이 작업은 NEI R21EY033941(to Hongli Wu)의 지원을 받았습니다. 국방부 W81XWH2010896 (Hongli Wu에게); R15GM123463-02 (케일라 그린과 홍리 우에게)

모든 동물 실험은 안과 및 시력 연구에서 동물 사용에 대한 시력 및 안과 연구 협회 지침에 따라 수행되었습니다. 절차적 승인은 University of North Texas Health Science Center Animal Care and Use Committee(프로토콜 번호: IACUC-2022-0008)에서 부여했습니다. 일반적으로 생후 2주 미만의 어린 C57BL/6J 마우스가 이 연구에 사용되었습니다.
1. 배양액 준비 및 수정체 해부
<ol><li>50mL의 소 태아 혈청(FBS)과 0.1mL의 겐타마이신 50mg/mL를 DMEM 450mL에 첨가하여 배양 배지를 준비합니다.</li>
	<li>2주 미만의 C57BL/6J 마우스를 인도적으로 안락사시킵니다. 참고:CO2 흡입 방법을 사용하여 안락사시켰습니다. CO2 안락사 시스템의 최적 유속은 챔버 또는 케이지 부피/분의 30%에서 70%를 변위시켜야 합니다.</li>
	<li>수술용 가위로 눈꺼풀을 부드럽게 제거하고 눈구멍의 반대쪽에 구부러진 핀셋으로 섬세한 압력을 가하여 눈이 바깥쪽으로 튀어나오도록 합니다. 백내장 칼을 사용하여 각막을 조심스럽게 절개하고 구부러진 핀셋을 사용하여 수정체를 조심스럽게 빼내어 수정체나 캡슐이 손상되지 않도록 합니다. 알림: 렌즈 캡슐의 무결성을 유지하기 위해 이 단계를 수행하는 동안 주의하십시오. 렌즈의 섬세한 특성으로 인해 렌즈 손상 위험을 최소화하기 위해 끝이 구부러지고 뭉툭한 해부 도구를 사용하는 것이 중요합니다.</li>
	<li>끝이 뭉툭한 곡선형 핀셋을 사용하여 10μg/mL 겐타마이신이 함유된 5mL의 예열 및 멸균 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS) 용액으로 채워진 60mm 플라스틱 조직 배양 접시에 렌즈를 옮깁니다.</li>
	<li>10μg/mL 겐타마이신이 함유된 DPBS 용액으로 렌즈를 부드럽게 헹구어 잠재적인 이물질이나 오염 물질을 제거하고, 추가 처리를 위해 렌즈를 준비하고, 멸균 배양 환경을 유지합니다.</li>
	<li>적절한 수의 LEC를 얻으려면 24-well 배양 플레이트에 4개의 렌즈를 풀링하고 6-well 배양 플레이트에 6개의 렌즈를 풀링합니다.</li>
</ol>2. LEC 격리
<ol><li>헹굼 과정이 끝나면 렌즈를 여과지 위에 올려 건조시킵니다.</li>
	<li>렌즈가 충분히 건조되면 렌즈 캡슐 제거를 준비하기 위해 페트리 접시의 덮개에 조심스럽게 옮깁니다.</li>
	<li>렌즈를 위쪽으로 돌려 앞쪽 부분이 위쪽을 향하도록 합니다. 핀셋을 사용하여 전방 캡슐을 잡는 동안 주로 사용하는 손에 캡슐 헥시스 겸자를 사용하여 캡슐에 작은 찢어짐을 만듭니다. 두 도구를 반대 방향으로 부드럽게 당겨 캡슐을 제거하고 모든 수정체 박리가 완료될 때까지 DPBS에 넣습니다. 참고: 불일치를 피하기 위해 연구자들은 각 수정체 상피 캡슐을 즉시 절개하고 DPBS에 임시로 보관해야 합니다. 모든 해부를 완료한 후에만 캡슐을 37°C로 유지되는 트립신으로 집합적으로 옮겨 동기화되고 균일한 노출을 보장합니다.</li>
	<li>렌즈 캡슐을 6웰 플레이트에 조심스럽게 옮깁니다. 각 웰에 0.05% 트립신 용액 1mL를 추가하여 효소 분해 과정을 시작합니다.</li>
	<li>트립신 용액을 부드럽게 저어 균일한 투과를 보장합니다. 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 넣고 캡슐을 37°C에서 8-10분 동안 분해합니다. 참고: 이 단계는 수정체 캡슐 조직의 분해와 개별 상피 세포의 후속 방출을 용이하게 합니다.</li>
	<li>배양 후 소화된 수정체 캡슐을 해부 가위를 사용하여 조심스럽게 다져 남아 있는 조직 덩어리를 분해하고 세포 분리를 촉진합니다. 참고: 소화된 렌즈 캡슐에서 효율적인 세포 방출을 보장하기 위해 조직 다질의 철저함이 강조됩니다.</li>
	<li>트립신을 담금질하기 위해 10% FBS가 함유된 배양 배지 0.5mL를 추가합니다. 조직 샘플을 원심분리 튜브로 옮기고 1,000× g 의 속도로 5분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>세포 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 제거하십시오. 1mL의 배양 배지를 사용하여 세포를 재현탁시키고 24웰 플레이트에 세포를 시드합니다.</li>
	<li>배양 배지는 2-3일마다 교체합니다.</li>
</ol>3. LEC 서브컬쳐
<ol><li>세포가 합류하면 배양 접시에서 배지를 제거합니다. 1mL의 DPBS로 세포를 2번 세척합니다.</li>
	<li>200μL의 트립신-EDTA 용액을 넣고 세포를 인큐베이터에 5분 동안 넣습니다.</li>
	<li>배양 후 인큐베이터에서 세포를 제거하고 현미경으로 검사하여 배양 접시에서 분리되어 부유하기 시작했는지 확인합니다.</li>
	<li>배양 배지 1mL를 추가하고 세포를 3-5배 부드럽게 피펫팅하여 모든 세포를 분리합니다.</li>
	<li>세포를 원심분리 튜브로 옮기고 1,000× g 에서 5분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>상층액을 조심스럽게 제거하고 완전한 성장 배지에 세포를 재현탁시킵니다.</li>
	<li>필요한 경우 혈구계를 사용하여 세포 수를 계산합니다.</li>
	<li>subculturing 목적을 위해 세포 현탁액을 1:2 또는 1:3 비율로 세분화합니다.</li>
	<li>문화권이 다시 합류하면 앞서 언급한 절차를 반복합니다. 참고: LEC는 고밀도 배양 조건에서 번성합니다. 세포를 과도하게 희석하면 세포의 성장을 방해할 수 있으므로 피하십시오.</li>
</ol>4. 저장 및 선적
알림: 저장을 위한 이상적인 셀 번호는 ~1 × 106입니다.
<ol><li>1mL의 DPBS로 세포를 3배 철저히 세척합니다. 세척 후 트립신-EDTA 용액 1mL를 넣고 세포를 인큐베이터에 5분 동안 넣습니다.</li>
	<li>2mL의 완전 배양 배지를 추가하고 세포 현탁액을 원심분리 튜브에 옮기고 1,000× g 에서 5분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>상층액을 버리고 90% FBS 및 10% DMSO로 구성된 냉동 배지에 세포를 재현탁시켜 세포 밀도를 1 × 106 cells/mL로 목표로 합니다. 세포 현탁액을 cryovial로 옮깁니다.</li>
	<li>즉시 세포를 -20°C 환경으로 1시간 동안 이동한 다음 밤새 -80°C로 이동한 후 액체 질소에 영구적으로 보관합니다. 알림: 액체 질소를 사용할 수 없는 경우 셀은 -80°C에서 처음 한 시간 후에 -20°C에서 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>배송이 필요한 경우, 익일 배송을 위해 드라이아이스와 함께 크라이오비얼의 세포를 패키지에 담아 배송하십시오.</li>
	<li>세포를 수령하면 신속한 회복을 보장하고 세포를 하위 배양에 넣습니다. 즉각적인 배양이 불가능한 경우 세포를 액체 질소로 옮겨 장기간 보관합니다. 알림: 셀을 배송해야 하는 경우 samples는 온도 변화로 인한 잠재적인 손상을 방지하기 위해 드라이아이스에 깊숙이 묻혀 있습니다.</li>
</ol>5. LEC 검증
<ol><li>커버 유리를 사용하여 LEC를 35mm 배양 접시에 담고 약 48시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>PBS로 세포를 2배 세척하고 -20°C에서 10분 동안 차가운 메탄올로 세포를 고정합니다.</li>
	<li>고정 세포를 PBS로 3 x 5분 동안 세척하고 비특이적 결합을 방지하기 위해 실온에서 차단 완충액으로 고정 세포를 1시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>차단 후 희석제 완충액에 1:50 비율로 개별적으로 희석한 1차 항체(αA-crystallin, γ-crystallin 및 PROX1 항체)를 사용하여 4°C에서 밤새 세포를 배양합니다.</li>
	<li>PBS로 세포를 3 x 5분 동안 세척하고 2차 항체를 희석제 완충액에 1:100으로 희석하여 1시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>PBS로 세포를 3 x 5분 동안 세척하고 PBS에서 5μg/mL Hoechst 33342로 실온에서 10분 동안 세포를 염색하여 핵을 시각화합니다.</li>
	<li>PBS로 세포를 2 x 5분 동안 세척하여 과도한 염색 용액을 제거하고 핵용 DAPI 채널과 αA-, γ-결정질 및 PROX1용 FITC 채널을 사용하는 형광 현미경을 사용하여 세포의 형광 이미지를 캡처합니다.</li>
</ol>

수정체 상피세포의 배양 및 특성화(Cultivation and Characterization of Lens Epithelial Cells)

<ol>
	<li>Bermbach, G., Mayer, U., Naumann, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+lens+epithelial+cells+in+tissue+culture.">Human lens epithelial cells in tissue culture.</a> Experimental Eye Research. 52 (2), 113-119 (1991).</li><li>Reddy, V. N., Lin, L. R., Arita, T., Zigler, J. S., Huang, Q. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallins+and+their+synthesis+in+human+lens+epithelial+cells+in+tissue+culture.">Crystallins and their synthesis in human lens epithelial cells in tissue culture.</a> Experimental Eye Research. 47 (3), 465-478 (1988).</li><li>Lee, C. M., Afshari, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+state+of+cataract+blindness.">The global state of cataract blindness.</a> Current Opinion in Ophthalmology. 28 (1), 98-103 (2017).</li><li>Khairallah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Number+of+people+blind+or+visually+impaired+by+cataract+worldwide+and+in+world+regions,+1990+to+2010.">Number of people blind or visually impaired by cataract worldwide and in world regions, 1990 to 2010.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 56 (11), 6762-6769 (2015).</li><li>Beebe, D. C., Holekamp, N. M., Shui, Y. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+damage+and+the+prevention+of+age-related+cataracts.">Oxidative damage and the prevention of age-related cataracts.</a> Ophthalmic Research. 44 (3), 155-165 (2010).</li><li>Lou, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+regulation+in+the+lens.">Redox regulation in the lens.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 22 (5), 657-682 (2003).</li><li>Charakidas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lens+epithelial+apoptosis+and+cell+proliferation+in+human+age-related+cortical+cataract.">Lens epithelial apoptosis and cell proliferation in human age-related cortical cataract.</a> European Journal of Ophthalmology. 15 (2), 213-220 (2005).</li><li>Lou, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+and+glutaredoxin+in+redox+regulation+and+cell+signaling+of+the+lens.">Glutathione and glutaredoxin in redox regulation and cell signaling of the lens.</a> Antioxidants (Basel). 11 (10), 1973 (2022).</li><li>Wilhelm, J., Smistik, Z., Mahelkova, G., Vytasek, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+regulation+of+proliferation+of+lens+epithelial+cells+in+culture.">Redox regulation of proliferation of lens epithelial cells in culture.</a> Cell Biochemistry &amp; Function. 25 (3), 317-321 (2007).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+progress+concerning+a+novel+intraocular+lens+for+the+prevention+of+posterior+capsular+opacification.">Research progress concerning a novel intraocular lens for the prevention of posterior capsular opacification.</a> Pharmaceutics. 14 (7), 1343 (2022).</li><li>Konopinska, J., Mlynarczyk, M., Dmuchowska, D. A., Obuchowska, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posterior+capsule+opacification:+A+review+of+experimental+studies.">Posterior capsule opacification: A review of experimental studies.</a> Journal of Clinical Medicine. 10 (13), 2847 (2021).</li><li>Pandey, S. K., Apple, D. J., Werner, L., Maloof, A. J., Milverton, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posterior+capsule+opacification:+A+review+of+the+aetiopathogenesis,+experimental+and+clinical+studies+and+factors+for+prevention.">Posterior capsule opacification: A review of the aetiopathogenesis, experimental and clinical studies and factors for prevention.</a> Indian Journal of Ophthalmology. 52 (2), 99-112 (2004).</li><li>Wei, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aged+lens+epithelial+cells+suppress+proliferation+and+epithelial-mesenchymal+transition-relevance+for+posterior+capsule+opacification.">Aged lens epithelial cells suppress proliferation and epithelial-mesenchymal transition-relevance for posterior capsule opacification.</a> Cells. 11 (13), 2001 (2022).</li><li>Creighton, M. O., Mousa, G. Y., Miller, G. G., Blair, D. G., Trevithick, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+rat+lens+epithelial+cells+in+tissue+culture--iv.+Some+characteristics+of+the+process,+including+possible+in+vitro+models+for+pathogenic+processes+in+cataractogenesis.">Differentiation of rat lens epithelial cells in tissue culture--iv. Some characteristics of the process, including possible in vitro models for pathogenic processes in cataractogenesis.</a> Vision Research. 21 (1), 25-35 (1981).</li><li>Creighton, M. O., Mousa, G. Y., Trevithick, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+rat+lens+epithelial+cells+in+tissue+culture.+(i)+effects+of+cell+density,+medium+and+embryonic+age+of+initial+culture.">Differentiation of rat lens epithelial cells in tissue culture. (i) effects of cell density, medium and embryonic age of initial culture.</a> Differentiation. 6 (3), 155-167 (1976).</li><li>Ibaraki, N., Ohara, K., Shimizu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explant+culture+of+human+lens+epithelial+cells+from+senile+cataract+patients.">Explant culture of human lens epithelial cells from senile cataract patients.</a> Japanese Journal of Ophthalmology. 37 (3), 310-317 (1993).</li><li>Sundelin, K., Petersen, A., Soltanpour, Y., Zetterberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+growth+of+lens+epithelial+cells+from+cataract+patients+-+association+with+possible+risk+factors+for+posterior+capsule+opacification.">In vitro growth of lens epithelial cells from cataract patients - association with possible risk factors for posterior capsule opacification.</a> The Open Ophthalmology Journal. 8, 19-23 (2014).</li><li>Parreno, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodologies+to+unlock+the+molecular+expression+and+cellular+structure+of+ocular+lens+epithelial+cells.">Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 983178 (2022).</li><li>Andjelic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+proliferative+studies+on+ex+vivo+cultured+human+anterior+lens+epithelial+cells+-+relevance+to+capsular+opacification.">Morphological and proliferative studies on ex vivo cultured human anterior lens epithelial cells - relevance to capsular opacification.</a> Acta Ophthalmologica. 93 (6), e499-e506 (2015).</li><li>Andjelic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+establishing+adherent+ex+vivo+explant+cultures+from+human+eye+pathologies+for+use+in+subsequent+calcium+imaging+and+inflammatory+studies.">A simple method for establishing adherent ex vivo explant cultures from human eye pathologies for use in subsequent calcium imaging and inflammatory studies.</a> Journal of Immunology Research. 2014, 232659 (2014).</li><li>Andley, U. P., Rhim, J. S., Chylack, L. T., Fleming, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+and+immortalization+of+human+lens+epithelial+cells+in+culture.">Propagation and immortalization of human lens epithelial cells in culture.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 35 (7), 3094-3102 (1994).</li><li>Zhou, M., Leiberman, J., Xu, J., Lavker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hierarchy+of+proliferative+cells+exists+in+mouse+lens+epithelium:+Implications+for+lens+maintenance.">A hierarchy of proliferative cells exists in mouse lens epithelium: Implications for lens maintenance.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 47 (7), 2997-3003 (2006).</li><li>Wolffe, A. P., Glover, J. F., Tata, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+shock.+Synthesis+of+heat-shock-like+proteins+in+fresh+primary+cell+cultures.">Culture shock. Synthesis of heat-shock-like proteins in fresh primary cell cultures.</a> Experimental Cell Research. 154 (2), 581-590 (1984).</li><li>Haykin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioimage+analysis+of+cell+physiology+of+primary+lens+epithelial+cells+from+diabetic+and+non-diabetic+cataract+patients.">Bioimage analysis of cell physiology of primary lens epithelial cells from diabetic and non-diabetic cataract patients.</a> Biotechnology &amp; Biotechnological Equipment. 35 (1), 170-178 (2021).</li><li>Menko, A. S., Klukas, K. A., Johnson, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chicken+embryo+lens+cultures+mimic+differentiation+in+the+lens.">Chicken embryo lens cultures mimic differentiation in the lens.</a> Developmental Biology. 103 (1), 129-141 (1984).</li><li>Zelenka, P. S., Gao, C. Y., Saravanamuthu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+culture+of+rat+lens+epithelial+explants+for+studying+terminal+differentiation.">Preparation and culture of rat lens epithelial explants for studying terminal differentiation.</a> Journal of Visualized Experiments. (31), 1591 (2009).</li></ol>

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

이 백서에 제시된 프로토콜은 기본 LEC의 성공적인 격리, 배양 및 하위 배양에 대한 포괄적인 단계별 가이드를 제공하며 함께 제공되는 비디오 문서도 함께 제공됩니다. 서면 지침과 함께 상세한 시각적 가이드는 프로토콜의 명확성과 접근성을 향상시켜 해당 분야의 연구자들 사이에서 프로토콜의 사용과 재현성을 촉진합니다. 궁극적인 목표는 백내장 형성 및 백내장 수술 후 만연한 합병증인 PCO?...

눈의 수정체는 들어오는 빛을 망막에 집중시킴으로써 시력에 중요한 역할을 합니다. 이 세포는 특수 세포로 구성된 투명한 무혈 구조로 구성되어 있으며, 그 중 수정체 상피 세포(LEC)가 핵심 역할을 합니다. LEC는 수정체의 전면에 위치하며 수정체의 투명성을 유지하고, 수분 균형을 조절하며, 수정체의 성장과 발달에 관여하는 역할을 합니다 1,2. LEC는 수정체의 앞쪽에 위치한 독특한 유형의 세포로, 평생 동안 수정체 섬유를 지속적으로 생산하여 수정체의 선명도와 기능을 유지하는 데 중요한 역할을 합니다.
백내장은 수정체가 점진적으로 흐려져 빛의 왜곡과 산란을 일으켜 시력을 손상시키는 것이 특징입니다 3,4. 백내장 형성의 기초가 되는 정확한 메커니즘은 복잡하고 다인자적이며, 자외선, 산화 손상 및 당화와 같은 다양한 세포 및 분자 과정을 포함합니다 5,6. LEC는 백내장의 발병에 크게 기여하는 것으로 밝혀져 연구의 중요한 초점이 되고 있습니다 1,2,7,8,9.
또한 오늘날 안과에서 가장 시급한 문제 중 하나는 이차성 백내장이라고도 하는 후낭 혼탁(PCO)의 발생률이 상대적으로 높다는 것입니다. 다낭성 난소 증후군은 백내장 수술 후 가장 흔한 합병증으로, 수술 후 5년 이내에 성인 환자의 최대 20-40%, 소아 환자의 100%에 영향을 미친다10. PCO는 주로 백내장 적출 후 수정체 주머니에 남아 있는 잔류 LEC에 의해 발생합니다. 이 세포들은 상피에서 중간엽으로의 전이(EMT)뿐만 아니라 LEC에서 수정체 섬유로의 분화를 포함하는 다면적인 병태생리학적 변형을 겪으며, 그 결과 LEC, 섬유 및 근섬유아세포가 혼합된 세포 집단이 생성됩니다 11,12,13. 형질전환된 세포는 수정체 후낭을 가로질러 증식하고 이동하여 시각 장애를 일으킵니다. 배양 모델에서 LEC의 행동 및 제어 메커니즘을 이해하면 PCO의 예방 및 관리에 대한 귀중한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 따라서 LEC를 배양하는 이 프로토콜은 이 만연한 수술 후 합병증을 연구, 이해 및 궁극적으로 퇴치하는 것을 목표로 하는 안과 연구자에게 중요한 도구를 제공합니다.
LEC 생물학의 복잡성과 백내장 형성 및 PCO에서의 LEC 생물학의 역할을 밝히기 위해서는 견고하고 재현 가능한 in vitro 1차 세포 배양 시스템을 구축하는 것이 필수적입니다. 1차 LEC 배양은 연구자에게 LEC의 기능, 신호 전달 및 분자 특성을 연구할 수 있는 통제된 환경을 제공합니다. 또한 세포 과정과 다양한 실험 조건의 영향을 조사할 수 있어 수정체 생리학 및 병리학에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다.
선행 연구는 LEC 배양 기법에 대한 우리의 이해를 풍부하게 했다 14,15,16,17,18,19,20. 이러한 연구는 다양한 방법론을 사용하고 LEC 행동 및 특성에 대한 중요한 결과를 도출했지만 LEC 배양을 위한 포괄적이고 접근 가능한 비디오 녹화 프로토콜은 현재 문헌에 없습니다. 이러한 제한은 초보 연구자가 기술을 정확하게 재현하는 데 방해가 될 수 있으며 실험 결과의 불일치 및 변동으로 이어질 수 있습니다. 이 연구 논문은 비디오 녹화 프로토콜을 제공함으로써 이러한 격차를 해소하고 LEC 문화 분야에서 재현성을 높이고 지식 전달을 촉진할 수 있는 표준화된 리소스를 제공하는 것을 목표로 합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#25300054</td>
			<td>For LECs dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Secondary Antibody&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>#715-545-150</td>
			<td>For cell validation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-605-003</td>
			<td>For cell validation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody dilution buffer</td>
			<td>Licor</td>
			<td>#927-60001</td>
			<td>For cell validation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaver safety knife</td>
			<td>Beaver-Visitec International</td>
			<td>#3782235</td>
			<td>For lens dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking buffer</td>
			<td>Licor</td>
			<td>#927-60001</td>
			<td>For cell validation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capsulorhexis forceps</td>
			<td>Titan Medical Instruments</td>
			<td>TMF-124</td>
			<td>For lens capsule isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6429</td>
			<td>For LECs culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>#D2650</td>
			<td>For making freezing medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#J67802</td>
			<td>For lens dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont tweezers</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-4976</td>
			<td>For lens capsule isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EpiCGS-a (optional)</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>4182</td>
			<td>For LECs culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td>For LECs culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin (50&#160;mg/mL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1397</td>
			<td>For LECs culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342 solution</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#62249</td>
			<td>For cell validation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-dissecting scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument&#160;</td>
			<td>RS-5983</td>
			<td>For lens dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-dissecting tweezers</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument&#160;</td>
			<td>RS5137&#160;</td>
			<td>For lens dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PROX1 antibody</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11067-2-AP</td>
			<td>For cell validation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas micro-dissecting spring scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-5608</td>
			<td>For lens capsule isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;A-crystallin antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-28306</td>
			<td>For cell validation&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;-crystallin antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-365256</td>
			<td>For cell validation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimizing mouse primary lens epithelial cell culture: a comprehensive guide to trypsinization

수정체 상피세포(LEC)는 수정체의 항상성과 정상적인 기능을 유지하는 데 여러 가지 중요한 역할을 합니다. LEC는 렌즈의 성장, 발달, 크기 및 투명도를 결정합니다. 반대로, LEC의 기능 장애는 백내장 형성 및 후낭 혼탁(PCO)으로 이어질 수 있습니다. 따라서 강력한 1차 LEC 배양 시스템을 구축하는 것은 수정체 개발, 생화학, 백내장 치료제 및 PCO 예방에 종사하는 연구자에게 중요합니다. 그러나 1차 LEC를 배양하는 것은 제한된 가용성, 느린 증식 속도 및 섬세한 특성으로 인해 오랫동안 어려움을 겪어 왔습니다. 
이 연구는 1차 LEC 배양을 위한 포괄적인 프로토콜을 제시함으로써 이러한 장애물을 해결합니다. 이 프로토콜은 최적화된 배양 배지의 제형화, 렌즈 캡슐의 정확한 분리, 트립신화 기술, 하위 배양 절차, 수확 프로토콜, 보관 및 배송 지침과 같은 필수 단계를 포함합니다. 배양 과정 전반에 걸쳐 위상차 현미경을 사용하여 세포 형태를 모니터링했습니다. 
배양된 LEC의 진위를 확인하기 위해 면역형광 분석을 수행하여 중요한 수정체 단백질, 즉 αA- 및 γ-결정체의 존재 및 세포 내 분포를 검출했습니다. 이 상세한 프로토콜은 연구자들에게 일차 LEC를 배양하고 특성화하는 데 유용한 자원을 제공하여 수정체 생물학에 대한 이해와 수정체 관련 질환에 대한 치료 전략 개발을 가능하게 합니다.

The lens of the eye plays a crucial role in vision by focusing incoming light onto the retina. It consists of a transparent, avascular structure composed of specialized cells, among which lens epithelial cells (LECs) are key players. LECs are located at the anterior surface of the lens and are responsible for maintaining its transparency, regulating water balance, and participating in lens growth and development1,2. LECs are a unique type of cells located at the anterior part of the lens, playing a critical role in maintaining lens clarity and function by continuously producing lens fibers throughout life.
Cataracts are characterized by the progressive clouding of the lens, resulting in the distortion and scattering of light, leading to compromised vision3,4. The precise mechanisms underlying cataract formation are complex and multifactorial, involving various cellular and molecular processes such as UV radiation, oxidative damage, and glycation5,6. LECs have been found to contribute significantly to the development of cataracts, making them a vital focus of research1,2,7,8,9.
Furthermore, one of the most pressing issues in ophthalmology today is the relatively high incidence of posterior capsule opacification (PCO), also known as secondary cataract. PCO remains the most common complication after cataract surgery, affecting up to 20-40% of adult patients and 100% of children within 5 years post surgery10. PCO is primarily caused by the residual LECs that remain in the capsular bag following cataract extraction. These cells undergo a multifaceted pathophysiological transformation involving not only epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) but also the differentiation of LECs to lens fibers, resulting in a cell population that is a mixture of LECs, fibers, and myofibroblasts11,12,13. The transformed cells proliferate and migrate across the posterior lens capsule, leading to visual impairment. Understanding the behavior and control mechanisms of LECs in culture models can provide valuable insights into the prevention and management of PCO. Therefore, this protocol of culturing LECs presents a vital tool for ophthalmic researchers aiming to study, understand, and ultimately combat this prevalent postoperative complication.
To unravel the intricacies of LEC biology and its role in cataract formation and PCO, it is essential to establish robust and reproducible in vitro primary cell culture systems. Primary LEC culture provides researchers with a controlled environment to study the functions, signaling, and molecular characteristics of LECs. Furthermore, it allows for the investigation of cellular processes and the effects of different experimental conditions, providing valuable insights into lens physiology and pathology.
Prior research has enriched our understanding of LEC culture techniques14,15,16,17,18,19,20. Although these studies have employed various methodologies and yielded significant findings on LEC behavior and characteristics, a comprehensive and accessible video recording protocol for culturing LECs is absent in the current literature. This limitation can hinder novice researchers&#39; ability to accurately reproduce the techniques and can lead to inconsistencies and variations in experimental results. By providing a video recording protocol, this research paper aims to bridge this gap and provide a standardized resource that can enhance reproducibility and facilitate knowledge transfer in the field of LEC culture.

저자 스포트라이트: 백내장의 비밀을 밝히다 – 수정체 상피 세포의 산화 환원 복구 효소 조사

Mouse Primary Lens 상피 세포 배양 최적화: 트립신화에 대한 종합 가이드

Our research objective is to explore the underlying causes of cataracts with a particular emphasis on the function of redox repair enzymes. Our aim is to identify the critical role this enzyme play in lens protection, and to establish their potential as drug targets for cataract prevention and treatment. Among many exciting technologies, our research uses lens epithelial cells as a foundational platform.This approach is critical for unraveling the mechanism behind cataract formation, posterior capsule opacification, and the discovery of new anti-cataract drugs. Moving forward, we will focus on understanding the impact of antioxidant enzymes and aging on lens functionality. Our goal is to discover innovative antioxidant treatments that can delay lens aging, prevent cataracts, and provide effective intervention for PCO.

그림 2에서 볼 수 있듯이 이 프로토콜을 따르면 C57BL/6J 마우스의 1차 LEC가 4시간 이내에 접시에 부착되었습니다. 특히, 후낭(posterior capsule)과 수정체 섬유 세포(lens fiber cell)의 일부와 같은 다른 조직의 흔적이 눈에 띄게 남아 있었습니다. 그러나 이러한 의도하지 않은 요소는 접시에 부착되지 않았으므로 배양 배지를 변경하여 제거할 수 있습니다. 그 후, 3일째에서 5일 사이에 ...

이 원고는 백내장 및 후낭 혼탁(PCO)에 대한 재현성을 개선하고 연구를 지원하는 것을 목표로 하는 1차 수정체 상피 세포(LEC) 배양을 위한 자세한 비디오 프로토콜을 간략하게 설명합니다. 렌즈 박리, LEC 분리 및 검증에 대한 단계별 지침을 제공하며, 특히 이 분야의 초보자에게 귀중한 가이드 역할을 합니다.

Lens epithelial cells (LECs) play multiple important roles in maintaining the homeostasis and normal function of the lens. LECs determine lens growth, ...

우리의 연구 목표는 산화 환원 복구 효소의 기능에 특히 중점을 두고 백내장의 근본적인 원인을 탐구하는 것입니다. 우리의 목표는 이 효소가 수정체 보호에 중요한 역할을 하는지 확인하고 백내장 예방 및 치료를 위한 약물 표적으로서의 잠재력을 확립하는 것입니다. 많은 흥미로운 기술 중에서 우리의 연구는 수정체 상피 세포를 기본 플랫폼으로 사용합니다.이 접근법은 백내장 형성, 후낭 혼탁 및 새로운 항백내장 약물의 발견 이면에 있는 메커니즘을 밝히는 데 매우 중요합니다. 앞으로는 항산화 효소와 노화가 렌즈 기능에 미치는 영향을 이해하는 데 중점을 둘 것입니다. 우리의 목표는 수정체 노화를 지연시키고 백내장을 예방하며 PCO에 효과적인 개입을 제공할 수 있는 혁신적인 항산화 치료법을 발견하는 것입니다.

optimizing-mouse-primary-lens-epithelial-cell-culture-comprehensive

Research

JoVE Journal

Biology

Optimizing Mouse Primary Lens Epithelial Cell Culture: A Comprehensive Guide to Trypsinization

1.1K 조회수.  University of North Texas Health Science Center. 우리의 연구 목표는 산화 환원 복구 효소의 기능에 특히 중점을 두고 백내장의 근본적인 원인을 탐구하는 것입니다. 우리의 목표는 이 효소가 수정체 보호에 중요한 역할을 하는지 확인하고 백내장 예방 및 치료를 위한 약물 표적으로서의 잠재력을 확립하는 것입니다. 많은 흥미로운 기술 중에서 우리의 연구는 수정체 상피 세포를 기본 플랫폼으로 사용합니다.이 접근?...

비디오: 저자 스포트라이트: 백내장의 비밀을 밝히다 – 수정체 상피 세포의 산화 환원 복구 효소 조사

Lens epithelial cells (LECs) play multiple important roles in maintaining the homeostasis and normal function of the lens. LECs determine lens growth, development, size, and transparency. Conversely, dysfunctional LECs can lead to cataract formation and posterior capsule opacification (PCO). Consequently, establishing a robust primary LEC culture system is important to researchers engaged in lens development, biochemistry, cataract therapeutics, and PCO prevention. However, cultivating primary LECs has long presented challenges due to their limited availability, slow proliferation rate, and delicate nature. 
This study addresses these hurdles by presenting a comprehensive protocol for primary LEC culture. The protocol encompasses essential steps such as the formulation of an optimized culture medium, precise isolation of lens capsules, trypsinization techniques, subculture procedures, harvest protocols, and guidelines for storage and shipment. Throughout the culture process, cell morphology was monitored using phase-contrast microscopy. 
To confirm the authenticity of the cultured LECs, immunofluorescence assays were conducted to detect the presence and subcellular distribution of critical lens proteins, namely &#945;A- and &#947;-crystallins. This detailed protocol equips researchers with a valuable resource for cultivating and characterizing primary LECs, enabling advancements in our comprehension of lens biology and the development of therapeutic strategies for lens-related disorders.

This manuscript outlines a detailed video protocol for culturing primary lens epithelial cells (LECs), aiming to improve reproducibility and aid research in cataracts and posterior capsule opacification (PCO). It offers step-by-step instructions on lens dissection, LECs isolation, and validation, serving as a valuable guide, especially for newcomers in the field.