Bu çalışma, CC'ye EY032056 Ulusal Göz Enstitüsü Hibe R01 ve VMF'ye EY017724 R01'in yanı sıra P20GM139760 numaralı hibe numarası altında Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü tarafından desteklenmiştir. S.T.I, Kimya-Biyoloji Arayüzü doktora öncesi eğitim programının bir parçası olarak NIH-NIGMS T32-GM133395 ve Delaware Üniversitesi Lisansüstü Akademisyenler Ödülü tarafından desteklenmiştir.

Murin Oküler Lens Bütün Montajlarının Hazırlanması ve Görüntülenmesi

<ol>
	<li>Gokhin, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tmod1+and+CP49+synergize+to+control+the+fiber+cell+geometry,+transparency,+and+mechanical+stiffness+of+the+mouse+lens.">Tmod1 and CP49 synergize to control the fiber cell geometry, transparency, and mechanical stiffness of the mouse lens.</a> PLoS One. 7 (11), e48734 (2012).</li><li>Cheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+changes+in+eye+lens+biomechanics,+morphology,+refractive+index+and+transparency.">Age-related changes in eye lens biomechanics, morphology, refractive index and transparency.</a> Aging (Albany NY). 11 (24), 12497-12531 (2019).</li><li>Cheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tropomodulin+1+regulation+of+actin+is+required+for+the+formation+of+large+paddle+protrusions+between+mature+lens+fiber+cells.">Tropomodulin 1 regulation of actin is required for the formation of large paddle protrusions between mature lens fiber cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (10), 4084-4099 (2016).</li><li>Parreno, J., Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+mechanical+strain+on+mouse+eye+lens+capsule+and+cellular+microstructure.">The effects of mechanical strain on mouse eye lens capsule and cellular microstructure.</a> Mol Biol Cell. 29 (16), 1963-1974 (2018).</li><li>Sindhu Kumari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Aquaporin+0+in+lens+biomechanics.">Role of Aquaporin 0 in lens biomechanics.</a> Biochem Biophys Res Commun. 462 (4), 339-345 (2015).</li><li>Martin, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arvcf+dependent+adherens+junction+stability+is+required+to+prevent+age-related+cortical+cataracts.">Arvcf dependent adherens junction stability is required to prevent age-related cortical cataracts.</a> Front Cell Dev Biol. 10, 840129 (2022).</li><li>Danysh, B. P., Duncan, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lens+capsule.">The lens capsule.</a> Exp Eye Res. 88 (2), 151-164 (2009).</li><li>Mekonnen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lens+capsule+significantly+affects+the+viscoelastic+properties+of+the+lens+as+quantified+by+optical+coherence+elastography.">The lens capsule significantly affects the viscoelastic properties of the lens as quantified by optical coherence elastography.</a> Front Bioeng Biotechnol. 11, 1134086 (2023).</li><li>Fincham, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+function+of+the+lens+capsule+in+the+accommodation+of+the+eye.">The function of the lens capsule in the accommodation of the eye.</a> Trans Optical Society. 30 (3), 101 (1929).</li><li>Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lens+actin+filament+cytoskeleton:+Diverse+structures+for+complex+functions.">The lens actin filament cytoskeleton: Diverse structures for complex functions.</a> Exp Eye Res. 156, 58-71 (2017).</li><li>Bassnett, S., Sikic, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lens+growth+process.">The lens growth process.</a> Prog Retin Eye Res. 60, 181-200 (2017).</li><li>Sikic, H., Shi, Y., Lubura, S., Bassnett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+full+lifespan+model+of+vertebrate+lens+growth.">A full lifespan model of vertebrate lens growth.</a> R Soc Open Sci. 4 (1), 160695 (2017).</li><li>Cheng, C., Ansari, M. M., Cooper, J. A., Gong, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphA2+and+Src+regulate+equatorial+cell+morphogenesis+during+lens+development.">EphA2 and Src regulate equatorial cell morphogenesis during lens development.</a> Development. 140 (20), 4237-4245 (2013).</li><li>Sugiyama, Y., Akimoto, K., Robinson, M. L., Ohno, S., Quinlan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell+polarity+protein+aPKClambda+is+required+for+eye+lens+formation+and+growth.">A cell polarity protein aPKClambda is required for eye lens formation and growth.</a> Dev Biol. 336 (2), 246-256 (2009).</li><li>Zampighi, G. A., Eskandari, S., Kreman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+organization+of+the+mammalian+lens.">Epithelial organization of the mammalian lens.</a> Exp Eye Res. 71 (4), 415-435 (2000).</li><li>Lovicu, F. J., Robinson, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Development of the Ocular Lens. , (2011).</li><li>Kuszak, J. R., Zoltoski, R. K., Sivertson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibre+cell+organization+in+crystalline+lenses.">Fibre cell organization in crystalline lenses.</a> Exp Eye Res. 78 (3), 673-687 (2004).</li><li>Cvekl, A., Ashery-Padan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+and+molecular+mechanisms+of+vertebrate+lens+development.">The cellular and molecular mechanisms of vertebrate lens development.</a> Development. 141 (23), 4432-4447 (2014).</li><li>Vu, M. P., Cheng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+immunofluorescence+staining+of+bundles+and+single+fiber+cells+from+the+cortex+and+nucleus+of+the+eye+lens.">Preparation and immunofluorescence staining of bundles and single fiber cells from the cortex and nucleus of the eye lens.</a> J Vis Exp. (196), e65638 (2023).</li><li>Islam, S. T., Cheng, C., Parreno, J., Fowler, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonmuscle+myosin+IIA+regulates+the+precise+alignment+of+hexagonal+eye+lens+epithelial+cells+during+fiber+cell+formation+and+differentiation.">Nonmuscle myosin IIA regulates the precise alignment of hexagonal eye lens epithelial cells during fiber cell formation and differentiation.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (4), 20 (2023).</li><li>Patel, S. D., Aryal, S., Mennetti, L. P., Parreno, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+staining+of+lenses+for+visualization+of+lens+epithelial+cell+proteins.">Whole mount staining of lenses for visualization of lens epithelial cell proteins.</a> MethodsX. 8, 101376 (2021).</li><li>Parreno, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodologies+to+unlock+the+molecular+expression+and+cellular+structure+of+ocular+lens+epithelial+cells.">Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells.</a> Front Cell Dev Biol. 10, 983178 (2022).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+MYH9-related+disease:+mutations+in+nonmuscle+myosin+II-A.">Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A.</a> Blood. 119 (1), 238-250 (2012).</li><li>Cheng, C., Gokhin, D. S., Nowak, R. B., Fowler, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+application+of+glass+coverslips+to+assess+the+compressive+stiffness+of+the+mouse+lens:+Strain+and+morphometric+analyses.">Sequential application of glass coverslips to assess the compressive stiffness of the mouse lens: Strain and morphometric analyses.</a> J Vis Exp. (111), e53986 (2016).</li><li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact:+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin.">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nat Methods. 5 (7), 605-607 (2008).</li><li>Lukinavicius, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorogenic+probes+for+live-cell+imaging+of+the+cytoskeleton.">Fluorogenic probes for live-cell imaging of the cytoskeleton.</a> Nat Methods. 11 (7), 731-733 (2014).</li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Açıklanan protokoller, lensin ön ve ekvator bölgelerindeki periferik lens yapılarının ve hücrelerinin yüksek uzamsal çözünürlüklü görselleştirilmesini sağlar. Bu çalışmada, genel 3D lens mimarisinin korunduğu sağlam (canlı veya sabit) lensler kullanılarak lens çevre yapılarının görüntülenmesine yönelik yöntemler gösterilmiştir. Ek olarak, halka açık FIJI ImageJ yazılımı kullanılarak morfometrik kantitatif analiz için basit yöntemler sağlanmıştır. Tüm montaj görselleştirm...

Oküler lens, gözün ön bölgesinde yer alan ve ışığı retinaya ince odaklama işlevi gören esnek, şeffaf bir dokudur. Lensin işlev görme yeteneği, kısmen karmaşık mimarisine ve organizasyonunabağlanabilir 1,2,3,4,5,6. Lens dokusunu çevreleyen, lens yapısını ve biyomekanik özelliklerini korumak için gerekli olan bir bazal membranolan kapsüldür 7,8,9. Lensin kendisi tamamen hücreseldir ve iki hücre tipinden oluşur: epitelyal ve fiber hücreler. Epitel tabakası, lensin10 ön hemisferini kaplayan tek bir küboidal hücre tabakasından oluşur. Yaşam boyunca, epitel hücreleri çoğalır ve lens kapsülü boyunca lens ekvatoruna doğru göç eder. Anterior epitel hücreleri enine kesitte hareketsiz ve parke taşıdır ve lens ekvatorunun yakınında epitel hücreleri çoğalır ve yeni lif hücrelerine farklılaşma sürecinden geçmeye başlar11,12. Ekvator epitel hücreleri, rastgele paketlenmiş hücrelerden altıgen şekilli hücrelerle organize meridyen sıralarına dönüşür. Altıgen hücre şekli, bu farklılaşan hücrelerin bazal tarafında korunurken, apikal taraf lens dayanak noktasında veya modiolus 4,13,14,15'te daralır ve sabitlenir. Ekvatoral epitel hücreleri yeni oluşan lif hücrelerine uzamaya başladığında, hücrelerin apikal uçları ön epitel hücrelerinin apikal yüzeyi boyunca ön kutba doğru hareket ederken, bazal uçlar lens kapsülü boyunca arka kutba doğru hareket eder. Yeni nesil fiber hücreler, önceki nesil hücrelerin üzerini kaplayarak küresel lif kabukları oluşturur. Hücre uzaması ve olgunlaşma süreci sırasında, lif hücreleri morfolojilerini önemli ölçüde değiştirir 11,12,16. Bu lif hücreleri, lens kütlesinin 11,12,16,17,18 kütlesini oluşturur.
Karmaşık lens mikro yapılarının, hücre morfolojisinin ve benzersiz hücresel organizasyonun kurulmasına katkıda bulunan moleküler mekanizmalar tam olarak bilinmemektedir. Ayrıca, lens kapsülünün ve hücre yapısının genel lens fonksiyonuna (saydamlık, lens şekli değişikliği) katkısı belirsizdir. Bununla birlikte, bu ilişkiler yeni görüntüleme metodolojisi ve lens yapısal ve hücresel özelliklerinin kantitatif değerlendirmeleri kullanılarak aydınlatılmaktadır2,4,19,20,21,22. Lens kapsülünün, epitel hücrelerinin ve periferik fiber hücrelerinin yüksek uzamsal çözünürlükte görüntülenmesine izin veren tüm lensleri görüntülemek için yeni protokoller geliştirilmiştir. Bu, kapsül kalınlığını, hücre boyutunu, hücre çekirdeği boyutunu ve daireselliğini, meridyen sıra sırasını, fiber hücre paketlemesini ve fiber hücre genişliklerini ölçmek için metodolojiyi içerir. Bu görselleştirme ve görüntü niceleme yöntemleri, derinlemesine morfometrik incelemeye izin verir ve genel 3D doku yapısını koruyarak diğer görselleştirme yöntemlerine (düz bağlantıların veya doku kesitlerinin görüntülenmesi) göre avantajlara sahiptir. Bu yöntemler, yeni hipotezlerin test edilmesine izin vermiştir ve lens hücresi paterni gelişimi ve işlevinin anlaşılmasında sürekli ilerlemeyi sağlayacaktır.
Aşağıdaki deneyler için, her iki cinsiyetten 6 ila 10 haftalık yaşlar arasında C57BL/6J arka planında vahşi tip ve Rosa26-tdDomates fareleri tandem dimer-Domates (B6.129(Cg)-Gt(ROSA) (tdTomato)23 (Jackson Laboratories) kullanıyoruz. tdTomato fareleri, N-terminal miristilasyon ve iç sistein-palmitoilasyon bölgeleri23 yoluyla plazma zarını hedef alan mutasyona uğramış bir MARCKS proteininin N-terminal 8 amino asitlerine kaynaşmış tdTomato proteininin ekspresyonu yoluyla canlı lenslerde hücresel plazma zarlarının görselleştirilmesine izin verir. Ayrıca orijinal olarak Dr. Robert Adelstein'dan (Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri, Bethesda, MD) elde edilen NMIIAE1841K / E1841K fareleri24 kullanıyoruz. Daha önce açıklandığı gibi, CP49 boncuklu ara filament proteini kaybına sahip (olgun lif hücresi morfolojisini ve tüm lens biyomekaniğini korur) FvBN/129SvEv/C57Bl6 arka planındaki NMIIAE1841K/E1841K fareleri, C57BL6/J vahşi tip farelerle geri çaprazlanır. Yavruları vahşi tip CP49 alelinin varlığı açısından taradık. 
Konfokal görüntüleme, 20x (NA = 0.8, çalışma mesafesi = 0.55mm, 1x yakınlaştırma), 40x (NA = 1.3 yağ objektifi, çalışma mesafesi = 0.2mm, 1x yakınlaştırma) veya 63x (NA = 1.4 yağ objektifi, çalışma mesafesi = 0.19mm, 1x yakınlaştırma) büyütme ile lazer taramalı konfokal floresan mikroskobu üzerinde gerçekleştirildi. Tüm görüntüler, optik kesit kalınlığının belirleyicisi olan iğne deliği boyutu kullanılarak 1 Airy Unit'e kadar elde edilmiştir (ortaya çıkan optik kalınlıklar şekil açıklamalarında belirtilmiştir). Görüntüler Zen Software'de işlendi. Görüntüler .tif formatta dışa aktarıldı ve ardından FIJI ImageJ Yazılımına (imageJ.net) aktarıldı.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3 mm Biopsy Punch</td>
			<td>Acuderm Inc</td>
			<td>NC9084780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Apex BioResearch Products</td>
			<td>20-102GP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycotic/Antibiotic</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SV30079.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (Fraction V)</td>
			<td>Prometheus</td>
			<td>25-529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate task wipes</td>
			<td>Kimwipe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottomed dish (Fluorodish)</td>
			<td>World Precision International</td>
			<td>FD35-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht 33342</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>40046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanning confocal Microscope 880</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatTek Imaging Dish</td>
			<td>MatTek Life Sciences</td>
			<td>P35G-1.5-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>100503-917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>GenClone</td>
			<td>25-507B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red-free medium 199</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11043023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine-Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>00027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11332481001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WGA-640</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>CF 640R</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole mount imaging to visualize and quantify peripheral lens structure, cell morphology, and organization

Oküler lens, ışığı farklı mesafelerden retinaya odaklamak için şeklini değiştiren şeffaf esnek bir dokudur. Kapsül adı verilen organı çevreleyen bir bazal zarın yanı sıra, lens, ön hemisferde tek katmanlı bir epitel hücresi tabakası ve bir yığın lens lifi hücresi kütlesinden oluşan tamamen hücreseldir. Yaşam boyunca, epitel hücreleri lens ekvatorundaki çimlenme bölgesinde çoğalır ve ekvatoral epitel hücreleri göç eder, uzar ve yeni oluşan lif hücrelerine farklılaşır. Ekvatoral epitel hücreleri, rastgele paketlenmiş parke taşı şeklindeki hücrelerden morfolojiyi, meridyen sıraları oluşturan hizalanmış altıgen şekilli hücrelere büyük ölçüde değiştirir. Yeni oluşan mercek lifi hücreleri, altıgen hücre şeklini korur ve ön ve arka kutuplara doğru uzar, böylece önceki nesil liflerin üzerine binen yeni bir hücre kabuğu oluşturur. Lens epitel hücrelerinin lif hücrelerine dikkat çekici morfogenezini yönlendiren mekanizmalar hakkında çok az şey bilinmektedir. Lens yapısını, gelişimini ve işlevini daha iyi anlamak için, tüm oküler lens yuvalarını kullanarak periferik yapıları görüntülemek için yeni görüntüleme protokolleri geliştirilmiştir. Burada, kapsül kalınlığını, epitel hücre alanını, hücre nükleer alanını ve şeklini, meridyen sıra hücre sırasını ve paketlemesini ve lif hücre genişliklerini ölçme yöntemleri gösterilmektedir. Bu ölçümler, yaşam boyu lens büyümesi sırasında meydana gelen hücresel değişiklikleri aydınlatmak ve yaş veya patoloji ile meydana gelen değişiklikleri anlamak için gereklidir.

The ocular lens is a flexible, transparent tissue situated at the anterior region of the eye that functions to fine-focus light onto the retina. The ability of the lens to function can be attributed, in part, to its intricate architecture and organization1,2,3,4,5,6. Surrounding the lens tissue is the capsule, a basement membrane essential for maintaining lens structure and biomechanical properties7,8,9. The lens itself is entirely cellular, consisting of two cell types: epithelial and fiber cells. The epithelial layer consists of a monolayer of cuboidal cells that cover the anterior hemisphere of the lens10. Throughout life, the epithelial cells proliferate and migrate along the lens capsule toward the lens equator. Anterior epithelial cells are quiescent and cobble-stone in cross-section, and near the lens equator, epithelial cells proliferate and start to undergo the differentiation process into new fiber cells11,12. Equatorial epithelial cells transform from randomly packed cells into organized meridional rows with hexagon-shaped cells. Hexagonal cell shape is maintained on the basal side of these differentiating cells while the apical side constricts and anchors at the lens fulcrum or modiolus4,13,14,15. As the equatorial epithelial cells start to elongate into newly formed fiber cells, the apical tips of the cells migrate along the apical surface of anterior epithelial cells toward the anterior pole while the basal tips move along the lens capsule toward the posterior pole. New generations of fiber cells overlay previous generations of cells, creating spherical shells of fibers. During the cell elongation and maturation process, fiber cells substantially alter their morphology11,12,16. These fiber cells form the bulk of the lens mass11,12,16,17,18.
The molecular mechanisms that contribute to establishing intricate lens microstructures, cell morphology, and unique cellular organization are not entirely known. Moreover, the contribution of the lens capsule and cell structure to overall lens function (transparency, lens shape change) is unclear. However, these relationships are being elucidated using new imaging methodology and quantitative assessments of lens structural and cellular features2,4,19,20,21,22. New protocols to image whole lenses that allow for high spatial resolution visualization of the lens capsule, epithelial cells, and peripheral fiber cells have been developed. This includes methodology to quantify capsule thickness, cell size, cell nucleus size and circularity, meridional row order, fiber cell packing, and fiber cell widths. These visualization and image quantification methods allow in-depth morphometric examination and have advantages over other visualization methods (imaging of flat mounts or tissue sections) by preserving overall 3D tissue structure. These methods have permitted for the testing of novel hypotheses and will enable continued advancement in understanding of lens cell pattern development and function.
For the following experiments, we use wild-type and Rosa26-tdTomato mice tandem dimer-Tomato (B6.129(Cg)-Gt(ROSA) (tdTomato)23 (Jackson Laboratories) in the C57BL/6J background between the ages of 6 and 10 weeks, of both sexes. The tdTomato mice allow for visualization of cellular plasma membranes in live lenses via expression of tdTomato protein fused to the N-terminal 8 amino acids of a mutated MARCKS protein that targets the plasma membrane via N-terminal myristylation and internal cysteine-palmitoylation sites23. We also use NMIIAE1841K/E1841K mice24 obtained originally from Dr. Robert Adelstein (National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD). As described previously20, NMIIAE1841K/E1841K&#160;mice in FvBN/129SvEv/C57Bl6 background that has loss of CP49 beaded intermediate filament protein (maintains mature fiber cell morphology and whole lens biomechanics), are backcrossed with C57BL6/J wild-type mice. We screened the offspring for the presence of the wild-type CP49 allele. 
Confocal imaging was performed on a laser-scanning confocal fluorescence microscope with a 20x (NA = 0.8, working distance = 0.55mm, 1x zoom), a 40x (NA = 1.3 oil objective, working distance = 0.2mm, 1x zoom), or a 63x (NA = 1.4 oil objective, working distance = 0.19mm, 1x zoom) magnification. All images were acquired using a pinhole size, which is a determinant of optical section thickness, to 1 Airy Unit (the resultant optical thicknesses are stated in figure legends). Images were processed on Zen Software. Images were exported to .tif format and then imported into FIJI ImageJ Software (imageJ.net).

Yazar Spotlight: Tam Montajlı Görüntüleme Kullanılarak Doğal Lens Yapısının Derinlemesine Morfometrik İncelemesi ve Miktar Tayini 

Periferik lens yapısını, hücre morfolojisini ve organizasyonunu görselleştirmek ve ölçmek için tam montajlı görüntüleme

Ön lens kapsülü, epitel hücre alanı ve nükleer alan Lens kapsülü kalınlığını analiz etmek için, canlı veya sabit lenslerdeki lens kapsüllerini WGA ile boyadık. Lens epitel hücrelerini, canlı lenslerde membranları tdTomato ile etiketleyerek (Şekil 2A) veya sabit lenslerde hücre membranlarında F-aktin için rodamin-phalloidin boyaması yoluyla tanımladık (Şekil 2B). Ortogonal (XZ) bir projeksiyonda, WGA ve tdTomato/rod...

Watch this Scientific Journal Video about In-Depth Morphometric Examination and Quantification of Native Lens Structure Using Whole Mount Imaging at JoVE.com

Mevcut protokoller, oküler lensteki periferik yapıların görüntü niceleme yöntemleriyle görselleştirilmesi için yeni tam montajlı görüntülemeyi tanımlamaktadır. Bu protokoller, lens mikro ölçekli yapıları ile lens gelişimi/işlevi arasındaki ilişkiyi daha iyi anlamak için yapılan çalışmalarda kullanılabilir.

The ocular lens is a transparent flexible tissue that alters its shape to focus light from different distances onto the retina. Aside from a basement ...

Karmaşık lens mimarisini oluşturan moleküler mekanizmaları ve bu yerleşik mimarinin saydamlık ve lens şekli değişiminde lens fonksiyonunu nasıl düzenlediğini belirlemeyi amaçlıyoruz. Alanımızdaki araştırmaları ilerletmek için, lens özelliklerini yüksek uzamsal çözünürlükle görselleştirmemize olanak tanıyan yeni görüntüleme yöntemleri kullanıyoruz ve bu, lens yapılarının ve hücresel özelliklerin nicel görüntü analizini yapmamızı sağlıyor. Tüm montaj görüntüleme, genel 3D doku yapısının korunmasını sağladığı için doku kesitlerinin görüntülenmesine veya düz montaj prosedürlerine göre avantajlıdır.Bu, doğal lens yapısı üzerinde derinlemesine morfo metrik inceleme ve miktar tayini yapmamızı sağlar. Lens, hücrelerin ve ilişkili yapılarının lokalizasyonuna ve derinliğe bağlı geometrilerine dayanan özel işlevlere sahip entegre bir biyolojik dokudur. Gösterilen görüntüleme protokollerinin ve niceleme yöntemlerinin kullanılması, lens yapılarının ve lensin karmaşık organizasyonunun nasıl kurulduğunun daha iyi anlaşılmasını sağlayacaktır.

whole-mount-imaging-to-visualize-quantify-peripheral-lens-structure

Research

JoVE Journal

Biology

Whole Mount Imaging to Visualize and Quantify Peripheral Lens Structure, Cell Morphology, and Organization

741 Görüntüleme.  University of Delaware. Karmaşık lens mimarisini oluşturan moleküler mekanizmaları ve bu yerleşik mimarinin saydamlık ve lens şekli değişiminde lens fonksiyonunu nasıl düzenlediğini belirlemeyi amaçlıyoruz. Alanımızdaki araştırmaları ilerletmek için, lens özelliklerini yüksek uzamsal çözünürlükle görselleştirmemize olanak tanıyan yeni görüntüleme yöntemleri kullanıyoruz ve bu, lens yapılarının ve hücresel özelliklerin nicel görüntü analizini yapmamızı sağlıyor. Tüm mo...

Video: Yazar Spotlight: Tam Montajlı Görüntüleme Kullanılarak Doğal Lens Yapısının Derinlemesine Morfometrik İncelemesi ve Miktar Tayini 

The ocular lens is a transparent flexible tissue that alters its shape to focus light from different distances onto the retina. Aside from a basement membrane surrounding the organ, called the capsule, the lens is entirely cellular consisting of a monolayer of epithelial cells on the anterior hemisphere and a bulk mass of lens fiber cells. Throughout life, epithelial cells proliferate in the germinative zone at the lens equator, and equatorial epithelial cells migrate, elongate, and differentiate into newly formed fiber cells. Equatorial epithelial cells substantially alter morphology from randomly packed cobble-stone-shaped cells into aligned hexagon-shaped cells forming meridional rows. Newly formed lens fiber cells retain the hexagonal cell shape and elongate toward the anterior and posterior poles, forming a new shell of cells that are overlaid onto previous generations of fibers. Little is known about the mechanisms that drive the remarkable morphogenesis of lens epithelial cells to fiber cells. To better understand lens structure, development, and function, new imaging protocols have been developed to image peripheral structures using whole mounts of ocular lenses. Here, methods to quantify capsule thickness, epithelial cell area, cell nuclear area and shape, meridional row cell order and packing, and fiber cell widths are shown. These measurements are essential for elucidating the cellular changes that occur during lifelong lens growth and understanding the changes that occur with age or pathology.

The present protocols describe novel whole mount imaging for the visualization of peripheral structures in the ocular lens with methods for image quantification. These protocols can be used in studies to better understand the relationship between lens microscale structures and lens development/function.