تم دعم هذا العمل من قبل NEI R21EY033941 (إلى Hongli Wu) ؛ وزارة الدفاع W81XWH2010896 (إلى هونغلي وو) ؛ R15GM123463-02 (من كايلا جرين وهونجلي وو)

تم إجراء جميع التجارب على وفقا لإرشادات جمعية أبحاث الرؤية وطب العيون لاستخدام في أبحاث العيون والرؤية. تم منح الموافقة الإجرائية من قبل لجنة رعاية واستخدام بمركز العلوم الصحية بجامعة شمال تكساس (رقم البروتوكول: IACUC-2022-0008). تم استخدام الفئران الصغيرة C57BL / 6J ، عادة أقل من 2 أسابيع من العمر ، في هذه الدراسات.
1. إعداد وسط الثقافة وتشريح العدسة
<ol><li>تحضير وسط الاستزراع بإضافة 50 مل من مصل بقري الجنين (FBS) و 0.1 مل من 50 مجم / مل جنتاميسين إلى 450 مل من DMEM.</li>
	<li>القتل الرحيم إنسانيا C57BL / 6J الفئران الأصغر من 2 أسابيع. ملاحظة: قمنا بالقتل الرحيم باستخدام طريقة استنشاق CO2 . يجب أن يحل معدل التدفق الأمثل لأنظمة القتل الرحيم CO2 محل 30٪ إلى 70٪ من حجم الغرفة أو القفص / دقيقة.</li>
	<li>قم بإزالة الجفون برفق باستخدام المقص الجراحي واضغط برفق باستخدام ملاقط منحنية على جوانب متقابلة من محجر العين ، مما يتسبب في بروز العين للخارج. قم بعمل شق دقيق على القرنية باستخدام سكين إعتام عدسة العين واستخرج العدسة بعناية باستخدام ملاقط منحنية ، مما يضمن عدم حدوث أي ضرر للعدسة أو كبسولة. ملاحظة: توخ الحذر أثناء تنفيذ هذه الخطوات للحفاظ على سلامة كبسولة العدسة. نظرا للطبيعة الحساسة للعدسة ، من المهم استخدام أدوات التشريح ذات النصائح المنحنية وغير الحادة لتقليل مخاطر تلف العدسة.</li>
	<li>استخدم ملاقط منحنية ذات أطراف حادة لنقل العدسات إلى طبق زراعة مناديل بلاستيكية مقاس 60 مم مملوء ب 5 مل من محلول المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (DPBS) من Dulbecco المسخن مسبقا والمعقم الذي يحتوي على 10 ميكروغرام / مل جنتاميسين.</li>
	<li>اشطف العدسات برفق بمحلول DPBS يحتوي على 10 ميكروغرام / مل جنتاميسين لإزالة أي حطام أو ملوثات محتملة ، وإعداد العدسات لمزيد من المعالجة ، والحفاظ على بيئة مزرعة معقمة.</li>
	<li>للحصول على عدد كاف من LECs ، قم بتجميع أربع عدسات للوحة استزراع 24 بئرا وست عدسات للوحة استزراع 6 آبار.</li>
</ol>2. عزل LECs
<ol><li>بعد الانتهاء من عملية الشطف ، ضع العدسة على قطعة من ورق الترشيح ، واتركها تجف.</li>
	<li>بمجرد أن تجف العدسة بشكل كاف ، انقلها بعناية إلى غطاء طبق بتري استعدادا لإزالة كبسولة العدسة.</li>
	<li>قم بتدوير العدسة لأعلى ، مع التأكد من أن الجزء الأمامي متجها لأعلى. أثناء استخدام الملقط لتثبيت الكبسولة الأمامية ، استخدم ملقط المحفظة في اليد المهيمنة لإحداث تمزق صغير في الكبسولة. اسحب الأداتين برفق في اتجاهين متعاكسين لإزالة الكبسولة ووضعها في DPBS حتى تكتمل جميع عمليات تشريح العدسة. ملاحظة: لتجنب أي تناقضات ، يجب على الباحثين تشريح كل كبسولة ظهارية للعدسة على الفور وتخزينها مؤقتا في DPBS. فقط بعد الانتهاء من جميع عمليات التشريح يتم نقل الكبسولات بشكل جماعي إلى التربسين عند 37 درجة مئوية ، مما يضمن التعرض المتزامن والموحد.</li>
	<li>انقل كبسولة العدسة بعناية إلى لوحة ذات 6 آبار. أضف 1 مل من محلول التربسين 0.05٪ إلى كل بئر لبدء عملية الهضم الأنزيمي.</li>
	<li>حرك محلول التربسين برفق لضمان تغلغل متساو. ضع الطبق في حاضنة زراعة الخلايا واترك الكبسولة تهضم لمدة 8-10 دقائق عند 37 درجة مئوية. ملاحظة: تسهل هذه الخطوة تكسير أنسجة كبسولة العدسة والإفراج اللاحق للخلايا الظهارية الفردية.</li>
	<li>بعد الحضانة ، قم بفرم كبسولة العدسة المهضومة بعناية باستخدام مقص تشريح لتكسير أي كتل أنسجة متبقية وتعزيز فصل الخلايا. ملاحظة: يتم التأكيد على الدقة في فرم الأنسجة لضمان إطلاق الخلايا بكفاءة من كبسولات العدسة المهضومة.</li>
	<li>أضف 0.5 مل من وسط الاستزراع الذي يحتوي على 10٪ FBS لإخماد التربسين. نقل عينات الأنسجة إلى أنبوب الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي في 1000 × غرام لمدة 5 دقائق.</li>
	<li>قم بإزالة المادة الطافية بعناية دون إزعاج حبيبات الخلية. استخدم 1 مل من وسط الاستزراع لإعادة تعليق الخلايا وزرع الخلايا في طبق 24 بئرا.</li>
	<li>قم بتغيير وسط الثقافة كل 2-3 أيام.</li>
</ol>3. الثقافة الفرعية LECs
<ol><li>بمجرد أن تحقق الخلايا التقاء ، قم بإزالة الوسط من طبق الاستزراع. المضي قدما في غسل الخلايا 2x مع 1 مل من DPBS.</li>
	<li>أضف 200 ميكرولتر من محلول التربسين-EDTA وضع الخلايا في الحاضنة لمدة 5 دقائق.</li>
	<li>بعد الحضانة ، قم بإزالة الخلايا من الحاضنة وفحصها تحت المجهر للتأكد من أنها انفصلت عن طبق الثقافة وبدأت في الطفو.</li>
	<li>أضف 1 مل من وسط الاستزراع وماصة الخلايا برفق 3-5x لفصل جميع الخلايا.</li>
	<li>نقل الخلايا إلى أنابيب الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي على حرارة 1000 × غرام لمدة 5 دقائق.</li>
	<li>قم بإزالة المادة الطافية بعناية وأعد تعليق الخلايا في وسط النمو الكامل.</li>
	<li>إذا لزم الأمر ، احسب رقم الخلية باستخدام مقياس الدم.</li>
	<li>قسم تعليق الخلية بنسبة 1: 2 أو 1: 3 لأغراض الاستزراع الفرعي.</li>
	<li>عندما تصبح الثقافة متقاربة مرة أخرى ، كرر الإجراءات المذكورة أعلاه. ملاحظة: تزدهر LECs في ظروف الاستزراع عالية الكثافة. تجنب تمييع الخلايا بشكل مفرط ، لأن هذا قد يعيق نموها.</li>
</ol>4. التخزين والشحن
ملاحظة: رقم الخلية المثالي للتخزين هو ~ 1 × 106.
<ol><li>اغسل الخلايا جيدا 3x مع 1 مل من DPBS. بعد الغسيل ، أضف 1 مل من محلول التربسين-EDTA وضع الخلايا في الحاضنة لمدة 5 دقائق.</li>
	<li>أضف 2 مل من وسط الاستزراع الكامل وانقل تعليق الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي عند 1000 × جم لمدة 5 دقائق.</li>
	<li>تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في وسط تجميد يتكون من 90٪ FBS و 10٪ DMSO ، بهدف كثافة خلية تبلغ 1 × 106 خلايا / مل. نقل تعليق الخلية إلى cryovial.</li>
	<li>انقل الخلايا على الفور إلى بيئة -20 درجة مئوية لمدة 1 ساعة ، تليها -80 درجة مئوية طوال الليل ، قبل التخزين الدائم في النيتروجين السائل. ملاحظة: في حالة عدم توفر النيتروجين السائل ، يمكن تخزين الخلايا عند -80 درجة مئوية بعد ساعة أولية عند -20 درجة مئوية.</li>
	<li>إذا كانت الشحنة مطلوبة ، فقم بشحن الخلايا الموجودة في cryovial في عبوة بها ثلج جاف للتسليم بين عشية وضحاها.</li>
	<li>عند استلام الخلايا ، تأكد من الشفاء السريع ووضع الخلايا في الثقافة الفرعية. إذا لم تكن الثقافة الفورية ممكنة ، فقم بنقل الخلايا إلى النيتروجين السائل للتخزين لفترة طويلة. ملاحظة: إذا كان سيتم شحن الخلايا ، فتأكد من دفن العينات بعمق في الثلج الجاف لمنع التلف المحتمل من تقلبات درجات الحرارة.</li>
</ol>5. التحقق من صحة LECs
<ol><li>ضع LECs في أطباق استزراع مقاس 35 مم مع أكواب غطاء واستزراعها لمدة 48 ساعة تقريبا.</li>
	<li>اغسل الخلايا 2x باستخدام برنامج تلفزيوني وقم بتثبيت الخلايا بالميثانول البارد لمدة 10 دقائق عند -20 درجة مئوية.</li>
	<li>اغسل الخلايا الثابتة لمدة 3 × 5 دقائق باستخدام برنامج تلفزيوني واحتضان الخلايا الثابتة بمخزن مؤقت مانع لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة لمنع الارتباط غير المحدد.</li>
	<li>بعد الانسداد ، احتضان الخلايا طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع الأجسام المضادة الأولية (αA-crystallin و γ-crystallin و PROX1) المخففة بشكل فردي بنسبة 1:50 في المخزن المؤقت المخفف.</li>
	<li>اغسل الخلايا لمدة 3 × 5 دقائق باستخدام برنامج تلفزيوني واحتضان الخلايا بالجسم المضاد الثانوي المخفف 1: 100 في محلول مخفف لمدة ساعة واحدة.</li>
	<li>اغسل الخلايا لمدة 3 × 5 دقائق باستخدام برنامج تلفزيوني وقم بتلطيخ الخلايا ب 5 ميكروغرام / مل Hoechst 33342 في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة لتصور النوى.</li>
	<li>اغسل الخلايا لمدة 2 × 5 دقائق باستخدام PBS لإزالة محلول التلوين الزائد والتقاط صور الفلورسنت للخلايا باستخدام مجهر مضان باستخدام قناة DAPI للنوى وقناة FITC ل αA- و γ-crystallins و PROX1.</li>
</ol>

زراعة وتوصيف الخلايا الظهارية للعدسة

<ol>
	<li>Bermbach, G., Mayer, U., Naumann, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+lens+epithelial+cells+in+tissue+culture.">Human lens epithelial cells in tissue culture.</a> Experimental Eye Research. 52 (2), 113-119 (1991).</li><li>Reddy, V. N., Lin, L. R., Arita, T., Zigler, J. S., Huang, Q. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallins+and+their+synthesis+in+human+lens+epithelial+cells+in+tissue+culture.">Crystallins and their synthesis in human lens epithelial cells in tissue culture.</a> Experimental Eye Research. 47 (3), 465-478 (1988).</li><li>Lee, C. M., Afshari, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+state+of+cataract+blindness.">The global state of cataract blindness.</a> Current Opinion in Ophthalmology. 28 (1), 98-103 (2017).</li><li>Khairallah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Number+of+people+blind+or+visually+impaired+by+cataract+worldwide+and+in+world+regions,+1990+to+2010.">Number of people blind or visually impaired by cataract worldwide and in world regions, 1990 to 2010.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 56 (11), 6762-6769 (2015).</li><li>Beebe, D. C., Holekamp, N. M., Shui, Y. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+damage+and+the+prevention+of+age-related+cataracts.">Oxidative damage and the prevention of age-related cataracts.</a> Ophthalmic Research. 44 (3), 155-165 (2010).</li><li>Lou, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+regulation+in+the+lens.">Redox regulation in the lens.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 22 (5), 657-682 (2003).</li><li>Charakidas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lens+epithelial+apoptosis+and+cell+proliferation+in+human+age-related+cortical+cataract.">Lens epithelial apoptosis and cell proliferation in human age-related cortical cataract.</a> European Journal of Ophthalmology. 15 (2), 213-220 (2005).</li><li>Lou, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+and+glutaredoxin+in+redox+regulation+and+cell+signaling+of+the+lens.">Glutathione and glutaredoxin in redox regulation and cell signaling of the lens.</a> Antioxidants (Basel). 11 (10), 1973 (2022).</li><li>Wilhelm, J., Smistik, Z., Mahelkova, G., Vytasek, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+regulation+of+proliferation+of+lens+epithelial+cells+in+culture.">Redox regulation of proliferation of lens epithelial cells in culture.</a> Cell Biochemistry &amp; Function. 25 (3), 317-321 (2007).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+progress+concerning+a+novel+intraocular+lens+for+the+prevention+of+posterior+capsular+opacification.">Research progress concerning a novel intraocular lens for the prevention of posterior capsular opacification.</a> Pharmaceutics. 14 (7), 1343 (2022).</li><li>Konopinska, J., Mlynarczyk, M., Dmuchowska, D. A., Obuchowska, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posterior+capsule+opacification:+A+review+of+experimental+studies.">Posterior capsule opacification: A review of experimental studies.</a> Journal of Clinical Medicine. 10 (13), 2847 (2021).</li><li>Pandey, S. K., Apple, D. J., Werner, L., Maloof, A. J., Milverton, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posterior+capsule+opacification:+A+review+of+the+aetiopathogenesis,+experimental+and+clinical+studies+and+factors+for+prevention.">Posterior capsule opacification: A review of the aetiopathogenesis, experimental and clinical studies and factors for prevention.</a> Indian Journal of Ophthalmology. 52 (2), 99-112 (2004).</li><li>Wei, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aged+lens+epithelial+cells+suppress+proliferation+and+epithelial-mesenchymal+transition-relevance+for+posterior+capsule+opacification.">Aged lens epithelial cells suppress proliferation and epithelial-mesenchymal transition-relevance for posterior capsule opacification.</a> Cells. 11 (13), 2001 (2022).</li><li>Creighton, M. O., Mousa, G. Y., Miller, G. G., Blair, D. G., Trevithick, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+rat+lens+epithelial+cells+in+tissue+culture--iv.+Some+characteristics+of+the+process,+including+possible+in+vitro+models+for+pathogenic+processes+in+cataractogenesis.">Differentiation of rat lens epithelial cells in tissue culture--iv. Some characteristics of the process, including possible in vitro models for pathogenic processes in cataractogenesis.</a> Vision Research. 21 (1), 25-35 (1981).</li><li>Creighton, M. O., Mousa, G. Y., Trevithick, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+rat+lens+epithelial+cells+in+tissue+culture.+(i)+effects+of+cell+density,+medium+and+embryonic+age+of+initial+culture.">Differentiation of rat lens epithelial cells in tissue culture. (i) effects of cell density, medium and embryonic age of initial culture.</a> Differentiation. 6 (3), 155-167 (1976).</li><li>Ibaraki, N., Ohara, K., Shimizu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explant+culture+of+human+lens+epithelial+cells+from+senile+cataract+patients.">Explant culture of human lens epithelial cells from senile cataract patients.</a> Japanese Journal of Ophthalmology. 37 (3), 310-317 (1993).</li><li>Sundelin, K., Petersen, A., Soltanpour, Y., Zetterberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+growth+of+lens+epithelial+cells+from+cataract+patients+-+association+with+possible+risk+factors+for+posterior+capsule+opacification.">In vitro growth of lens epithelial cells from cataract patients - association with possible risk factors for posterior capsule opacification.</a> The Open Ophthalmology Journal. 8, 19-23 (2014).</li><li>Parreno, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodologies+to+unlock+the+molecular+expression+and+cellular+structure+of+ocular+lens+epithelial+cells.">Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 983178 (2022).</li><li>Andjelic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+proliferative+studies+on+ex+vivo+cultured+human+anterior+lens+epithelial+cells+-+relevance+to+capsular+opacification.">Morphological and proliferative studies on ex vivo cultured human anterior lens epithelial cells - relevance to capsular opacification.</a> Acta Ophthalmologica. 93 (6), e499-e506 (2015).</li><li>Andjelic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+establishing+adherent+ex+vivo+explant+cultures+from+human+eye+pathologies+for+use+in+subsequent+calcium+imaging+and+inflammatory+studies.">A simple method for establishing adherent ex vivo explant cultures from human eye pathologies for use in subsequent calcium imaging and inflammatory studies.</a> Journal of Immunology Research. 2014, 232659 (2014).</li><li>Andley, U. P., Rhim, J. S., Chylack, L. T., Fleming, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+and+immortalization+of+human+lens+epithelial+cells+in+culture.">Propagation and immortalization of human lens epithelial cells in culture.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 35 (7), 3094-3102 (1994).</li><li>Zhou, M., Leiberman, J., Xu, J., Lavker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hierarchy+of+proliferative+cells+exists+in+mouse+lens+epithelium:+Implications+for+lens+maintenance.">A hierarchy of proliferative cells exists in mouse lens epithelium: Implications for lens maintenance.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 47 (7), 2997-3003 (2006).</li><li>Wolffe, A. P., Glover, J. F., Tata, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+shock.+Synthesis+of+heat-shock-like+proteins+in+fresh+primary+cell+cultures.">Culture shock. Synthesis of heat-shock-like proteins in fresh primary cell cultures.</a> Experimental Cell Research. 154 (2), 581-590 (1984).</li><li>Haykin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioimage+analysis+of+cell+physiology+of+primary+lens+epithelial+cells+from+diabetic+and+non-diabetic+cataract+patients.">Bioimage analysis of cell physiology of primary lens epithelial cells from diabetic and non-diabetic cataract patients.</a> Biotechnology &amp; Biotechnological Equipment. 35 (1), 170-178 (2021).</li><li>Menko, A. S., Klukas, K. A., Johnson, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chicken+embryo+lens+cultures+mimic+differentiation+in+the+lens.">Chicken embryo lens cultures mimic differentiation in the lens.</a> Developmental Biology. 103 (1), 129-141 (1984).</li><li>Zelenka, P. S., Gao, C. Y., Saravanamuthu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+culture+of+rat+lens+epithelial+explants+for+studying+terminal+differentiation.">Preparation and culture of rat lens epithelial explants for studying terminal differentiation.</a> Journal of Visualized Experiments. (31), 1591 (2009).</li></ol>

يعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.

يوفر البروتوكول المقدم في هذه الورقة دليلا شاملا خطوة بخطوة للعزلة الناجحة والثقافة والثقافة الفرعية للمجتمعات المحلية الأولية ، مع استكمال وثائق الفيديو المصاحبة. يعزز الدليل المرئي المفصل إلى جانب التعليمات المكتوبة وضوح البروتوكول وإمكانية الوصول إليه ، مما يعزز استخدامه وإمكانية ?...

تلعب عدسة العين دورا حاسما في الرؤية من خلال تركيز الضوء الوارد على شبكية العين. وهو يتألف من بنية شفافة غير وعائية تتكون من خلايا متخصصة ، من بينها الخلايا الظهارية للعدسة (LECs) هي اللاعبين الرئيسيين. تقع LECs على السطح الأمامي للعدسة وهي مسؤولة عن الحفاظ على شفافيتها وتنظيم توازن الماء والمشاركة في نمو العدسةوتطورها 1,2. LECs هي نوع فريد من الخلايا الموجودة في الجزء الأمامي من العدسة ، وتلعب دورا مهما في الحفاظ على وضوح العدسة ووظيفتها من خلال إنتاج ألياف العدسة باستمرار طوال الحياة.
يتميز إعتام عدسة العين بالتعتيم التدريجي للعدسة ، مما يؤدي إلى تشويه الضوء وتشتته ، مما يؤدي إلى ضعف الرؤية 3,4. الآليات الدقيقة الكامنة وراء تكوين إعتام عدسة العين معقدة ومتعددة العوامل ، وتشمل عمليات خلوية وجزيئية مختلفة مثل الأشعة فوق البنفسجية ، والضرر التأكسدي ، والجلوكوز 5,6. تم العثور على LECs لتساهم بشكل كبير في تطوير إعتام عدسة العين ، مما يجعلها محورا حيويا للبحث1،2،7،8،9.
علاوة على ذلك ، فإن إحدى القضايا الأكثر إلحاحا في طب العيون اليوم هي الارتفاع النسبي في معدل عتامة الكبسولة الخلفية (PCO) ، المعروف أيضا باسم إعتام عدسة العين الثانوي. يظل PCO أكثر المضاعفات شيوعا بعد جراحة إعتام عدسة العين ، حيث يؤثر على ما يصل إلى 20-40٪ من المرضى البالغين و 100٪ من الأطفال في غضون 5 سنوات بعد الجراحة10. يحدث PCO بشكل أساسي بسبب LECs المتبقية التي تبقى في كيس المحفظة بعد استخراج إعتام عدسة العين. تخضع هذه الخلايا لتحول فيزيولوجي مرضي متعدد الأوجه لا يشمل فقط الانتقال الظهاري إلى اللحمة المتوسطة (EMT) ولكن أيضا تمايز LECs إلى ألياف العدسة ، مما يؤدي إلى عدد الخلايا الذي يتكون من مزيج من LECs والألياف والخلايا الليفية العضلية11،12،13. تتكاثر الخلايا المحولة وتهاجر عبر كبسولة العدسة الخلفية ، مما يؤدي إلى ضعف البصر. يمكن أن يوفر فهم السلوك وآليات التحكم في LECs في نماذج الاستزراع رؤى قيمة حول الوقاية من PCO وإدارته. لذلك ، يقدم هذا البروتوكول لزراعة LECs أداة حيوية لباحثي طب العيون الذين يهدفون إلى دراسة وفهم ومكافحة هذه المضاعفات السائدة بعد العملية الجراحية في نهاية المطاف.
لكشف تعقيدات بيولوجيا LEC ودورها في تكوين إعتام عدسة العين و PCO ، من الضروري إنشاء أنظمة زراعة خلايا أولية قوية وقابلة للتكرار في المختبر . توفر ثقافة LEC الأولية للباحثين بيئة خاضعة للرقابة لدراسة الوظائف والإشارات والخصائص الجزيئية ل LECs. علاوة على ذلك ، فإنه يسمح بالتحقيق في العمليات الخلوية وتأثيرات الظروف التجريبية المختلفة ، مما يوفر رؤى قيمة في فسيولوجيا العدسة وعلم الأمراض.
لقد أثرت الأبحاث السابقة فهمنا لتقنيات زراعة LEC14،15،16،17،18،19،20. على الرغم من أن هذه الدراسات قد استخدمت منهجيات مختلفة وأسفرت عن نتائج مهمة حول سلوك وخصائص LEC ، إلا أن بروتوكول تسجيل الفيديو الشامل والمتاح لزراعة LECs غائب في الأدبيات الحالية. يمكن أن يعيق هذا القيد قدرة الباحثين المبتدئين على إعادة إنتاج التقنيات بدقة ويمكن أن يؤدي إلى تناقضات واختلافات في النتائج التجريبية. من خلال توفير بروتوكول تسجيل الفيديو ، تهدف هذه الورقة البحثية إلى سد هذه الفجوة وتوفير مورد موحد يمكن أن يعزز قابلية التكاثر ويسهل نقل المعرفة في مجال ثقافة LEC.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#25300054</td>
			<td>For LECs dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Secondary Antibody&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>#715-545-150</td>
			<td>For cell validation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-605-003</td>
			<td>For cell validation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody dilution buffer</td>
			<td>Licor</td>
			<td>#927-60001</td>
			<td>For cell validation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaver safety knife</td>
			<td>Beaver-Visitec International</td>
			<td>#3782235</td>
			<td>For lens dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking buffer</td>
			<td>Licor</td>
			<td>#927-60001</td>
			<td>For cell validation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capsulorhexis forceps</td>
			<td>Titan Medical Instruments</td>
			<td>TMF-124</td>
			<td>For lens capsule isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6429</td>
			<td>For LECs culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>#D2650</td>
			<td>For making freezing medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#J67802</td>
			<td>For lens dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont tweezers</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-4976</td>
			<td>For lens capsule isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EpiCGS-a (optional)</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>4182</td>
			<td>For LECs culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td>For LECs culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin (50&#160;mg/mL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1397</td>
			<td>For LECs culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342 solution</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#62249</td>
			<td>For cell validation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-dissecting scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument&#160;</td>
			<td>RS-5983</td>
			<td>For lens dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-dissecting tweezers</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument&#160;</td>
			<td>RS5137&#160;</td>
			<td>For lens dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PROX1 antibody</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11067-2-AP</td>
			<td>For cell validation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas micro-dissecting spring scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-5608</td>
			<td>For lens capsule isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;A-crystallin antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-28306</td>
			<td>For cell validation&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;-crystallin antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-365256</td>
			<td>For cell validation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimizing mouse primary lens epithelial cell culture: a comprehensive guide to trypsinization

تلعب الخلايا الطلائية للعدسة (LECs) أدوارا مهمة متعددة في الحفاظ على الاتزان الداخلي للعدسة ووظيفتها الطبيعية. تحدد LECs نمو العدسة وتطورها وحجمها وشفافيتها. على العكس من ذلك ، يمكن أن تؤدي LECs المختلة وظيفيا إلى تكوين إعتام عدسة العين وعتامة الكبسولة الخلفية (PCO). وبالتالي ، فإن إنشاء نظام زراعة LEC أولي قوي أمر مهم للباحثين المشاركين في تطوير العدسات والكيمياء الحيوية وعلاجات إعتام عدسة العين والوقاية من PCO. ومع ذلك، فإن زراعة المجتمعات المحلية منخفضة الاستهلاك الأولية تمثل تحديات منذ فترة طويلة بسبب محدودية توافرها، وبطء معدل انتشارها، وطبيعتها الحساسة. 
تعالج هذه الدراسة هذه العقبات من خلال تقديم بروتوكول شامل لثقافة LEC الأولية. ويشمل البروتوكول خطوات أساسية مثل صياغة وسط استزراع محسن، وعزل دقيق لكبسولات العدسات، وتقنيات التربسين، وإجراءات الاستزراع الفرعي، وبروتوكولات الحصاد، والمبادئ التوجيهية للتخزين والشحن. طوال عملية الاستزراع ، تمت مراقبة مورفولوجيا الخلية باستخدام الفحص المجهري لتباين الطور. 
لتأكيد صحة LECs المستزرعة ، تم إجراء فحوصات التألق المناعي للكشف عن وجود وتوزيع بروتينات العدسة الحرجة ، وهي αA و γ-crystallins. يزود هذا البروتوكول المفصل الباحثين بمورد قيم لزراعة وتوصيف LECs الأولية ، مما يتيح التقدم في فهمنا لبيولوجيا العدسة وتطوير استراتيجيات علاجية للاضطرابات المرتبطة بالعدسات.

The lens of the eye plays a crucial role in vision by focusing incoming light onto the retina. It consists of a transparent, avascular structure composed of specialized cells, among which lens epithelial cells (LECs) are key players. LECs are located at the anterior surface of the lens and are responsible for maintaining its transparency, regulating water balance, and participating in lens growth and development1,2. LECs are a unique type of cells located at the anterior part of the lens, playing a critical role in maintaining lens clarity and function by continuously producing lens fibers throughout life.
Cataracts are characterized by the progressive clouding of the lens, resulting in the distortion and scattering of light, leading to compromised vision3,4. The precise mechanisms underlying cataract formation are complex and multifactorial, involving various cellular and molecular processes such as UV radiation, oxidative damage, and glycation5,6. LECs have been found to contribute significantly to the development of cataracts, making them a vital focus of research1,2,7,8,9.
Furthermore, one of the most pressing issues in ophthalmology today is the relatively high incidence of posterior capsule opacification (PCO), also known as secondary cataract. PCO remains the most common complication after cataract surgery, affecting up to 20-40% of adult patients and 100% of children within 5 years post surgery10. PCO is primarily caused by the residual LECs that remain in the capsular bag following cataract extraction. These cells undergo a multifaceted pathophysiological transformation involving not only epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) but also the differentiation of LECs to lens fibers, resulting in a cell population that is a mixture of LECs, fibers, and myofibroblasts11,12,13. The transformed cells proliferate and migrate across the posterior lens capsule, leading to visual impairment. Understanding the behavior and control mechanisms of LECs in culture models can provide valuable insights into the prevention and management of PCO. Therefore, this protocol of culturing LECs presents a vital tool for ophthalmic researchers aiming to study, understand, and ultimately combat this prevalent postoperative complication.
To unravel the intricacies of LEC biology and its role in cataract formation and PCO, it is essential to establish robust and reproducible in vitro primary cell culture systems. Primary LEC culture provides researchers with a controlled environment to study the functions, signaling, and molecular characteristics of LECs. Furthermore, it allows for the investigation of cellular processes and the effects of different experimental conditions, providing valuable insights into lens physiology and pathology.
Prior research has enriched our understanding of LEC culture techniques14,15,16,17,18,19,20. Although these studies have employed various methodologies and yielded significant findings on LEC behavior and characteristics, a comprehensive and accessible video recording protocol for culturing LECs is absent in the current literature. This limitation can hinder novice researchers&#39; ability to accurately reproduce the techniques and can lead to inconsistencies and variations in experimental results. By providing a video recording protocol, this research paper aims to bridge this gap and provide a standardized resource that can enhance reproducibility and facilitate knowledge transfer in the field of LEC culture.

تسليط الضوء على المؤلف: فتح أسرار إعتام عدسة العين - التحقيق في إنزيمات إصلاح الأكسدة والاختزال في الخلايا الظهارية للعدسة

تحسين ثقافة الخلايا الظهارية للعدسة الأساسية للماوس: دليل شامل للتربسين

Our research objective is to explore the underlying causes of cataracts with a particular emphasis on the function of redox repair enzymes. Our aim is to identify the critical role this enzyme play in lens protection, and to establish their potential as drug targets for cataract prevention and treatment. Among many exciting technologies, our research uses lens epithelial cells as a foundational platform.This approach is critical for unraveling the mechanism behind cataract formation, posterior capsule opacification, and the discovery of new anti-cataract drugs. Moving forward, we will focus on understanding the impact of antioxidant enzymes and aging on lens functionality. Our goal is to discover innovative antioxidant treatments that can delay lens aging, prevent cataracts, and provide effective intervention for PCO.

كما هو موضح في الشكل 2 ، باتباع هذا البروتوكول ، التصقت LECs الأولية من الفئران C57BL / 6J بالأطباق خلال فترة 4 ساعات. والجدير بالذكر أنه كانت هناك بقايا مرئية لأنسجة أخرى مثل أقسام الكبسولة الخلفية وخلايا ألياف العدسة. ومع ذلك ، فإن هذه العناصر غير المقصودة لم تعلق على الطبق ، وبا?...

تحدد هذه المخطوطة بروتوكول فيديو مفصل لزراعة الخلايا الظهارية للعدسة الأولية (LECs) ، بهدف تحسين قابلية التكاثر والمساعدة في البحث في إعتام عدسة العين وعتامة الكبسولة الخلفية (PCO). يقدم إرشادات خطوة بخطوة حول تشريح العدسة ، وعزل LECs ، والتحقق من صحتها ، وهو بمثابة دليل قيم ، خاصة للوافدين الجدد في هذا المجال.

Lens epithelial cells (LECs) play multiple important roles in maintaining the homeostasis and normal function of the lens. LECs determine lens growth, ...

هدفنا البحثي هو استكشاف الأسباب الكامنة وراء إعتام عدسة العين مع التركيز بشكل خاص على وظيفة إنزيمات إصلاح الأكسدة والاختزال. هدفنا هو تحديد الدور الحاسم الذي يلعبه هذا الإنزيم في حماية العدسات ، وتحديد إمكاناتها كأهداف دوائية للوقاية من إعتام عدسة العين وعلاجه. من بين العديد من التقنيات المثيرة ، يستخدم بحثنا الخلايا الظهارية للعدسة كمنصة أساسية.هذا النهج أمر بالغ الأهمية لكشف الآلية الكامنة وراء تكوين إعتام عدسة العين ، وعتامة الكبسولة الخلفية ، واكتشاف أدوية جديدة مضادة لإعتام عدسة العين. من الآن فصاعدا ، سنركز على فهم تأثير الإنزيمات المضادة للأكسدة والشيخوخة على وظائف العدسة. هدفنا هو اكتشاف علاجات مبتكرة مضادة للأكسدة يمكن أن تؤخر شيخوخة العدسة ، وتمنع إعتام عدسة العين ، وتوفر تدخلا فعالا ل PCO.

optimizing-mouse-primary-lens-epithelial-cell-culture-comprehensive

Research

JoVE Journal

Biology

Optimizing Mouse Primary Lens Epithelial Cell Culture: A Comprehensive Guide to Trypsinization

1.2K Views.  University of North Texas Health Science Center. هدفنا البحثي هو استكشاف الأسباب الكامنة وراء إعتام عدسة العين مع التركيز بشكل خاص على وظيفة إنزيمات إصلاح الأكسدة والاختزال. هدفنا هو تحديد الدور الحاسم الذي يلعبه هذا الإنزيم في حماية العدسات ، وتحديد إمكاناتها كأهداف دوائية للوقاية من إعتام عدسة العين وعلاجه. من بين الع...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: فتح أسرار إعتام عدسة العين - التحقيق في إنزيمات إصلاح الأكسدة والاختزال في الخلايا الظهارية للعدسة

Lens epithelial cells (LECs) play multiple important roles in maintaining the homeostasis and normal function of the lens. LECs determine lens growth, development, size, and transparency. Conversely, dysfunctional LECs can lead to cataract formation and posterior capsule opacification (PCO). Consequently, establishing a robust primary LEC culture system is important to researchers engaged in lens development, biochemistry, cataract therapeutics, and PCO prevention. However, cultivating primary LECs has long presented challenges due to their limited availability, slow proliferation rate, and delicate nature. 
This study addresses these hurdles by presenting a comprehensive protocol for primary LEC culture. The protocol encompasses essential steps such as the formulation of an optimized culture medium, precise isolation of lens capsules, trypsinization techniques, subculture procedures, harvest protocols, and guidelines for storage and shipment. Throughout the culture process, cell morphology was monitored using phase-contrast microscopy. 
To confirm the authenticity of the cultured LECs, immunofluorescence assays were conducted to detect the presence and subcellular distribution of critical lens proteins, namely &#945;A- and &#947;-crystallins. This detailed protocol equips researchers with a valuable resource for cultivating and characterizing primary LECs, enabling advancements in our comprehension of lens biology and the development of therapeutic strategies for lens-related disorders.

This manuscript outlines a detailed video protocol for culturing primary lens epithelial cells (LECs), aiming to improve reproducibility and aid research in cataracts and posterior capsule opacification (PCO). It offers step-by-step instructions on lens dissection, LECs isolation, and validation, serving as a valuable guide, especially for newcomers in the field.