تم دعم هذا العمل من قبل منحة المعهد الوطني للعيون R01 EY032056 إلى CC و R01 EY017724 إلى VMF ، وكذلك المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة بموجب المنحة رقم P20GM139760. تم دعم STI من قبل NIH-NIGMS T32-GM133395 كجزء من برنامج تدريب ما قبل الدكتوراه لواجهة الكيمياء والبيولوجيا ، وجائزة جامعة ديلاوير لعلماء الدراسات العليا.

إعداد وتصوير عدسة العين الفئران يتصاعد كامل

<ol>
	<li>Gokhin, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tmod1+and+CP49+synergize+to+control+the+fiber+cell+geometry,+transparency,+and+mechanical+stiffness+of+the+mouse+lens.">Tmod1 and CP49 synergize to control the fiber cell geometry, transparency, and mechanical stiffness of the mouse lens.</a> PLoS One. 7 (11), e48734 (2012).</li><li>Cheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+changes+in+eye+lens+biomechanics,+morphology,+refractive+index+and+transparency.">Age-related changes in eye lens biomechanics, morphology, refractive index and transparency.</a> Aging (Albany NY). 11 (24), 12497-12531 (2019).</li><li>Cheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tropomodulin+1+regulation+of+actin+is+required+for+the+formation+of+large+paddle+protrusions+between+mature+lens+fiber+cells.">Tropomodulin 1 regulation of actin is required for the formation of large paddle protrusions between mature lens fiber cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (10), 4084-4099 (2016).</li><li>Parreno, J., Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+mechanical+strain+on+mouse+eye+lens+capsule+and+cellular+microstructure.">The effects of mechanical strain on mouse eye lens capsule and cellular microstructure.</a> Mol Biol Cell. 29 (16), 1963-1974 (2018).</li><li>Sindhu Kumari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Aquaporin+0+in+lens+biomechanics.">Role of Aquaporin 0 in lens biomechanics.</a> Biochem Biophys Res Commun. 462 (4), 339-345 (2015).</li><li>Martin, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arvcf+dependent+adherens+junction+stability+is+required+to+prevent+age-related+cortical+cataracts.">Arvcf dependent adherens junction stability is required to prevent age-related cortical cataracts.</a> Front Cell Dev Biol. 10, 840129 (2022).</li><li>Danysh, B. P., Duncan, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lens+capsule.">The lens capsule.</a> Exp Eye Res. 88 (2), 151-164 (2009).</li><li>Mekonnen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lens+capsule+significantly+affects+the+viscoelastic+properties+of+the+lens+as+quantified+by+optical+coherence+elastography.">The lens capsule significantly affects the viscoelastic properties of the lens as quantified by optical coherence elastography.</a> Front Bioeng Biotechnol. 11, 1134086 (2023).</li><li>Fincham, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+function+of+the+lens+capsule+in+the+accommodation+of+the+eye.">The function of the lens capsule in the accommodation of the eye.</a> Trans Optical Society. 30 (3), 101 (1929).</li><li>Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lens+actin+filament+cytoskeleton:+Diverse+structures+for+complex+functions.">The lens actin filament cytoskeleton: Diverse structures for complex functions.</a> Exp Eye Res. 156, 58-71 (2017).</li><li>Bassnett, S., Sikic, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lens+growth+process.">The lens growth process.</a> Prog Retin Eye Res. 60, 181-200 (2017).</li><li>Sikic, H., Shi, Y., Lubura, S., Bassnett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+full+lifespan+model+of+vertebrate+lens+growth.">A full lifespan model of vertebrate lens growth.</a> R Soc Open Sci. 4 (1), 160695 (2017).</li><li>Cheng, C., Ansari, M. M., Cooper, J. A., Gong, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphA2+and+Src+regulate+equatorial+cell+morphogenesis+during+lens+development.">EphA2 and Src regulate equatorial cell morphogenesis during lens development.</a> Development. 140 (20), 4237-4245 (2013).</li><li>Sugiyama, Y., Akimoto, K., Robinson, M. L., Ohno, S., Quinlan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell+polarity+protein+aPKClambda+is+required+for+eye+lens+formation+and+growth.">A cell polarity protein aPKClambda is required for eye lens formation and growth.</a> Dev Biol. 336 (2), 246-256 (2009).</li><li>Zampighi, G. A., Eskandari, S., Kreman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+organization+of+the+mammalian+lens.">Epithelial organization of the mammalian lens.</a> Exp Eye Res. 71 (4), 415-435 (2000).</li><li>Lovicu, F. J., Robinson, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Development of the Ocular Lens. , (2011).</li><li>Kuszak, J. R., Zoltoski, R. K., Sivertson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibre+cell+organization+in+crystalline+lenses.">Fibre cell organization in crystalline lenses.</a> Exp Eye Res. 78 (3), 673-687 (2004).</li><li>Cvekl, A., Ashery-Padan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+and+molecular+mechanisms+of+vertebrate+lens+development.">The cellular and molecular mechanisms of vertebrate lens development.</a> Development. 141 (23), 4432-4447 (2014).</li><li>Vu, M. P., Cheng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+immunofluorescence+staining+of+bundles+and+single+fiber+cells+from+the+cortex+and+nucleus+of+the+eye+lens.">Preparation and immunofluorescence staining of bundles and single fiber cells from the cortex and nucleus of the eye lens.</a> J Vis Exp. (196), e65638 (2023).</li><li>Islam, S. T., Cheng, C., Parreno, J., Fowler, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonmuscle+myosin+IIA+regulates+the+precise+alignment+of+hexagonal+eye+lens+epithelial+cells+during+fiber+cell+formation+and+differentiation.">Nonmuscle myosin IIA regulates the precise alignment of hexagonal eye lens epithelial cells during fiber cell formation and differentiation.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (4), 20 (2023).</li><li>Patel, S. D., Aryal, S., Mennetti, L. P., Parreno, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+staining+of+lenses+for+visualization+of+lens+epithelial+cell+proteins.">Whole mount staining of lenses for visualization of lens epithelial cell proteins.</a> MethodsX. 8, 101376 (2021).</li><li>Parreno, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodologies+to+unlock+the+molecular+expression+and+cellular+structure+of+ocular+lens+epithelial+cells.">Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells.</a> Front Cell Dev Biol. 10, 983178 (2022).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+MYH9-related+disease:+mutations+in+nonmuscle+myosin+II-A.">Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A.</a> Blood. 119 (1), 238-250 (2012).</li><li>Cheng, C., Gokhin, D. S., Nowak, R. B., Fowler, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+application+of+glass+coverslips+to+assess+the+compressive+stiffness+of+the+mouse+lens:+Strain+and+morphometric+analyses.">Sequential application of glass coverslips to assess the compressive stiffness of the mouse lens: Strain and morphometric analyses.</a> J Vis Exp. (111), e53986 (2016).</li><li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact:+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin.">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nat Methods. 5 (7), 605-607 (2008).</li><li>Lukinavicius, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorogenic+probes+for+live-cell+imaging+of+the+cytoskeleton.">Fluorogenic probes for live-cell imaging of the cytoskeleton.</a> Nat Methods. 11 (7), 731-733 (2014).</li></ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

تتيح البروتوكولات الموصوفة تصورا عالي الدقة المكانية لهياكل وخلايا العدسات المحيطية في المناطق الأمامية والاستوائية للعدسة. في هذه الدراسة ، تم عرض طرق لتصور الهياكل الطرفية للعدسة باستخدام عدسات سليمة (حية أو ثابتة) حيث يتم الحفاظ على بنية عدسة 3D الشاملة. وبالإضافة إلى ذلك، قدمت طرق بسي...

عدسة العين هي نسيج مرن وشفاف يقع في المنطقة الأمامية من العين يعمل على تركيز الضوء بدقة على شبكية العين. يمكن أن تعزى قدرة العدسة على العمل ، جزئيا ، إلى بنيتها المعقدة وتنظيمها1،2،3،4،5،6. تحيط بالكبسولة أنسجة العدسة ، وهي غشاء قاعدي ضروري للحفاظ على بنية العدسة والخصائص الميكانيكية الحيوية7،8،9. العدسة نفسها خلوية بالكامل ، وتتكون من نوعين من الخلايا: الخلايا الظهارية والليفية. تتكون الطبقة الظهارية من طبقة أحادية من الخلايا المكعبة التي تغطي نصف الكرة الأمامي للعدسة10. طوال الحياة ، تتكاثر الخلايا الظهارية وتهاجر على طول كبسولة العدسة نحو خط استواء العدسة. الخلايا الظهارية الأمامية هادئة وحجرية مرصوفة بالحصى في المقطع العرضي ، وبالقرب من خط الاستواء للعدسة ، تتكاثر الخلايا الظهارية وتبدأ في الخضوع لعملية التمايز إلى خلايا ليفية جديدة11,12. تتحول الخلايا الطلائية الاستوائية من خلايا معبأة عشوائيا إلى صفوف خط الطول المنظمة مع خلايا سداسية الشكل. يتم الحفاظ على شكل الخلية السداسية على الجانب القاعدي من هذه الخلايا المتمايزة بينما ينقبض الجانب القمي ويثبت عند نقطة ارتكاز العدسة أو modiolus4،13،14،15. عندما تبدأ الخلايا الطلائية الاستوائية في الاستطالة إلى خلايا ليفية مكونة حديثا، تهاجر الأطراف القمية للخلايا على طول السطح القمي للخلايا الطلائية الأمامية باتجاه القطب الأمامي، بينما تتحرك الأطراف القاعدية على طول كبسولة العدسة في اتجاه القطب الخلفي. تتراكب الأجيال الجديدة من الخلايا الليفية مع الأجيال السابقة من الخلايا ، مما يخلق قذائف كروية من الألياف. أثناء عملية استطالة الخلايا ونضجها ، تغير الخلايا الليفية بشكل كبير مورفولوجيتها11،12،16. تشكل هذه الخلايا الليفية الجزء الأكبر من كتلة العدسة11،12،16،17،18.
الآليات الجزيئية التي تساهم في إنشاء الهياكل المجهرية المعقدة للعدسة ، ومورفولوجيا الخلية ، والتنظيم الخلوي الفريد ليست معروفة تماما. علاوة على ذلك ، فإن مساهمة كبسولة العدسة وبنية الخلية في وظيفة العدسة الكلية (الشفافية ، تغيير شكل العدسة) غير واضحة. ومع ذلك ، يتم توضيح هذه العلاقات باستخدام منهجية تصوير جديدة وتقييمات كمية للخصائص الهيكلية والخلويةللعدسة 2،4،19،20،21،22. تم تطوير بروتوكولات جديدة لتصوير العدسات الكاملة التي تسمح بتصور عالي الدقة المكانية لكبسولة العدسة والخلايا الظهارية وخلايا الألياف المحيطية. يتضمن ذلك منهجية لتحديد سمك الكبسولة ، وحجم الخلية ، وحجم نواة الخلية ودائريتها ، وترتيب صف الزوال ، وتعبئة الخلايا الليفية ، وعرض خلايا الألياف. تسمح طرق التصور والقياس الكمي للصور هذه بالفحص المورفومتري المتعمق ولها مزايا على طرق التصور الأخرى (تصوير الحوامل المسطحة أو أقسام الأنسجة) من خلال الحفاظ على بنية الأنسجة 3D الشاملة. وقد سمحت هذه الأساليب باختبار فرضيات جديدة وستمكن من التقدم المستمر في فهم تطور نمط خلية العدسة ووظيفتها.
بالنسبة للتجارب التالية ، نستخدم فئران من النوع البري و Rosa26-tdTomato جنبا إلى جنب dimer-Tomato (B6.129 (Cg) -Gt (ROSA) (tdTomato) 23 (مختبرات جاكسون) في خلفية C57BL / 6J بين سن 6 و 10 أسابيع ، من كلا الجنسين. تسمح فئران tdTomato بتصور أغشية البلازما الخلوية في العدسات الحية عن طريق التعبير عن بروتين tdTomato المنصهر في الأحماض الأمينية N-terminal 8 لبروتين MARCKS المتحور الذي يستهدف غشاء البلازما عبر myristylation N-terminal ومواقع السيستين بالميتويل الداخلية23. نستخدم أيضا الفئران NMIIAE1841K / E1841K 24 التي تم الحصول عليها في الأصل من الدكتور روبرت أدلشتاين (المعهد الوطني للقلب والرئة والدم ، المعاهد الوطنية للصحة ، بيثيسدا ، دكتوراه في الطب). كما هو موضح سابقا20 ، الفئران NMIIAE1841K / E1841K في خلفية FvBN / 129SvEv / C57Bl6 التي فقدت بروتين خيوط وسيطة من الخرز CP49 (يحافظ على مورفولوجيا خلايا الألياف الناضجة والميكانيكا الحيوية للعدسة الكاملة) ، يتم تهجينها مع الفئران من النوع البري C57BL6 / J. فحصنا النسل بحثا عن وجود أليل CP49 من النوع البري. 
تم إجراء التصوير البؤري على مجهر مضان متحد البؤر للمسح بالليزر مع تكبير 20x (NA = 0.8 ، مسافة العمل = 0.55 مم ، تكبير 1x) ، 40x (NA = 1.3 هدف زيت ، مسافة العمل = 0.2 مم ، تكبير 1x) ، أو تكبير 63x (NA = 1.4 هدف زيت ، مسافة العمل = 0.19 مم ، تكبير 1x). تم الحصول على جميع الصور باستخدام حجم الثقب ، وهو محدد لسمك المقطع البصري ، إلى 1 وحدة Airy (يتم ذكر السماكات البصرية الناتجة في وسائل إيضاح الشكل). تمت معالجة الصور على برنامج Zen. تم تصدير الصور إلى تنسيق .tif ثم تم استيرادها إلى برنامج FIJI ImageJ (imageJ.net).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3 mm Biopsy Punch</td>
			<td>Acuderm Inc</td>
			<td>NC9084780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Apex BioResearch Products</td>
			<td>20-102GP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycotic/Antibiotic</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SV30079.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (Fraction V)</td>
			<td>Prometheus</td>
			<td>25-529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate task wipes</td>
			<td>Kimwipe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottomed dish (Fluorodish)</td>
			<td>World Precision International</td>
			<td>FD35-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht 33342</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>40046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanning confocal Microscope 880</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatTek Imaging Dish</td>
			<td>MatTek Life Sciences</td>
			<td>P35G-1.5-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>100503-917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>GenClone</td>
			<td>25-507B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red-free medium 199</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11043023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine-Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>00027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11332481001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WGA-640</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>CF 640R</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole mount imaging to visualize and quantify peripheral lens structure, cell morphology, and organization

عدسة العين عبارة عن نسيج مرن شفاف يغير شكله لتركيز الضوء من مسافات مختلفة على شبكية العين. بصرف النظر عن الغشاء القاعدي المحيط بالعضو، والذي يسمى الكبسولة، فإن العدسة خلوية بالكامل وتتكون من طبقة أحادية من الخلايا الطلائية في نصف الكرة الأمامي وكتلة كبيرة من خلايا ألياف العدسة. طوال الحياة ، تتكاثر الخلايا الطلائية في المنطقة الإنباتية عند خط استواء العدسة ، وتهاجر الخلايا الطلائية الاستوائية وتستطيل وتتمايز إلى خلايا ليفية مكونة حديثا. تغير الخلايا الظهارية الاستوائية بشكل كبير التشكل من خلايا معبأة عشوائيا على شكل حجر مرصوف بالحصى إلى خلايا سداسية الشكل تشكل صفوفا زوالية. تحتفظ خلايا ألياف العدسة المشكلة حديثا بشكل الخلية السداسية وتستطيل نحو القطبين الأمامي والخلفي ، وتشكل غلافا جديدا من الخلايا المتراكبة على الأجيال السابقة من الألياف. لا يعرف سوى القليل عن الآليات التي تدفع التشكل الملحوظ للخلايا الظهارية للعدسة إلى خلايا الألياف. لفهم بنية العدسة وتطورها ووظيفتها بشكل أفضل ، تم تطوير بروتوكولات تصوير جديدة لتصوير الهياكل الطرفية باستخدام حوامل كاملة من عدسات العين. هنا ، يتم عرض طرق تحديد سمك الكبسولة ، ومنطقة الخلية الظهارية ، والمنطقة النووية للخلية وشكلها ، وترتيب خلية الصف الزوالي والتعبئة ، وعرض الخلايا الليفية. هذه القياسات ضرورية لتوضيح التغيرات الخلوية التي تحدث أثناء نمو العدسة مدى الحياة وفهم التغييرات التي تحدث مع تقدم العمر أو علم الأمراض.

The ocular lens is a flexible, transparent tissue situated at the anterior region of the eye that functions to fine-focus light onto the retina. The ability of the lens to function can be attributed, in part, to its intricate architecture and organization1,2,3,4,5,6. Surrounding the lens tissue is the capsule, a basement membrane essential for maintaining lens structure and biomechanical properties7,8,9. The lens itself is entirely cellular, consisting of two cell types: epithelial and fiber cells. The epithelial layer consists of a monolayer of cuboidal cells that cover the anterior hemisphere of the lens10. Throughout life, the epithelial cells proliferate and migrate along the lens capsule toward the lens equator. Anterior epithelial cells are quiescent and cobble-stone in cross-section, and near the lens equator, epithelial cells proliferate and start to undergo the differentiation process into new fiber cells11,12. Equatorial epithelial cells transform from randomly packed cells into organized meridional rows with hexagon-shaped cells. Hexagonal cell shape is maintained on the basal side of these differentiating cells while the apical side constricts and anchors at the lens fulcrum or modiolus4,13,14,15. As the equatorial epithelial cells start to elongate into newly formed fiber cells, the apical tips of the cells migrate along the apical surface of anterior epithelial cells toward the anterior pole while the basal tips move along the lens capsule toward the posterior pole. New generations of fiber cells overlay previous generations of cells, creating spherical shells of fibers. During the cell elongation and maturation process, fiber cells substantially alter their morphology11,12,16. These fiber cells form the bulk of the lens mass11,12,16,17,18.
The molecular mechanisms that contribute to establishing intricate lens microstructures, cell morphology, and unique cellular organization are not entirely known. Moreover, the contribution of the lens capsule and cell structure to overall lens function (transparency, lens shape change) is unclear. However, these relationships are being elucidated using new imaging methodology and quantitative assessments of lens structural and cellular features2,4,19,20,21,22. New protocols to image whole lenses that allow for high spatial resolution visualization of the lens capsule, epithelial cells, and peripheral fiber cells have been developed. This includes methodology to quantify capsule thickness, cell size, cell nucleus size and circularity, meridional row order, fiber cell packing, and fiber cell widths. These visualization and image quantification methods allow in-depth morphometric examination and have advantages over other visualization methods (imaging of flat mounts or tissue sections) by preserving overall 3D tissue structure. These methods have permitted for the testing of novel hypotheses and will enable continued advancement in understanding of lens cell pattern development and function.
For the following experiments, we use wild-type and Rosa26-tdTomato mice tandem dimer-Tomato (B6.129(Cg)-Gt(ROSA) (tdTomato)23 (Jackson Laboratories) in the C57BL/6J background between the ages of 6 and 10 weeks, of both sexes. The tdTomato mice allow for visualization of cellular plasma membranes in live lenses via expression of tdTomato protein fused to the N-terminal 8 amino acids of a mutated MARCKS protein that targets the plasma membrane via N-terminal myristylation and internal cysteine-palmitoylation sites23. We also use NMIIAE1841K/E1841K mice24 obtained originally from Dr. Robert Adelstein (National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD). As described previously20, NMIIAE1841K/E1841K&#160;mice in FvBN/129SvEv/C57Bl6 background that has loss of CP49 beaded intermediate filament protein (maintains mature fiber cell morphology and whole lens biomechanics), are backcrossed with C57BL6/J wild-type mice. We screened the offspring for the presence of the wild-type CP49 allele. 
Confocal imaging was performed on a laser-scanning confocal fluorescence microscope with a 20x (NA = 0.8, working distance = 0.55mm, 1x zoom), a 40x (NA = 1.3 oil objective, working distance = 0.2mm, 1x zoom), or a 63x (NA = 1.4 oil objective, working distance = 0.19mm, 1x zoom) magnification. All images were acquired using a pinhole size, which is a determinant of optical section thickness, to 1 Airy Unit (the resultant optical thicknesses are stated in figure legends). Images were processed on Zen Software. Images were exported to .tif format and then imported into FIJI ImageJ Software (imageJ.net).

تسليط الضوء على المؤلف: الفحص المورفومتري المتعمق والقياس الكمي لهيكل العدسة الأصلي باستخدام التصوير الكامل 

تصوير كامل التركيب لتصور وقياس بنية العدسة الطرفية ومورفولوجيا الخلية وتنظيمها

We aim to determine the molecular mechanisms that establishes the intricate lens architecture and how this established architecture regulates lens function in transparency and lens shape change. To advance the research in our field, we use new imaging methods that allows us to visualize the lens features with high spatial resolution, and this lets us perform quantitative image analysis of lens structures and cellular features. Whole mount imaging is advantageous over visualization of tissue sections or flat mounting procedures as it enables preservation of the overall 3D tissue structure.This allows us to perform in-depth morpho metric examination and quantification on native lens structure. The lens is an integrated biological tissue with specialized functions that rely upon localization and depth dependent geometries of the cells and their associated structures. Using the imaging protocols and quantification methods demonstrated, will allow for a greater understanding of how lens structures and the complex organization of the lens are established.

كبسولة العدسة الأمامية ومنطقة الخلايا الظهارية والمنطقة النووية لتحليل سمك كبسولة العدسة ، قمنا بتلوين كبسولات العدسات ، إما في العدسات الحية أو الثابتة ، باستخدام WGA. حددنا الخلايا الظهارية للعدسة عن طريق تسمية الأغشية باستخدام tdTomato في العدسات الحية (الشكل 2 أ...

Watch this Scientific Journal Video about In-Depth Morphometric Examination and Quantification of Native Lens Structure Using Whole Mount Imaging at JoVE.com

تصف البروتوكولات الحالية تصويرا جديدا كاملا لتصور الهياكل المحيطية في عدسة العين مع طرق لتحديد كمية الصورة. يمكن استخدام هذه البروتوكولات في الدراسات لفهم العلاقة بين الهياكل المجهرية للعدسة بشكل أفضل وتطوير / وظيفة العدسة.

The ocular lens is a transparent flexible tissue that alters its shape to focus light from different distances onto the retina. Aside from a basement ...

نهدف إلى تحديد الآليات الجزيئية التي تحدد بنية العدسة المعقدة وكيف تنظم هذه البنية الراسخة وظيفة العدسة بشفافية وتغيير شكل العدسة. لتعزيز البحث في مجالنا ، نستخدم طرق تصوير جديدة تسمح لنا بتصور ميزات العدسة بدقة مكانية عالية ، وهذا يتيح لنا إجراء تحليل كمي للصور لهياكل العدسة والميزات الخلوية. يعد التصوير الكامل مفيدا على تصور أقسام الأنسجة أو إجراءات التركيب المسطحة لأنه يتيح الحفاظ على بنية الأنسجة 3D الشاملة.هذا يسمح لنا بإجراء فحص مورفو متري متعمق والقياس الكمي على بنية العدسة الأصلية. العدسة عبارة عن نسيج بيولوجي متكامل له وظائف متخصصة تعتمد على التوطين والهندسة المعتمدة على العمق للخلايا والهياكل المرتبطة بها. سيسمح استخدام بروتوكولات التصوير وطرق القياس الكمي الموضحة بفهم أكبر لكيفية إنشاء هياكل العدسة والتنظيم المعقد للعدسة.

whole-mount-imaging-to-visualize-quantify-peripheral-lens-structure

Research

JoVE Journal

Biology

Whole Mount Imaging to Visualize and Quantify Peripheral Lens Structure, Cell Morphology, and Organization

720 Views.  University of Delaware. نهدف إلى تحديد الآليات الجزيئية التي تحدد بنية العدسة المعقدة وكيف تنظم هذه البنية الراسخة وظيفة العدسة بشفافية وتغيير شكل العدسة. لتعزيز البحث في مجالنا ، نستخدم طرق تصوير جديدة تسمح لنا بتصور ميزات العدسة بدقة مكانية عالية ، وهذا يتيح لنا إجراء تحليل كمي للصور لهياكل ال?...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: الفحص المورفومتري المتعمق والقياس الكمي لهيكل العدسة الأصلي باستخدام التصوير الكامل 

The ocular lens is a transparent flexible tissue that alters its shape to focus light from different distances onto the retina. Aside from a basement membrane surrounding the organ, called the capsule, the lens is entirely cellular consisting of a monolayer of epithelial cells on the anterior hemisphere and a bulk mass of lens fiber cells. Throughout life, epithelial cells proliferate in the germinative zone at the lens equator, and equatorial epithelial cells migrate, elongate, and differentiate into newly formed fiber cells. Equatorial epithelial cells substantially alter morphology from randomly packed cobble-stone-shaped cells into aligned hexagon-shaped cells forming meridional rows. Newly formed lens fiber cells retain the hexagonal cell shape and elongate toward the anterior and posterior poles, forming a new shell of cells that are overlaid onto previous generations of fibers. Little is known about the mechanisms that drive the remarkable morphogenesis of lens epithelial cells to fiber cells. To better understand lens structure, development, and function, new imaging protocols have been developed to image peripheral structures using whole mounts of ocular lenses. Here, methods to quantify capsule thickness, epithelial cell area, cell nuclear area and shape, meridional row cell order and packing, and fiber cell widths are shown. These measurements are essential for elucidating the cellular changes that occur during lifelong lens growth and understanding the changes that occur with age or pathology.

The present protocols describe novel whole mount imaging for the visualization of peripheral structures in the ocular lens with methods for image quantification. These protocols can be used in studies to better understand the relationship between lens microscale structures and lens development/function.