يفصل هذا البروتوكول تحديد معدل تحلل الدهون في الخلايا الشحمية المستزرعة أو الأنسجة الدهنية خارج الجسم الحي ، مما يسمح بمقارنة معدلات تحلل الدهون بين نماذج الفئران أو العلاجات. يستخدم هذا البروتوكول أخذ العينات التسلسلية ، مما يسمح للمرء بالتحقق داخليا من أن تحلل الدهون يتم قياسه في الطور الخطي ويقلل من خطأ القياس. مع التحسين ، يمكن استخدام هذا البروتوكول لقياس تحلل الدهون في الأنسجة الدهنية البنية ، أو الأنسجة الدهنية من الكائنات الحية الأخرى ، أو خطوط الخلايا الشحمية المنشأ.
يجب تقطيع الأنسجة خارج الجسم الحي إلى قطع صغيرة ذات حجم وشكل ثابتين للسماح بعزل الأحماض الدهنية الحرة المنبعثة بواسطة BSA في الوسائط. للبدء ، قم بإعداد وسط 5٪ BSA عن طريق إذابة خمسة جرامات من ألبومين مصل الأبقار ، أو BSA ، في 100 ملليلتر من وسط النسر المعدل من Dulbecco ، أو DMEM ، بدون الفينول الأحمر. حرك المحلول برفق لحل BSA.
ثم قم بإعداد تركيزات العمل لوسائط التحكم والتحفيز. قبل الاستخدام ، قم بتسخين الوسائط إلى 37 درجة مئوية. قم بتسمية لوحة 96 بئرا لجمع الوسائط.
داخل غطاء دخان معقم ، قم بإجراء عزل وتمايز الخلايا الأولية المتقاربة بنسبة 100٪. كل يومين إلى ثلاثة أيام ، قم بتغيير وسائط الاستزراع التي تحتوي على الأنسولين مع الحفاظ على حجم ملليلتر واحد لكل بئر. في هذه الدراسة ، استخدم فقط الثقافات التي لديها معدلات تمايز أعلى من 90٪ وما شابه ذلك عبر المجموعات.
ثم استزراع الخلايا في وسائط خالية من الأنسولين لمدة 24 ساعة قبل قياس تحلل الدهون. اغسل الخلايا باستخدام DPBS مرة واحدة لإزالة المصل المتبقي من وسائط الاستزراع. قم بإعداد لوحة من 48 بئرا مع بئر واحد لكل نسخة مكررة.
ضع 400 ميكرولتر من DMEM بدرجة حرارة الغرفة في كل بئر لاستخدامها. استخدم اثنين إلى أربعة آبار تحكم واثنين إلى أربعة آبار محفزة لكل نسيج لكل فأر. قم بإعداد صفيحة من ستة آبار مع بئر واحدة لكل نسيج يتم جمعها من كل فأر ووضع أربعة ملليلتر من درجة حرارة الغرفة DMEM في كل بئر لاستخدامها.
ضع الأنسجة الدهنية للغدد التناسلية المجمعة في الصفيحة المكونة من ستة آبار. إزالة الأنسجة من البئر. ضعه على حصيرة سيليكون وقطعه إلى خمس إلى سبع قطع ملليغرام بالمقص.
لطخة الأنسجة على منشفة نظيفة لإزالة أي وسائط. ثم تزن 25 إلى 30 ملليغرام ، أي ما يعادل خمس أو ست قطع من الأنسجة ، لكل فحص جيد ووضعها في لوحة الفحص 48 بئرا المعدة مسبقا. قم بوزن قارب الوزن بعد إزالة الأنسجة وسجل وزن أي بقايا متبقية.
امسح قارب الوزن نظيفا بين العينات وأعد تمزيقه إذا لزم الأمر. استخدم قارب وزن جديد لكل منديل. بمجرد وزن جميع عينات الأنسجة ، ضع لوحة الفحص المكونة من 48 بئرا في حاضنة 37 درجة مئوية تحت 10٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة 15 دقيقة.
أداء جمع الوسائط في غطاء دخان معقمة. في الوقت صفر ، بعد إزالة الوسائط ، أضف 400 ميكرولتر من وسائط التحكم أو التحفيز لكل بئر وضع لوحة الفحص في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 10٪ ثاني أكسيد الكربون. لزراعة الأنسجة خارج الجسم الحي ، قم بإزالة الوسائط بعناية باستخدام ماصة وتجنب وضع الشفط.
في بعض الأحيان ساعة واحدة واثنتين وثلاث وأربع ساعات ، اجمع 200 ميكرولتر من الوسائط ، واستبدلها ب 200 ميكرولتر من وسائط التحكم أو التحفيز المناسبة ، وأعد لوحة الفحص إلى الحاضنة. قم بتخزين لوحة التجميع عند أربع درجات مئوية. ذوبان وخلط العينات.
قم بتسخين الكواشف إلى درجة حرارة الغرفة وقم بإذابة زجاجة واحدة من الكاشف الملون A باستخدام زجاجة واحدة من المذيب A وزجاجة واحدة من كاشف اللون B باستخدام زجاجة واحدة من المذيب B.بعد إنشاء منحنى قياسي للأحماض الدهنية الحرة أو FFA ، معايير الماصة والعينات في لوحة فحص 96 بئرا. حجم العينة الموصى به هو 10 ميكرولتر لكل بئر. أضف 150 ميكرولترا من الكاشف A إلى كل بئر واخلطها.
احتضان لوحة الفحص عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. اقرأ امتصاص اللوحة عند 550 نانومتر و 660 نانومتر وأشر إلى ذلك على أنه قراءة A.أضف 75 ميكرولترا من الكاشف B إلى كل بئر واخلطها. احتضان لوحة الفحص عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.
ثم بعد إزالة اللوحة من الحاضنة ، اقرأ امتصاص اللوحة مرة أخرى عند 550 و 660 نانومتر. ارجع إلى هذه القراءة على أنها قراءة B.أعد تكوين كاشف الجلسرين الحر ب 36 لترا من الماء عالي النقاء وتأقلمه مع درجة حرارة الغرفة. ذوبان وخلط العينات.
قم بإنشاء منحنى قياسي للجلسرين عن طريق عمل تخفيف تسلسلي بمقدار 7.2 أضعاف لمحلول الجلسرين القياسي وفراغ ماء. ماصة 25 ميكرولتر من كل معيار وعينات في لوحة فحص 96 بئرا. أضف 175 ميكرولتر من كاشف الجلسرين الحر إلى كل بئر واخلطه.
احتضان لوحة الفحص عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. بعد إزالة اللوحة من الحاضنة ، اقرأ امتصاص اللوحة عند 540 نانومتر. اتبع الخطوات الموضحة في النص لحساب معدلات تحلل الدهون في قيم مربع R المعنية.
ثم باستخدام معدلات إنتاج FFA والجلسرين لكل عينة كنقطة بيانات فردية ، قم بإجراء تحليل إحصائي ورسم القيم إذا تمت مقارنة معدلات تحلل الدهون المختلفة. في حالة مقارنة معدلات تحلل الدهون خارج الجسم الحي عبر الأنماط الجينية ، استخدم عينتين أو ثلاث عينات لكل كتكرارات تقنية واستخدم المتوسط لنقطة بيانات واحدة لكل بحيث يكون حجم العينة مساويا لعدد الحيوانات. ثم قم بإجراء التحليل الإحصائي مع البيانات.
كان إنتاج FFA والجلسرين في الخلايا preadipocytes المتمايزة في المختبر خطيا خلال الفحص لمدة أربع ساعات. كانت معدلات تحلل الدهون المحفزة أعلى بكثير من المعدلات القاعدية. في الخلايا المحفزة ، كانت النسبة المولية FFA إلى الجلسرين حوالي ثلاثة ، مما يشير إلى تحلل الدهون الثلاثية دون إعادة امتصاص أو احتفاظ كبير.
في الخلايا غير المحفزة ، كانت النسبة حوالي واحد ، مما يشير إلى مصدر غير محلل للدهون من الجلسرين. في الثقافات خارج الجسم الحي ، أظهرت قطع الأنسجة الأكبر حجما ذات مساحة سطح أقل إلى نسبة الحجم احتفاظا أعلى ب FFA ، مما أدى إلى انخفاض نسب FFA إلى الجلسرين المولي. في قطع الأنسجة 25 ملليغرام ، أثر احتباس FFA سلبا على معدلات تحلل الدهون.
كما أظهرت قطع الأنسجة الصغيرة جدا انخفاض معدلات تحلل الدهون. أدى تقليل BSA في الوسائط إلى تقليل إطلاق كل من FFA والجلسرين بشكل كبير. كان تراكم FFA في وسائط 5٪ BSA بعد تحفيز 24 ساعة خمسة مليمولار بينما كان تراكم وسائط BSA 0.5٪ 0.6 مللي مولار فقط.
وصلت مستويات FFA في الوسائط التي تم جمعها إلى منطقة الخطر البالغة 2.3 مليمولار في ثلاث ساعات. عدم وجود زيادة في وسائل الإعلام FFA والجلسرين في أربع ساعات اقترح تثبيط ردود الفعل. تسبب استبعاد النقطة الزمنية البالغة أربع ساعات في زيادة صغيرة ولكنها كبيرة في معدلات الإصدار.
كان معدل إطلاق FFA خطيا حتى بين النقاط الزمنية المعتادة. عند إزالة الوسائط من عينات تحلل الدهون خارج الجسم الحي ، من المهم التأكد من عدم إزالة قطع الأنسجة عن طريق الخطأ بواسطة الماصة. قد يكون من الضروري قياس محتوى البروتين أو الدهون في هذه العينات لتطبيع النتائج بشكل صحيح.
