نود أن نشكر Maneri ريان (Oystercatcher إنتاجات ، ذ م م) للتصوير الداخلي لدينا ورودني ماكفيل (قسم العلوم البيولوجية ، جامعة بوردو) للمساعدة في تحرير الفيديو تشريح. ويدعم البحوث في المختبر سوتر من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (R01 NS049233) ومركز العلوم البيولوجية بيندلي في جامعة بوردو في DMS

الحلول <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> L15 - ASW مستنبت الخلية (1L) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 كيس من مسحوق L15 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 800 مل من O 2 H عالى النقاء </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كلوريد الصوديوم 400 ملم </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MgSO 4 27 ملي </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MgCl 2 28 ملي </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجلوتامين L - 4 مم </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جنتاميسين 50 ميكروغرام / مل </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> HEPES 5 مم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التكيف مع درجة الحموضة 7.9 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة قطرة قطرة CaCl 2 9.3 ملم (إذا وقف رواسب) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة H 2 O عالى النقاء إلى 1 لتر </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاختيار الأسمولية (950-1000 ملمول / كغ) مع مقياس التناضح (Wescor وضغط البخار # 5520) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصفية 0.22 ميكرون باستخدام الترشيح بالضغط الإيجابي وحدة (الفلاتر : SVGV010RS ميليبور) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المحل في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 1 في الشهر </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بولي - L - يسين (70-150 دينار كويتي) أبقى 200 ميكروغرام / مل محلول المخزون في العقيمة عالى النقاء H 2 O في -20 درجة مئوية </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.5 م 2 MgCl الحل </li></ul> يوم 1 : تشريح العقدة Aplysia البطن إعداد الحل تفارق الأنزيمية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وزن 90-10 ملغ من انزيم Dispase (رثينجتون ، القط : LS02111) في أنبوب إيبندورف </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 900 ميكرولتر من L15 - ASW الثقافة المتوسطة ، و 100 ميكرولتر من العقيمة عالى النقاء H 2 O </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج والمكان في درجة حرارة الغرفة (RT) </li></ol> تشريح العقدة في البطن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء الحقنة 50 مل مع 0.5 M الحل MgCl 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتخذ واحدا من الحيوان للدبابات ، والتعامل برفق لتفادي استجابة الحيوان الدفاع التحبير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع Aplysia على جانبها على لوحة التشريح (الستايروفوم المجلس) ، جنبا إلى جنب منقاري ، والحق الذيلية إلى اليسار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ادخال الإبرة في الحيوانات فقط وراء الرأس وحقن جميع MgCl 2 الحل في تجويف الجسم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بلطف فرك الحيوان لتفريق MgCl 2 حل جميع أنحاء تجويف الجسم ، انتظر لبضع دقائق للحيوان أن تكون مخدرة تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دبوس الرأس والذيل من الحيوان إلى لوحة تشريح مع اثنين من الإبر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملقط لرفع الجلد ، وقطع طريق الجلد والعضلات مع مقص طبقة كبيرة نحو الرأس والذيل لإحداث فتحة كبيرة على الجانب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العثور على العقدة في البطن تحت المبيض مثل الفرشاة. استخدام ملقط لعقد الأعصاب التي تربط حوالي 1 سم في الجبهة من العقدة في البطن ، وقطع مع مقص تشريح الأعصاب في موقف الجبهة من وراء عقد ملقط العقدة في البطن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقدة المكان إلى حل Dispase واحتضان ل15-16 ساعة عند 22 درجة مئوية باستخدام حمام مائي درجة الحرارة التي تسيطر عليها. </li></ol> يوم 2 : التصفيحات كيس من الخلايا Aplysia إعداد بولي يسين المغلفة coverslips <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مقعد في التدفق ، وإعداد ثلاثة أطباق بتري 35mm كما تعمل الأطباق لتشريح العقدة ، وملء لهم مع 4 - L15 المتوسطة ASW مل لكل منهما. نقل العقدة في البطن من الحل dispase إلى واحد من الأطباق العمل بعد 15.5 ساعة من عملية الهضم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الملقط تأخذ حمض تنظيفها # 1.5 coverslips (22x22 ملم) المخزنة في الإيثانول ، إزالة الكحول وتعقيم coverslips المشتعلة التي لها فترة وجيزة على الموقد بنسن. السماح لهم بارد لفترة وجيزة قبل وضع coverslips في أطباق الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد طلاء غيض منحني عن طريق الانحناء تلميح الصفراء على الموقد بنسن (لهب لفترة وجيزة فقط لتجنب ذوبان البلاستيك!). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد القدر المناسب من 20 ميكروغرام / مل حل بولي يسين بواسطة تمييع 200 ميكروغرام / مل محلول المخزون العقيمة مع H 2 O عالى النقاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية كل ساترة مع 500 ميكرولتر من 20 ميكروغرام / مل بولي يسين واحتضان لمدة 20 دقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل كل ساترة 3-5 مرات مع 500 ميكرولتر العقيمة عالى النقاء H O 2 لكل منهما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المياه من coverslips ؛ ملء كل طبق مع 4 مل من مستنبت - L15 ASW. </li></ol> تفكك خلايا كيس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح تحت المجهر ، وقطع العقدة في نصف البطن باستخدام مقص تشريح وملقط تنظيفها سابقا مع الايثانول 95 ٪ (الشكل 1 سطر 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على واحدة من نصف العقدة ، وقطع ما بين الكتلة الخلية كيس والخلايا hemiganglion (الشكل 1 سطر 2) ، وقطع العصب بعيدا ملحقات المتبقية على الجانب الآخر من خلايا كيس (الشكل 1 السطر 3). العمل على نصف العقدة في وقت واحد ؛ ترك النصف الآخر في صحن مطلي بينما يجري الخلايا من المجموعة الأولى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام اثنين ملقط (أو أحد ملقط ومقص تشريح) ، كتلة الخلية كيس الإفراج عن طريق دفع جانبا غمد النسيج الضام المحيطة الكتلة الخلية كيس. قطع النسيج الضام مع مقص تشريح إذا لزم الأمر. حذار لا للضغط واللمس الكتلة الخلية كيس الكثير خلال هذه العملية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند إزالة أكثر من النسيج الضام ، ونقل بأعد AG الكتلة الخلية في طبق العمل الجديدة مع ترجيح كفة الأصفر عازمة في وقت سابق. يجب الحرص على عدم السماح لتكون الكتلة الخلية محاصرين داخل كيس غيض الأصفر أو عالقا في الهواء واجهة / متوسطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> متمزج الكتلة الصفراء مع تلميح لإزالة كيس الخلايا الفردية. القيام بذلك عن طريق pipetting الكتلة داخل وخارج الحافة. تبدأ قوى القص المنخفضة وزيادة القوة عند الحاجة. دوما استخدام القوة المطلوبة أدنى لإزالة الخلايا العصبية من دون قتل العديد من الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3-5 جمع الخلايا حقيبة صحية ونقلها إلى طبق مع ساترة بولي يسين المغلفة. تجنب التقاط الخلايا الميتة (هم أسود / شفافة في الوسط) والضام الحطام الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة 6. وحول مكان الخلايا العصبية 15-25 يعيش في وسط كل ساترة. إذا تم نقل الخلايا الميتة أو الحطام وكذلك إزالة المواد غير المرغوب فيها عن طريق التقاط لأعلى أو لتهب بعيدا عن الخلايا السليمة. هذه العملية تستغرق حوالي 2-3 ساعات لكلتا المجموعتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمجرد الانتهاء إبقاء الأطباق الثقافة على مقاعد البدلاء تدفق ما لا يقل عن 2 ساعة على RT السماح الخلايا لنعلق (إبقاء مقعد قبالة تدفق منفاخ لتجنب الاهتزاز غير المرغوب فيه). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الأطباق في الحاضنة عند 14 درجة مئوية خلال الليل ، أو حتى استخدامها مرة أخرى. قد تتطور في مخاريط النمو 40-10 ساعة. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/old/662_2008_2_10_0/image001.jpg" alt="الشكل 1. التخطيطي للعقدة californica Aplysia البطن. خطوط ملونة تشير فيها الى خفض للحصول على كتل الخلية كيس." /> الشكل 1. التخطيطي للعقدة californica Aplysia البطن. خطوط ملونة تشير فيها الى خفض للحصول على كتل الخلية كيس. اليوم 3 : إعداد غرفة للتصوير الخلايا الحية كيس Aplysia التجمع من غرفة التصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل استخدام الخلايا الحية لحقيبة تجارب التصوير الخلية ، وفحص الخلايا على المجهر منخفضة الطاقة. اذا لم تتطور خلايا المخاريط النمو الصحي ، وإمدادات جديدة والمتوسطة في إجازة لمدة 1-2 ساعات RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتوريد لوحات متوسطة مع L15 - ASW العذبة ، وإزالة نصف (~ 2ml) من متوسط ​​العمر مع خط فراغ ، وإضافة 2 مل من جديد L15 - ASW المتوسطة في طبق بتري. فمن المهم عدم إزالة كافة المتوسطة من الطبق في كل مرة ، حيث سيؤدي ذلك إلى إزالة الخلايا من ساترة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التصوير الخلية كيس ، ونحن التجمع two coverslips واثنين من الفواصل البلاستيكية في غرفة التصوير مثل شطيرة. هو قطع رأس ساترة في شطيرة أقصر التي تتيح تبادل سهل من المتوسط ​​والكواشف. خلال التجمع ، ينبغي المغمورة coverslips مع الخلايا في حقيبة تعلق L15 - ASW المتوسطة في جميع الأوقات لمنع الخلايا من طرد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد غرفة ، وقطع من الجانب الأيمن لملم coverslips # 1 22x22 مع قلم الماس (قطع الزجاج) والحاكم 2mm و~. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام حقنة 1 مل ، وتطبيق عالية الشحوم فراغ لهما وجهان لأقصر ساترة ، والفواصل البلاستيكية نعلق على كل جانب. تطبيق الشحوم فراغ إلى الأعلى كل من الفواصل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اقلب ساترة والتجمع الفاصل ، ووضع في طبق بتري تحتوي على خلايا كيس على ساترة. محاذاة واضغط بلطف إلى أسفل إلى أعلى إلى عصا ساترة ساترة القاع مع نهاية عكس اثنين من Q - النصائح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط ، ترفع بلطف التجمع شطيرة من طبق بتري دون المتوسطة تسرب. محاذاة coverslips اثنين ، إذا لزم الأمر ، وتمحو المتوسطة الزائدة مع Kimwipe. وضع شطيرة على الجزء السفلي من حامل الشرائح المجهر وأرفق مع تغطية الرعاية باستخدام مقاطع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مست نظيفة وسط الجزء العلوي من الشطيرة مع Q - نصائح في نظافة الزجاج (يتم استخدام البريق ونظافة الزجاج). يجف بسرعة قبالة منظف الزجاج مع وجافة second Q - تلميح لتجنب خطوط متتالية. تفعل الشيء نفسه بالنسبة للساترة القاع. coverslips نظيفة خالية من خطوط متتالية هامة للتصوير عالية الجودة. </li></ol> حقيبة الخلايا على المجهر منذ الثقافات Aplysia الخلية العصبية هي في حقيبة منخفض الكثافة ، فمن الأفضل إذا كان الإعداد الخاص وظائف المجهر لتحديد المواقع لتسهيل مرحلة الانتقال بين الخلايا. يمكن الخلايا بسهولة في حقيبة أبقى RT لعدة ساعات على خشبة المسرح خلال تجارب التصوير. تبادل المتوسطة بشكل دوري لتجنب التبخر.

<ol>
	<li>Forscher, P., Kaczmarek, L. K., Buchanan, J. A., Stephen, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+AMP+induces+changes+in+distribution+and+transport+of+organelles+within+growth+cones+of+Aplysia+bag+cell+neurons.">Cyclic AMP induces changes in distribution and transport of organelles within growth cones of Aplysia bag cell neurons.</a> J. Neurosci. 7, 3600-3611 (1987).</li><li>Suter, D. M., Errante, L. D., Belotserkovsky, V., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ig+superfamily+cell+adhesion+molecule,+apCAM,+mediates+growth+cone+steering+by+substrate-cytoskeletal+coupling.">The Ig superfamily cell adhesion molecule, apCAM, mediates growth cone steering by substrate-cytoskeletal coupling.</a> J. Cell. Biol. 141, 227-240 (1998).</li><li>Schaefer, A. W., Kabir, N., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filopodia+and+actin+arcs+guide+the+assembly+and+transport+of+two+populations+of+microtubules+with+unique+dynamic+parameters+in+neuronal+growth+cones.">Filopodia and actin arcs guide the assembly and transport of two populations of microtubules with unique dynamic parameters in neuronal growth cones.</a> J. Cell. Biol. 158, 139-152 (2002).</li><li>Suter, D. M., Schaefer, A. W., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+dynamics+are+necessary+for+SRC+family+kinase-dependent+growth+cone+steering.">Microtubule dynamics are necessary for SRC family kinase-dependent growth cone steering.</a> Curr. Biol. 14, 1194-1199 (2004).</li></ol>

الخلية العصبية Aplysia حقيبة توفير المصل خالية من الخلايا العصبية ثقافة النظام مع الخلايا العصبية غير قليلة جدا. هذه الخلايا العصبية شكل مخاريط نمو كبيرة جدا مناسبة لمعالجة عدد من المسائل الهامة الخلية البيولوجية. يمكن أن الخلايا العصبية الخلية كيس يمكن بسهولة التلاعب بها وتصوير?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>#1 glass coverslips 22x22 mm</td>
<td>Tool</td>
<td>VWR</td>
<td>48366067</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>#1.5 glass coverslips 22x22 mm</td>
<td>Tool</td>
<td>Corning</td>
<td>2870-22</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>35 mm Petri dishes</td>
<td>Tool</td>
<td>Falcon</td>
<td>353001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Filters for medium filtration</td>
<td>Tool</td>
<td>Millipore</td>
<td>SVGV010RS</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>High vacuum grease</td>
<td>Tool</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>1597418</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Osmometer</td>
<td>Tool</td>
<td>Wescor</td>
<td>5520</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plastic shims</td>
<td>Tool</td>
<td>Small Parts Inc </td>
<td>SHSP-200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Calcium chloride</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher</td>
<td>C79-500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gentamicin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15750-060</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HEPES</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>H4030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L15 medium</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>41300-039</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-glutamine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>G8540</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnesium chloride</td>
<td>Reagent</td>
<td>Mallinckrodt</td>
<td>5958-04</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnesium sulfate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Mallinckrodt</td>
<td>6070-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Poly-L-lysine (70-150 kD) </td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6282</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium chloride</td>
<td>Reagent</td>
<td>Mallinckrodt </td>
<td>7581</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Neutral Protease (Dispase)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Worthington</td>
<td>LS02111</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

neuronal cell cultures from aplysia for high-resolution imaging of growth cones

المخاريط نمو الخلايا العصبية هي هياكل متحركة غاية في غيض من المحاور التي يمكن الكشف عن توجيه اشارات في البيئة وتنبيغ هذه المعلومات في حركة الاتجاه نحو الخلية المستهدفة المناسبة. لنفهم تماما كيف يتم نقل المعلومات على توجيه من سطح الخلية الأساسية للشبكات هيكل الخلية الحيوية ، يحتاج المرء إلى نموذج مناسب لنظام التصوير خلية حية من البروتين في الديناميات عالية الدقة الزمنية والمكانية. نموذجي مخاريط النمو الفقاريات هي صغيرة جدا لتحليل كمي F - أكتين وديناميات أنيبيب. الخلايا العصبية من californica البحر Aplysia الأرنب 5-10 مرات أكبر من الخلايا العصبية الفقاريات ، ويمكن بسهولة أن تبقى في درجة حرارة الغرفة وخلايا قوية للغاية والقياسات الفيزيائية الحيوية المجهرية. حددت المخاريط نموها جدا هيولي المناطق ونظام جيد وصفها هيكل الخلية. يمكن microinjected الهيئات الخلايا العصبية مع مجموعة متنوعة من التحقيقات لدراسة حركية النمو مخروط والتوجيه. في هذا البروتوكول أن نبرهن على إجراء تشريح العقدة في البطن ، والثقافة ، من الخلايا العصبية الخلية كيس وإنشاء غرفة للتصوير التصوير خلية حية من مخاريط النمو.

Watch this Scientific Journal Video about Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones at JoVE.com

Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

Aplysia تطوير الخلايا العصبية californica مخاريط النمو الكبير في الثقافة التي هي ممتازة لتصوير عالية الدقة في القدرة على الحركة مخروط النمو والتوجيه. هنا ، نقدم بروتوكول للتشريح والطلاء خلية من الخلايا العصبية Aplysia حقيبة فضلا عن انشاء غرفة للتصوير الخلايا الحية.

الخلية العصبية من الثقافات Aplysia عن التصوير عالية الدقة من المخاريط النمو

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information ...

neuronal-cell-cultures-from-aplysia-for-high-resolution-imaging

Research

JoVE Journal

Biology

11.3K Views.  Purdue University. Aplysia تطوير الخلايا العصبية californica مخاريط النمو الكبير في الثقافة التي هي ممتازة لتصوير عالية الدقة في القدرة على الحركة مخروط النمو والتوجيه. هنا ، نقدم بروتوكول للتشريح والطلاء خلية من الخلايا العصبية Aplysia حقيبة فضلا عن انشاء غرفة للتصوير الخلايا الحية.

Video: Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the removal of brains from animals at 70-78 hrs after puparium formation. The isolated brains are shown after brief incubation in papain followed by several washes in serum-free growth medium. The process of mechanical dissociation of each brain in a 5 ul drop of media on a coverslip is illustrated. The axons and dendrites of the post-mitotic neurons are sheered off near the soma during dissociation but the neurons begin to regenerate processes within a few hours of plating. Images show live cultures at 2 days. Neurons continue to elaborate processes during the first week in culture. Specific neuronal populations can be identified in culture using GAL4 lines to drive tissue specific expression of fluorescent markers such as  GFP or RFP. Whole cell recordings have demonstrated the cultured neurons form functional, spontaneously active cholinergic and GABAergic synapses. A short video segment illustrates calcium dynamics in the cultured neurons using Fura-2 as a calcium indicator dye to monitor spontaneous calcium transients and nicotine evoked calcium responses in a dish of cultured neurons. These pupal brain cultures are a useful model system in which genetic and pharmacological tools can be used to identify intrinsic and extrinsic factors that influence formation and function of central synapses.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. Views of live cultures show neurite outgrowth and imaging of calcium levels using Fura-2.

متعلق بالخلايا العصبية الثقافات الأساسي من الأمخاخ في وقت متأخر من المرحلة ذبابة الفاكهة شرانق

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

التحضير للثقافات متعلق بالخلايا العصبية من أجنة ذبابة الفاكهة المرحلة Midgastrula

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Preparing T Cell Growth Factor from Rat Splenocytes

Maintenance of antigen-specific T cell lines or clones in culture requires rounds of antigen-induced activation separated by phases of cell expansion 1,2. Addition of interleukin 2 to the culture media during the expansion phase is necessary to prevent cell death and sufficient to maintain short-term T cell lines but has been shown to increase Th1 polarization 3. Replacement of interleukin 2 by T cell growth factor (TCGF) which contains a mix of cytokines is more effective than interleukin 2 in maintaining long-term T cell lines in vitro 3. Moreover, TCGF can easily be prepared in large amounts in the laboratory and is much cheaper than recombinant interleukin 2. 
Here, we show how to prepare TCGF from rat splenocyte culture supernatants. For this procedure, we harvest spleens from naive Lewis rats euthanized for thymus and blood collection. We prepare single-cell suspensions from the spleens, lyze the red blood cells by osmotic shock, and seed the splenocytes in culture medium. The cells are stimulated with concanavalin A, a mitogen that non-selectively activates all rat T lymphocytes, inducing the production of cytokines. The culture supernantant is collected 48 hours later andexcess concanavalin A is bound to alpha methyl mannoside to prevent it from activating T cell lines to which TCGF will be added. The TCGF is then sterile-filtered, aliquoted, and stored at -20&deg;C.

We describe the preparation of T cell growth factor used for the in vitro expansion of antigen-specific rat T lymphocyte lines.

إعداد عامل نمو الخلايا T من Splenocytes الجرذ

Maintenance of antigen-specific T cell lines or clones in culture requires rounds of antigen-induced activation separated by phases of cell expansion 1,2. ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

التحضير لزراعة الخلايا المكونة للدم الابتدائية من نخاع عظام الفئران لElectroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

عالية الدقة تعقب الفيديو للتنقل في الكبار ذبابة الفاكهة السوداء البطن

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

The nervous system of the marine mollusk Aplysia californica is relatively simple, consisting of approximately 20,000 neurons. The neurons are large (up to 1 mm in diameter) and identifiable, with distinct sizes, shapes, positions and pigmentations, and the cell bodies are externally exposed in five paired ganglia distributed throughout the body of the animal. These properties have allowed investigators to delineate the circuitry underlying specific behaviors in the animal1. The monosynaptic connection between sensory and motor neurons is a central component of the gill-withdrawal reflex in the animal, a simple defensive reflex in which the animal withdraws its gill in response to tactile stimulation of the siphon. This reflex undergoes forms of non-associative and associative learning, including sensitization, habituation and classical conditioning. Of particular benefit to the study of synaptic plasticity, the sensory-motor synapse can be reconstituted in culture, where well-characterized stimuli elicit forms of plasticity that have direct correlates in the behavior of the animal2,3. Specifically, application of serotonin produces a synaptic strengthening that, depending on the application protocol, lasts for minutes (short-term facilitation), hours (intermediate-term facilitation) or days (long-term facilitation). In contrast, application of the peptide transmitter FMRFamide produces a synaptic weakening or depression that, depending on the application protocol, can last from minutes to days (long-term depression). The large size of the neurons allows for repeated sharp electrode recording of synaptic strength over periods of days together with microinjection of expression vectors, siRNAs and other compounds to target specific signaling cascades and molecules and thereby identify the molecular and cell biological steps that underlie the changes in synaptic efficacy.
An additional advantage of the Aplysia culture system comes from the fact that the neurons demonstrate synapse-specificity in culture4,5. Thus, sensory neurons do not form synapses with themselves (autapses) or with other sensory neurons, nor do they form synapses with non-target identified motor neurons in culture. The varicosities, sites of synaptic contact between sensory and motor neurons, are large enough (2-7 microns in diameter) to allow synapse formation (as well as changes in synaptic morphology) with target motor neurons to be studied at the light microscopic level.
In this video, we demonstrate each step of preparing sensory-motor neuron cultures, including anesthetizing adult and juvenile Aplysia, dissecting their ganglia, protease digestion of the ganglia, removal of the connective tissue by microdissection, identification of both sensory and motor neurons and removal of each cell type by microdissection, plating of the motor neuron, addition of the sensory neuron and manipulation of the sensory neurite to form contact with the cultured motor neuron.

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

Primary cultures of Aplysia sensory-motor neurons provide a model preparation for studying synapse formation and synaptic plasticity in vitro. This video demonstrates the identification and microdissection of sensory and motor neurons from Aplysia ganglia as well as the methods for establishing and maintaining sensory-motor neurons in culture.

إعداد Aplysia الحسية والحركية الثقافات الخلية متعلق بالخلايا العصبية

The nervous system of the marine mollusk Aplysia californica is relatively simple, consisting of approximately 20,000 neurons.  The neurons are large (up ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

الخلية الأولية من الثقافات ذبابة الفاكهة الأجنة المعيدة

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Generation of Dispersed Presomitic Mesoderm Cell Cultures for Imaging of the Zebrafish Segmentation Clock in Single Cells

Segmentation is a periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic formation of blocks of tissue called somites along the body axis is evidence of a genetic oscillator patterning the developing embryo. In zebrafish, the intracellular clock driving segmentation is comprised of members of the Her/Hes transcription factor family organized into negative feedback loops. We have recently generated transgenic fluorescent reporter lines for the cyclic gene her1 that recapitulate the spatio-temporal pattern of oscillations in the presomitic mesoderm (PSM). Using these lines, we developed an in vitro culture system that allows real-time analysis of segmentation clock oscillations within single, isolated PSM cells. By removing PSM tissue from transgenic embryos and then dispersing cells from oscillating regions onto glass-bottom dishes, we generated cultures suitable for time-lapse imaging of fluorescence signal from individual clock cells. This approach provides an experimental and conceptual framework for direct manipulation of the segmentation clock with unprecedented single-cell resolution, allowing its cell-autonomous and tissue-level properties to be distinguished and dissected.

Somitogenesis is a rhythmic developmental process that spatially patterns the body axis of vertebrate embryos. Previously, we developed transgenic zebrafish lines that use fluorescent reporters to observe the cyclic genes that drive this process. Here, we culture dispersed cells from these lines and image their oscillations over time in vitro.

جيل من تفرقوا Presomitic الأديم المتوسط ​​الثقافات خلية التصوير من اسماك الزرد الإنقسام على مدار الساعة في خلايا واحدة

Segmentation is a  periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic  formation of blocks of tissue called somites along the ...

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary clearance function has been established. Freshly harvested mouse trachea is cut longitudinally through the trachealis muscle and mounted in a shallow walled chamber on a glass-bottomed dish. The trachea sample is positioned along its long axis to take advantage of the trachealis muscle to curl longitudinally. This allows imaging of ciliary motion in the profile view along the entire tracheal length. Videos at 200 frames/sec are obtained using differential interference contrast microscopy and a high speed digital camera to allow quantitative analysis of cilia beat frequency and ciliary waveform. With the addition of fluorescent beads during imaging, cilia generated fluid flow also can be determined. The protocol time spans approximately 30 min, with 5 min for chamber preparation, 5-10 min for sample mounting, and 10-15 min for videomicroscopy.

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

An easy and reliable technique for visualizing and quantifying airway cilia motility and cilia generated flow using mouse trachea is described. This technique can be modified to determine how a wide range of factors influence cilia motility, including pharmacological agents, genetic factors, environmental exposures, and/or mechanical factors such as mucus load.

طريقة السابقين فيفو التصوير عالية الدقة في القدرة على الحركة الأهداب في القوارض مجرى الهواء الظهارة

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative  analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary  ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and widely-utilized +TIPs for analyzing MT dynamics is the End-Binding protein, EB1, which binds all growing MT plus-ends, and thus, is a marker for MT polymerization1. Many studies of EB1 behavior within growth cones have used time-consuming and biased computer-assisted, hand-tracking methods to analyze individual MTs1-3. Our approach is to quantify global parameters of MT dynamics using the software package, plusTipTracker4, following the acquisition of high-resolution, live images of tagged EB1 in cultured embryonic growth cones5. This software is a MATLAB-based, open-source, user-friendly package that combines automated detection, tracking, visualization, and analysis for movies of fluorescently-labeled +TIPs. Here, we present the protocol for using plusTipTracker for the analysis of fluorescently-labeled +TIP comets in cultured Xenopus laevis growth cones. However, this software can also be used to characterize MT dynamics in various cell types6-8.

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

The MATLAB-based, open source software package, plusTipTracker, can be used to analyze image series of fluorescently-labeled +TIPs to quantify microtubule dynamics.

plusTipTracker باستخدام برنامج لقياس ديناميكية في أنيبيب<em&gt; القيطم المورق</em&gt; المخاريط النمو

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...