진 티라민 신호 증폭(TSA)은 고추냉이 과산화효소(HRP)를 사용하여 표적 항원의 고밀도 in situ 라벨링에 사용되는 분석 기법의 일종으로, 효소 결합 면역 흡착 분석법(ELISA), 현장 혼성화(in situ hybridization, ISH), 면역조직화학(immunohistochemistry, IHC) 및 기타 생물학적 항원 검출 기술에 널리 적용되고 있습니다. 검출된 신호의 감도를 실질적으로 향상시키는단계 1. TSA 기술을 기반으로 한 오팔 다색 염색은 최근 개발되어 여러 연구에서 널리 사용되고있습니다 2,3,4,5. 기존의 면역형광(IF) 염색은 연구자들에게 다양한 모델 유기체의 세포 및 조직 내 단백질 분포를 검출하고 비교할 수 있는 쉬운 도구를 제공합니다. 항체/항원 특이적 결합을 기반으로 하며 직접 및 간접 접근법을 포함한다6. 직접 면역염색은 관심 항원에 대한 형광단 접합 1차 항체를 사용하는 것을 포함하며, 형광 현미경을 사용하여 직접 형광 검출을 가능하게 합니다. 간접 면역염색 접근법은 비접합 1차 항체 6,7에 형광단 접합 2차 항체를 적용하는 것을 포함합니다.
기존의 단일 표지 면역형광 염색법은 조직에서 1개, 2개 또는 경우에 따라 3개의 항원만 염색할 수 있으며, 이는 조직 절편에 포함된 풍부한 정보를 마이닝하는 데 있어 주요 한계입니다. 정량적 결과의 해석은 종종 ImageJ와 같은 이미징 소프트웨어를 통한 육안 관찰 및 정확한 정량화에 의존합니다. 항체 종 제한, 약한 형광 표지 신호, 형광 염료 색상 중첩 등의 기술적 한계가 있습니다(표 1). 오팔 멀티플렉스 IHC(mIHC) 기술은 TSA 유도를 기반으로 하며, 이는 1차 항체의 기원에 대한 제한 없이 동일한 조직 섹션에 7-9개 이상의 항원에 대한 다중 염색 및 차등 라벨링을 허용하지만 항원에 대한 해당 항체의 높은 특이성을 요구합니다. 염색 절차는 두 가지 차이점을 제외하고는 일반 면역형광 염색과 유사합니다: 각 염색 라운드에는 하나의 항체만 사용하고 항체 용출 단계가 추가됩니다. 비공유 결합에 의해 항원에 결합된 항체는 마이크로파 용출에 의해 제거될 수 있지만, 공유 결합에 의해 항원 표면에 결합된 TSA 형광 신호는 유지됩니다.
염료로 표지된 활성 티라민(T) 분자는 표적 항원에서 고도로 농축되어 형광 신호를 효율적으로 증폭할 수 있습니다. 이를 통해 항체 간섭 없이 항원을 직접 라벨링할 수 있으며, 여러 번의 염색 주기 8,9,10 후에 다색 라벨링을 달성할 수 있습니다(그림 1). 이 기술은 질병 연구를 위한 신뢰할 수 있고 정확한 이미지를 생성하지만, 광범위한 최적화 및 설계가 필요하기 때문에 유용한 다중 형광 면역조직화학(mfIHC) 염색 전략을 수립하는 데 시간이 많이 걸리고 까다로울 수 있습니다. 따라서 이 멀티플렉스 패널 프로토콜은 수동 프로토콜보다 염색 시간이 짧은 자동 IHC 염색기에 최적화되었습니다. 이 접근법은 인간 포르말린 고정 및 파라핀 포매(FFPE) 조직 샘플에 대한 면역 종양학 연구를 위해 모든 연구자가 직접 적용하고 적용할 수 있습니다11. 또한, 슬라이드 준비, 항체 최적화 및 멀티플렉스 설계 방법은 in situ 정확한 세포 상호작용을 나타내는 견고한 이미지를 획득하고 수동 분석을 위한 최적화 기간을 단축하는 데 도움이 될 것입니다12.
mfIHC는 주로 이미지 획득 및 데이터 분석을 포함합니다. 이미지 획득 측면에서, 다양한 혼합 색상 신호를 식별하고 조직 자가형광의 간섭 없이 높은 신호 대 노이즈 이미지를 얻기 위해 전문 스펙트럼 이미징 장비로 다색 표지된 복합 염색 샘플을 검출해야 합니다. 현재 스펙트럼 이미징을 위한 장비에는 주로 스펙트럼 컨포칼 현미경과 다중 스펙트럼 조직 이미징 시스템이 포함됩니다. 다중 스펙트럼 조직 이미징 시스템은 조직 절편의 정량적 분석을 위해 설계된 전문 이미징 시스템이며, 가장 중요한 특징은 생체 조직 샘플의 형태학적 구조와 광학 매핑 정보를 모두 제공하는 이미지 스펙트럼 정보의 획득입니다(13,14). 스펙트럼 이미지의 모든 픽셀은 완전한 스펙트럼 곡선을 포함하며, 각 염료(자가형광 포함)에는 해당 특성 스펙트럼이 있어 혼합 및 중첩 다중 레이블 신호를 완벽하게 기록하고 정확하게 식별할 수 있습니다.
데이터 분석 측면에서 다색 표지 샘플은 조직 샘플의 형태학적 구조와 구성 세포로 인해 매우 복잡합니다. 일반 소프트웨어는 다른 조직 유형을 자동으로 식별할 수 없습니다. 따라서, 지능형 정량적 조직 분석 소프트웨어는 특정 영역(15,16,17,18)에서의 항원 발현의 정량적 분석을 위해 사용된다.
무엇보다도, 다중스펙트럼 이미징 및 정량적 병리학 분석 기술과 융합된 다중표지 면역형광 염색은 많은 수의 검출 표적, 효과적인 염색 및 정확한 분석의 장점이 있으며, 따라서 조직형태학적 분석의 정확도를 크게 향상시킬 수 있고, 세포 수준의 분해능으로 단백질 간의 공간적 관계를 밝힐 수 있으며, 조직 절편 샘플로부터 보다 풍부하고 신뢰할 수 있는 정보를 마이닝하는 데 도움이 될 수 있다19 (표 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD8</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab237709</td>
			<td>Primary antibody, 1/100, PH9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD68</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab955</td>
			<td>Primary antibody, 1/300, PH9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CK5/6</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB1620</td>
			<td>Primary antibody, 1/150, PH9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HMGCS1</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX112346</td>
			<td>Primary antibody, 1/300, PH6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal nonimmune serum</td>
			<td>MXB Biotechnologies</td>
			<td>SP KIT-B3</td>
			<td>Antigen blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluormount-G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>Anti-fluorescent burst</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal PolarisTM 7-Color Manual IHC Kit</td>
			<td>Akoya</td>
			<td>NEL861001KT</td>
			<td>Opal mIHC Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Buffer</td>
			<td>Dako</td>
			<td>K8000/K8002/K8007/K8023</td>
			<td>Washing the tissues slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HALO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>intelligent quantitative tissue analysis software, paid software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inForm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>intelligent quantitative tissue analysis software, paid software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerkinElmer Vectra</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>multispectral tissue imaging systems, fully automatic scanning of tissue slides.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuPath 0.3.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>intelligent quantitative tissue analysis software, open source software, used in this experiment.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplex immunohistochemistry staining for paraffin-embedded lung cancer tissue

폐암은 전 세계적으로 악성 종양 관련 이환율 및 사망률의 주요 원인이며, 복잡한 종양 미세환경은 폐암 환자의 주요 사망 원인으로 여겨져 왔습니다. 종양 미세환경의 복잡성으로 인해 종양 조직의 세포 간 관계를 이해하기 위한 효과적인 방법이 필요합니다. 다중 면역조직화학(mIHC) 기술은 종양 조직에서 신호 전달 경로의 업스트림과 다운스트림 단백질 발현 간의 관계를 추론하고 임상 진단 및 치료 계획을 개발하기 위한 핵심 도구가 되었습니다. mIHC는 티라민 신호 증폭(TSA) 기술을 기반으로 하는 다중 표지 면역형광 염색 방법으로, 동일한 조직 절편 샘플에서 여러 표적 분자를 동시에 검출하여 서로 다른 단백질 동시 발현 및 공동 국소화 분석을 달성할 수 있습니다. 이 실험 프로토콜에서는 임상적 기원의 폐 편평 암종의 파라핀 포매 조직 절편을 다중 면역조직화학적 염색을 실시했습니다. 실험 프로토콜을 최적화함으로써 표지된 표적 세포 및 단백질의 다중 면역조직화학적 염색을 달성하여 폐 조직의 자가형광 및 채널 누화 문제를 해결했습니다. 또한 다중 면역조직화학 염색은 단일 세포 염기서열 분석, 단백질체학 및 조직 공간 염기서열 분석을 포함한 종양 관련 고처리량 염기서열 분석의 실험적 검증에 널리 사용되어 직관적이고 시각적인 병리학 검증 결과를 제공합니다.

Tyramine signal amplification (TSA), which has a history of more than 20 years, is a class of assay techniques that use horseradish peroxidase (HRP) for high-density in situ labeling of target antigens and is widely applied in enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs), in situ hybridization (ISH), immunohistochemistry (IHC), and other techniques for the detection of biological antigens, substantially improving the sensitivity of the detected signal1. Opal polychromatic staining based on TSA technology has been recently developed and widely used in several studies2,3,4,5. Traditional immunofluorescence (IF) staining provides researchers with an easy tool for the detection and comparison of the distribution of proteins in the cells and tissues of various model organisms. It is based on antibody-/antigen-specific binding and includes direct and indirect approaches6. Direct immunostaining involves the use of a fluorophore-conjugated primary antibody against the antigen of interest, which enables direct fluorescent detection using a fluorescence microscope. The indirect immunostaining approach involves the application of a fluorophore-conjugated secondary antibody against the unconjugated primary antibody6,7.
Traditional, single-label, immunofluorescence staining methods can stain only one, two, or in some cases, three antigens in tissues, which is a major limitation in mining the rich information contained in tissue sections. The interpretation of quantitative results often depends on visual observation and accurate quantification by imaging software, such as ImageJ. There are technical limitations, such as antibody species restriction, weak fluorescent label signals, and fluorescent dye color overlap (Table 1). The Opal multiplex IHC (mIHC) technique is based on TSA derivation, which allows multiplex staining and differential labeling of more than 7-9 antigens on the same tissue section, with no restriction on the origin of the primary antibody, but requires high specificity of the corresponding antibody against the antigen. The staining procedure is similar to that of normal immunofluorescence staining, except for two differences: each round of staining involves the use of only one antibody and an antibody elution step is added. Antibodies bound to the antigen by noncovalent bonds can be removed by microwave elution, but the TSA fluorescent signal bound to the surface of the antigen by covalent bonds is retained.
Activated tyramine (T) molecules labeled with the dye are highly enriched at the target antigen, allowing efficient amplification of the fluorescent signal. This allows direct labeling of the antigen without antibody interference, and then multicolor labeling can be achieved after multiple staining cycles8,9,10 (Figure 1). Although this technology produces reliable and accurate images for the study of disease, the creation of a useful multiplex fluorescent immunohistochemistry (mfIHC) staining strategy can be time-consuming and exacting due to the need for extensive optimization and design. Therefore, this multiplex panel protocol has been optimized in an automated IHC stainer with a shorter staining time than that of the manual protocol. This approach can be directly applied and adapted by any researcher for immuno-oncology studies on human formalin-fixed and paraffin-embedded (FFPE) tissue samples11. Moreover, the methods for slide preparation, antibody optimization, and multiplex design will be helpful in obtaining robust images that represent accurate cellular interactions in situ and to shorten the optimization period for manual analysis12.
The mfIHC mainly includes image acquisition and data analysis. In terms of image acquisition, multicolor-labeled complex-stained samples need to be detected with professional spectral imaging equipment to identify the various mixed color signals and obtain high signal-to-noise images without interference from tissue autofluorescence. Current equipment for spectral imaging mainly includes spectral confocal microscopes and multispectral tissue imaging systems. The multispectral tissue imaging system is a professional imaging system designed for the quantitative analysis of tissue sections, and its most important feature is the acquisition of image spectral information, which provides both morphological structure and optical mapping information of biological tissue samples13,14. Any pixel in the spectral image contains a complete spectral curve, and each dye (including autofluorescence) has its corresponding characteristic spectrum, which enables the complete recording and accurate identification of mixed and overlapping multilabel signals.
In terms of data analysis, multicolor-labeled samples are extremely complex due to the morphological structure and constituent cells of the tissue samples. Ordinary software cannot automatically identify different tissue types. Hence, intelligent quantitative tissue analysis software is used for quantitative analysis of antigen expression in specific regions15,16,17,18.
Above all, multilabel immunofluorescence staining fused with multispectral imaging and quantitative pathology analysis technology has the advantages of a large number of detection targets, effective staining, and accurate analysis, and it can therefore significantly improve the accuracy of histomorphological analysis, reveal the spatial relationship between proteins with cellular-level resolution, and help to mine richer and more reliable information from tissue section samples19 (Table 1).

저자 스포트라이트: Enhancing Multicolor Fluorescence Localization in Lung Carcinoma Sample (폐암종 샘플에서 다색 형광 국소화 향상)

파라핀 포매된 폐암 조직을 위한 다중 면역조직화학 염색

Our research focused on optimizing the mIHC protocol on paraffin section obtained from clinic sources. We aimed to effectively address autofluorescence and autofluorescence channel crosstalk issues in lung tissue. The current experimental challenges we are facing involve addressing the issues of autofluorescence and channel crosstalk in lung tissue, whereby achieving successful multicolor fluorescence localization they need for labeled target cells and proteins.Our highly efficient multiple antigen in situ labeling method, which requires less than three hours per antibody, seamlessly integrates a multispectral imaging system and a specialized pathology software. This optimized mIHC protocol is easily adaptable for use in other research laboratories.

CD8 1차 항체와 형광단의 매칭 체계를 최적화했습니다. 두 세트의 형광 결과는 항체 일치 형광단의 변화를 제외하고는 실험 그룹에서 정확히 동일한 항체 배양 조건에 해당했습니다. 그림 2에서 볼 수 있듯이 CD8+ T 세포와 형광단 480 및 형광단 690의 채널 일치에는 상당한 차이가 있었습니다. 형광단 690이 있는 채널은 매우 강한 형광 배경을 보여주며, 노란색 원 안에 있는 넓은 ...

Watch this Scientific Journal Video about Multiplex Immunohistochemistry Staining for Paraffin-embedded Lung Cancer Tissue at JoVE.com

이 실험 프로토콜은 주로 단일 채널 항체 배양 조건을 최적화하고 항체 및 채널의 설정을 조정하여 임상 기원 폐암 조직의 자가형광 및 채널 누화 문제를 해결함으로써 다중 면역조직화학(IHC) 염색 방법을 설명하고 최적화합니다.

Lung cancer is the leading cause of malignant tumor-related morbidity and mortality all over the world, and the complex tumor microenvironment has been ...

우리의 연구는 클리닉 출처에서 얻은 파라핀 섹션에 대한 mIHC 프로토콜을 최적화하는 데 중점을 두었습니다. 우리는 폐 조직의 자가형광 및 자가형광 채널 누화 문제를 효과적으로 해결하는 것을 목표로 했습니다. 현재 우리가 직면하고 있는 실험적 과제는 폐 조직의 자가형광 및 채널 누화 문제를 해결하는 것이며, 이를 통해 표지된 표적 세포 및 단백질에 필요한 성공적인 다색 형광 국소화를 달성하는 것입니다.항체당 3시간 미만이 소요되는 당사의 고효율 다중 항원 in situ 라벨링 방법은 다중 스펙트럼 이미징 시스템과 특수 병리학 소프트웨어를 완벽하게 통합합니다. 이 최적화된 mIHC 프로토콜은 다른 연구 실험실에서 쉽게 사용할 수 있습니다.

multiplex-immunohistochemistry-staining-for-paraffin-embedded-lung

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Multiplex Immunohistochemistry Staining for Paraffin-embedded Lung Cancer Tissue

1.2K 조회수.  Sichuan University. 우리의 연구는 클리닉 출처에서 얻은 파라핀 섹션에 대한 mIHC 프로토콜을 최적화하는 데 중점을 두었습니다. 우리는 폐 조직의 자가형광 및 자가형광 채널 누화 문제를 효과적으로 해결하는 것을 목표로 했습니다. 현재 우리가 직면하고 있는 실험적 과제는 폐 조직의 자가형광 및 채널 누화 문제를 해결하는 것이며, 이를 통해 표지된 표적 세포 및 단백질에 필요한 성공적인 ...