تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82000624) ، وبرنامج البحوث الأساسية للعلوم الطبيعية في شنشي (2022JQ-899 و 2021JM-268) ، وبرنامج دعم القدرة على الابتكار في مقاطعة شنشي (2023KJXX-030) ، والمشروع المشترك لجامعة خطة البحث والتطوير الرئيسية لمقاطعة شنشي - المشروع الرئيسي (2021GXLH-Z-047) ، والتأسيس المؤسسي لأول مستشفى تابع لجامعة شيان جياوتونغ (2021HL-42 و 2021HL-21).

تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة أخلاقيات التجارب على بجامعة Xi'an Jiaotong وتم إجراؤها وفقا للمبادئ التوجيهية لرعاية واستخدام المختبر.
1. حصاد الطحال
<ol><li>استخدام الفئران الذكور Sprague Dawley التي تزن 250-280 جم. إيواء الفئران في غرف ذات درجة حرارة ورطوبة يتم التحكم فيها ، وتزويدهم بالطعام والماء حسب الطلب ، باستثناء الصيام قبل الجراحة.</li>
	<li>حقن البوبرينورفين تحت الجلد (0.05 مل / كجم) كمسكن لمدة 1 ساعة قبل العملية. تخدير الفئران عن طريق استنشاق الأيزوفلوران. استخدم معدل تدفق 1.5 لتر / دقيقة من 5٪ إيزوفلوران للتخدير التعريفي في صندوق زجاج شبكي وحافظ على التخدير بمعدل تدفق 0.6-0.8 لتر / دقيقة من 2٪ إيزوفلوران من خلال قناع. تأكيد عمق التخدير عن طريق الضغط على أصابع القدم.</li>
	<li>استخدم ماكينة حلاقة كهربائية لحلق الجلد على كامل البطن. تأمين الفئران في وضع ضعيف على طاولة الجراحة. حقن 2 مل من محلول ملحي هيبارين (1000 وحدة من الهيبارين) عبر الوريد الظهري للقضيب لتحقيق منع تخثر الدم الجهازي. تطهير الجلد المحلوق بمحلول بوفيدون اليود وتغطيته بقطعة قماش معقمة.</li>
	<li>قم بعمل شق صليبي باستخدام مقص جراحي في البطن ، وكشف تجويف البطن عن طريق التمدد بالملقط المرقئ ، واقلب الكبد نحو الحجاب الحاجز. قم بإخراج الجهاز الهضمي من الجانب الأيمن من البطن وقم بتغطيته بشاش رطب.</li>
	<li>افصل بعناية وقطع الرباط الطحال المعدي لفضح الطحال. ملاحظة: يمكن التعرف على الطحال ، الذي يظهر كهيكل ممدود محمر ، بحجم 3.0 سم × 0.6 سم × 0.6 سم تقريبا ، في البطن الأيسر.</li>
	<li>افصل تدريجيا وكشف الشريان الكبدي المشترك والشريان المعدي الاثني عشر والشريان الطحال عن طريق التشريح على طول الهيلوم الطحالي. ربط وقطع الشريان المعدي المعوي والشريان الكبدي المشترك مع فصل الأنسجة المحيطة تدريجيا.</li>
	<li>اقلب الطحال نحو الجانب الأيمن لكشف الشريان الأورطي البطني. أداء تشريح حادة بلطف وفضح الشريان الأورطي البطني والجذع الاضطرابات الهضمية باستخدام مسحات القطن. ضع خيطا حريريا 3-0 ، طوله حوالي 3 سم ، أعلى وأسفل فروع جذع الاضطرابات الهضمية ، وضع خياطة حريرية 6-0 ، طولها حوالي 10 سم ، عند فرع جذع الاضطرابات الهضمية.</li>
	<li>رباط الشريان الأورطي البطني أسفل وفوق فروع الجذع الاضطرابات الهضمية. قم بعمل شق صغير في الفرع الشرياني. ارفع الخيط الحريري 6-0 برفق ، وأدخل قسطرة وريدية 24 جراما في الشريان الطحال على طول الجذع البطني ، وقم بتثبيته وتثبيته.</li>
	<li>باستخدام مضخة حقنة بمعدل 4 مل / دقيقة ، قم بضخ محلول ملحي طبيعي هيبارين (25 وحدة / مل) بحجم 50 مل. في الوقت نفسه ، قم بقطع الوريد البابي كقناة تدفق للسماح للسائل المملوء بالتدفق من الطحال. يتم القتل الرحيم للحيوان عن طريق الاستنزاف.</li>
	<li>تشريح الأنسجة المحيطة بالطحال بعناية ، وتجنب تلف البنكرياس ، مع الحفاظ على الأوعية الملحقة الرئيسية.</li>
	<li>تحقق من وجود أي تسرب حول الطحال ، ثم قم بإزالة الطحال والبنكرياس وشطفهما في محلول ملحي طبيعي. ملاحظة: يرتبط الطحال والبنكرياس من الفئران ارتباطا وثيقا ، مع التفاف البنكرياس حول الشريان الطحالي. إذا تمت إزالة الطحال بشكل منفصل ، فقد يكون من الصعب ربط العديد من الأوعية الدموية الصغيرة. في هذا الإجراء ، تتم إزالة الطحال مع البنكرياس. بعد إزالة الخلايا ، يصبح الطحال والبنكرياس شفافين وتكون الأوعية الدموية الدقيقة مرئية ، مما يسهل الحفاظ على الطحال بأوعية دموية سليمة.</li>
	<li>انقل الطحال إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل مملوء بمحلول ملحي عادي وقم بتخزينه في مجمد -80 درجة مئوية. ملاحظة: سيتم حفظ الطحال والقسطرة الوريدية التي يتم إدخالها في الشريان الطحال معا للتوصيل المريح أثناء تجارب التروية.</li>
</ol>2. إزالة الخلايا من الطحال
<ol><li>كرر دورة التجميد والذوبان 3x في وعاء معقم لتحلل خلايا الطحال. ملاحظة: دورة التجميد والذوبان هي طريقة فيزيائية تستخدم لإزالة الخلايا من السقالة. يتم وضع أنسجة الطحال في الفريزر -80 درجة مئوية طوال الليل للتجميد ، ثم إزالتها من بيئة درجة الحرارة المنخفضة ووضعها في درجة حرارة الغرفة أو حمام مائي 37 درجة مئوية للذوبان. تتكرر عملية التجميد والذوبان هذه 3-6 مرات ، مما يعطل أغشية الخلايا ويؤدي إلى تحلل الخلايا.</li>
	<li>قم بإعداد نظام نضح داخل مقعد نظيف يتكون من مضخة تمعجية وخزان سعة 2 لتر وأنبوب سيليكون بقطر داخلي 2.4 مم ومصيدة فقاعات (الشكل 1).</li>
	<li>املأ نظام التروية بالماء منزوع الأيونات (ddH2O) واستمر في تشغيله لمدة 10 دقائق.</li>
	<li>انقل الطحال المحصود بعناية إلى الحاوية المملوءة ddH2O.</li>
	<li>قم بتوصيل أنبوب السيليكون بالقسطرة الوريدية التي تم إدخالها في الشريان الطحالي.</li>
	<li>ابدأ التروية ب ddH2O بمعدل 2 مل / دقيقة لمدة 30 دقيقة.</li>
	<li>استمر في التروية باستخدام ddH2O بمعدل 4 مل / دقيقة لمدة 30 دقيقة.</li>
	<li>Perfuse مع 0.1٪ (وزن / حجم) حل SDS لمدة 4 ساعات.</li>
	<li>Perfuse مع 1٪ (v / v) محلول Triton X-100 لمدة 2 ساعة.</li>
	<li>قم بالإعلاء باستخدام برنامج تلفزيوني بمعدل 4 مل / دقيقة لمدة 4 ساعات لغسل DSM. ملاحظة: استخدام المضخة التمعجية للتروية أحادية الاتجاه لجميع السوائل.</li>
	<li>بعد اكتمال التروية ، قم بربط وعبور فروع الأوعية الدموية بين البنكرياس والطحال ، ثم قم بإزالة البنكرياس. قم بتخزين DSM في أنبوب طرد مركزي نظيف ومختوم سعة 50 مل منقوع في برنامج تلفزيوني يحتوي على 10٪ بنسلين-ستربتومايسين عند -20 درجة مئوية حتى يصبح جاهزا للاستخدام في التجارب المستقبلية.</li>
</ol>

تحضير مصفوفة طحال الفئران الخلوي لهندسة أنسجة الكبد

<ol>
	<li>Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+of+the+art+and+perspectives+in+liver+transplantation.">State of the art and perspectives in liver transplantation.</a> Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 22 (1), 1-3 (2023).</li><li>Hautz, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+cell+dynamics+deconvoluted+by+single-cell+RNA+sequencing+in+normothermic+machine+perfusion+of+the+liver.">Immune cell dynamics deconvoluted by single-cell RNA sequencing in normothermic machine perfusion of the liver.</a> Nat Commun. 14 (1), 2285 (2023).</li><li>Cardini, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+confocal+imaging+as+a+novel+tool+to+assess+liver+quality:+insights+from+a+murine+model.">Live confocal imaging as a novel tool to assess liver quality: insights from a murine model.</a> Transplantation. 104 (12), 2528-2537 (2020).</li><li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell-derived+exosomes:+a+promising+therapeutic+agent+for+the+treatment+of+liver+diseases.">Mesenchymal stem cell-derived exosomes: a promising therapeutic agent for the treatment of liver diseases.</a> Int J Mol Sci. 23 (18), 10972 (2022).</li><li>Yaghoubi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prednisolone+and+mesenchymal+stem+cell+preloading+protect+liver+cell+migration+and+mitigate+extracellular+matrix+modification+in+transplanted+decellularized+rat+liver.">Prednisolone and mesenchymal stem cell preloading protect liver cell migration and mitigate extracellular matrix modification in transplanted decellularized rat liver.</a> Stem Cell Res Ther. 13 (1), 36 (2022).</li><li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+reengineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix.">Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nat Med. 16 (7), 814-820 (2010).</li><li>Xiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+riboflavin/UVA+cross-linking+on+anti-degeneration+and+promoting+angiogenic+capability+of+decellularized+liver+matrix.">The effect of riboflavin/UVA cross-linking on anti-degeneration and promoting angiogenic capability of decellularized liver matrix.</a> J Biomed Mater Res A. 105 (10), 2662-2669 (2017).</li><li>Liu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implantation+strategy+of+tissue-engineered+liver+based+on+decellularized+spleen+matrix+in+rats.">Implantation strategy of tissue-engineered liver based on decellularized spleen matrix in rats.</a> J South Med Univ. 38 (6), 698-703 (2018).</li><li>Xiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+spleen+matrix+for+reengineering+functional+hepatic-like+tissue+based+on+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells.">Decellularized spleen matrix for reengineering functional hepatic-like tissue based on bone marrow mesenchymal stem cells.</a> Organogenesis. 12 (3), 128-142 (2016).</li><li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+culture+in+autologous+decellularized+spleen+matrix.">Hepatocyte culture in autologous decellularized spleen matrix.</a> Organogenesis. 11 (1), 16-29 (2015).</li><li>Liu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemocompatibility+improvement+of+decellularized+spleen+matrix+for+constructing+transplantable+bioartificial+liver.">Hemocompatibility improvement of decellularized spleen matrix for constructing transplantable bioartificial liver.</a> Biomed Mater. 14 (2), 25003 (2019).</li><li>Somuncu, &. #. 2. 1. 4. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+concept+in+regenerative+medicine.">Decellularization concept in regenerative medicine.</a> Adv Exp Med Biol. 1212, 71-85 (2020).</li><li>Neishabouri, A., Soltani, K. A., Daghigh, F., Kajbafzadeh, A. M., Majidi, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+in+tissue+engineering+and+regenerative+medicine:+evaluation,+modification,+and+application+methods.">Decellularization in tissue engineering and regenerative medicine: evaluation, modification, and application methods.</a> Front Bioeng Biotech. 10, 805299 (2022).</li><li>Brown, M., Li, J., Moraes, C., Tabrizian, M., Li-Jessen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+extracellular+matrix:+New+promising+and+challenging+biomaterials+for+regenerative+medicine.">Decellularized extracellular matrix: New promising and challenging biomaterials for regenerative medicine.</a> Biomaterials. 289, 121786 (2022).</li><li>Gui, L., Muto, A., Chan, S. A., Breuer, C. K., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+decellularized+human+umbilical+arteries+as+small-diameter+vascular+grafts.">Development of decellularized human umbilical arteries as small-diameter vascular grafts.</a> Tissue Eng Pt A. 15 (9), 2665-2676 (2009).</li><li>Li, T., Javed, R., Ao, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenogeneic+decellularized+extracellular+matrix-based+biomaterials+For+peripheral+nerve+repair+and+regeneration.">Xenogeneic decellularized extracellular matrix-based biomaterials For peripheral nerve repair and regeneration.</a> Curr Neuropharmacol. 19 (12), 2152-2163 (2021).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes.">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li></ol>

ولم يعلن صاحبا البلاغ عن أي تضارب في المصالح.

تمثل BALs نهجا فعالا لعلاج أمراض الكبد في المرحلة النهائية ، لا سيما في الحالات التي يعوق فيها زرع الكبد النقص الحالي في الأعضاء المانحة6. خيار واعد لإنشاء BALs هو استخدام DLM ، الذي يحافظ على ECM الطبيعي للكبد الأصلي وهيكل الأوعية الدموية. ومع ذلك ، فإن ندرة DLM البشري والمخاطر المحتم?...

لا يزال زرع الكبد هو العلاج النهائي الوحيد لمرض الكبد في المرحلة النهائية1،2،3. ومع ذلك ، فإن النقص الحاد وانخفاض جودة الأعضاء المانحة قد زاد من الحاجة إلى علاجات بديلة4. في مجال الطب التجديدي ، ظهرت الكبد الاصطناعي الحيوي (BALs) باستخدام مصفوفة الكبد المنزوعة الخلايا (DLM) كحلول واعدة5،6،7. يحافظ DLM على بنية الكبد الأصلية ، بما في ذلك شبكة الأوعية الدموية الدقيقة المعقدة ومكونات ECM ، مما يوفر سقالة لإنشاء BALs قابلة للزرع يمكن أن تخفف من أمراض الكبد.
على الرغم من الوعد ، فإن اعتماد هذه التكنولوجيا يواجه تحديات ، لا سيما في الحصول على DLMs المناسبة. هناك نقص في DLMs المشتقة من الإنسان ، في حين أن تلك من مصادر حيوانية تحمل مخاطر انتقال المرض والرفض المناعي. في نهج مبتكر ، استكشف بحثنا استخدام مصفوفة الطحال منزوعة الخلايا (DSM) كأساس ل BALs8،9،10،11. يتوفر الطحال بسهولة أكبر في حالات طبية مختلفة ، مثل ارتفاع ضغط الدم البابي ، والتمزق الرضحي ، ورفرية نقص الصفيحات مجهول السبب ، والتبرع بعد الموت القلبي. لذلك ، الطحال متاح على نطاق أوسع من الكبد لأغراض البحث. المرضى الذين خضعوا لاستئصال الطحال لا يعانون من حالات قاسية ، مما يؤكد بشكل أكبر إمكانية الاستغناء عن الطحال. البيئة المكروية للطحال ، وخاصة المصفوفة خارج الخلية والجيوب الأنفية ، تشبه تلك الموجودة في الكبد. هذا يجعل الطحال عضوا مناسبا لالتصاق الخلايا وانتشارها في أبحاث زراعة خلايا الكبد. بناء على هذه النتائج ، أظهرت تحقيقاتنا السابقة أن DSMs تشترك في الهياكل المجهرية والمكونات المماثلة مع DLMs ويمكن أن تدعم بقاء ووظيفة خلايا الكبد ، بما في ذلك إنتاج الألبومين واليوريا. علاوة على ذلك ، فقد ثبت أن DSMs تعزز التمايز الكبدي للخلايا الجذعية الوسيطة لنخاع العظم ، مما يؤدي إلى تحسين الوظائف واتساقها.
من خلال استخدام DSMs المعالجة بالهيبارين ، قمنا بتصميم BALs وظيفية قادرة على إظهار منع تخثر الدم الفعال على المدى القصير والتعويض الجزئي لوظائف الكبد11. وبالتالي ، فإن هذا الدليل التشخيصي والإحصائي للاضطرابات النفسية ثلاثي الأبعاد يحمل وعدا كبيرا للنهوض بهندسة أنسجة الكبد والعلاج بالخلايا. في هذا العمل ، نقدم الطرق التفصيلية لحصاد طحال الفئران وإعداد DSM التي تحافظ على الهياكل المجهرية ومكونات ECM.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anesthesia Machine</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>tabletop</td>
			<td>animal anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bubble trap</td>
			<td>Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd.</td>
			<td>pore diameter: 5 &#956;m</td>
			<td>prevent air bubbles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>TIPR Pharmaceutical Responsible Co.,Ltd</td>
			<td></td>
			<td>an analgesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic Forceps</td>
			<td>Shanghai Medical Instruments&#160; Co., Ltd</td>
			<td>J31020</td>
			<td>surgical tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparinized Saline</td>
			<td>SPH No.1 Biochemical &#38; Pharmaceutical Co., LTD&#160;</td>
			<td></td>
			<td>prevent the formation of thrombosis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>RWD life Science Co.</td>
			<td></td>
			<td>anesthetic:for the induction and maintenanceof anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin&#160;</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>C0222</td>
			<td>antibiotics in vitro to prevent microbial contamination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Baoding Longer Precision Pump Co., Ltd.</td>
			<td>BT100-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Shanghai Titan Scientific Co., Ltd.</td>
			<td>4481228</td>
			<td>phosphoric acid buffer salt solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Tube</td>
			<td>Baoding Longer Precision Pump Co., Ltd.</td>
			<td>2.4&#215;0.8mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk Suture</td>
			<td>Yangzhou Jinhuan Medical Instrument Factory</td>
			<td>6-0 and 3-0</td>
			<td>ligate blood vessels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td>Shanghai Titan Scientific Co., Ltd.</td>
			<td>151-21-3</td>
			<td>ionic detergent, dissolves both cell and nuclear membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump</td>
			<td>Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd</td>
			<td>BeneFusion SP5</td>
			<td>intravenous infusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Shanghai Titan Scientific Co., Ltd.</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>non-ionic detergent, disrupts lipid-lipid, lipid-protein, and DNA-protein interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Venous Catheter</td>
			<td>B. Braun Company</td>
			<td>24G</td>
			<td>inserting the spleen artery</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of decellularized spleen matrix derived from rats

زراعة الكبد هي العلاج الأساسي لمرض الكبد في المرحلة النهائية. ومع ذلك ، فإن النقص وعدم كفاية جودة الأعضاء المانحة يستلزمان تطوير علاجات بديلة. ظهرت الكبد الاصطناعي الحيوي (BALs) باستخدام مصفوفة الكبد المنزوعة الخلايا (DLM) كحلول واعدة. ومع ذلك ، لا يزال الحصول على DLMs المناسبة يمثل تحديا. تم استكشاف استخدام مصفوفة الطحال منزوعة الخلايا (DSM) كأساس ل BALs ، مما يوفر بديلا متاحا بسهولة. في هذه الدراسة ، تم حصاد طحال الفئران وإزالة الخلايا باستخدام مزيج من دورات التجميد والذوبان والتروية مع كواشف إزالة الخلايا. حافظ البروتوكول على البنى المجهرية ومكونات المصفوفة خارج الخلية (ECM) داخل DSM. استغرقت عملية إزالة الخلايا الكاملة حوالي 11 ساعة ، مما أدى إلى وجود ECM سليم داخل DSM. أكد التحليل النسيجي إزالة المكونات الخلوية مع الاحتفاظ بهيكل ECM وتكوينه. يوفر البروتوكول المقدم طريقة شاملة للحصول على DSM ، ويقدم تطبيقات محتملة في هندسة أنسجة الكبد والعلاج بالخلايا. تساهم هذه النتائج في تطوير مناهج بديلة لعلاج مرض الكبد في المرحلة النهائية.

Liver transplantation remains the only definitive treatment for end-stage liver disease1,2,3. However, the critical shortage and declining quality of donor organs have heightened the need for alternative treatments4. In the realm of regenerative medicine, bioartificial livers (BALs) utilizing decellularized liver matrix (DLM) have emerged as promising solutions5,6,7. The DLM preserves the original liver structure, including its intricate microvascular network and components of the ECM, offering a scaffold for creating transplantable BALs that could potentially alleviate liver diseases.
Despite the promise, the adoption of this technology faces challenges, particularly in sourcing suitable DLMs. Human-derived DLMs are in short supply, while those from animal sources carry the risks of disease transmission and immune rejection. In an innovative approach, our research has explored the use of a decellularized spleen matrix (DSM) as a foundation for BALs8,9,10,11. Spleens are more readily available in various medical situations, such as portal hypertension, traumatic rupture, idiopathic thrombocytopenic purpura, and donation after cardiac death. Therefore, spleens are more widely available than livers for research purposes. Patients who have undergone splenectomies do not suffer from severe conditions, further confirming the dispensability of the spleen. The microenvironment of the spleen, particularly the extracellular matrix and sinusoids, is similar to that of the liver. This makes the spleen a suitable organ for cell adhesion and proliferation in hepatocyte transplantation research. Based on these findings, our previous investigations have demonstrated that DSMs share comparable microstructures and components with DLMs and can support the survival and function of hepatocytes, including albumin and urea production. Furthermore, DSMs have been shown to enhance the hepatic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells, leading to improved and consistent functionality.
By employing DSMs treated with heparin, we have engineered functional BALs capable of demonstrating effective short-term anticoagulation and partial liver function compensation11. Consequently, this three-dimensional DSM holds significant promise for the advancement of liver tissue engineering and cell therapy. In this work, we present the detailed methods of harvesting rat spleens and preparing DSM that preserve the microstructures and components of the ECM.

تسليط الضوء على المؤلف: استخدام مصفوفة الطحال المنزوعة الخلايا للكبد الاصطناعي الحيوي

تصنيع مصفوفة الطحال منزوعة الخلايا المشتقة من الفئران

We purpose a novel strategy that involves employing a decellularized spleen matrix as an alternative scaffold to bioartificial livers. We showed the detailed procedure of harvesting rat spleen and preparing decellularized spleen matrix that preserves the macrostructures and the components of the extracellular matrix. Our protocol provides a readily available spleen matrix as an alternative to scarce donor livers.Our protocol present a method for the preparation of decellularized spleen matrices. Demonstrating efficiency, stability, and minimal invasiveness, this method maintains the spleen inherent architecture, composition, and the natural vascular network. It offers the scaffold for cell implantation and three-dimensional dynamic culture, thereby establishing a basis for advancing investigations in tissue-engineered liver.

استخدم هذا البروتوكول مزيجا من دورات التجميد والذوبان المتكررة والتروية مع كواشف إزالة الخلايا لإزالة الخلايا من طحال الفئران. تم تحقيق إزالة الخلايا الكاملة للطحال في حوالي 11 ساعة (الشكل 2 أ). طوال عملية إزالة الخلايا ، انتقل لون الطحال تدريجيا من الأحمر الغامق إلى الأحمر...

Watch this Scientific Journal Video about Utilization of Decellularized Spleen Matrix for Bioartificial Livers at JoVE.com

تحمل مصفوفة الطحال منزوعة الخلايا (DSM) تطبيقات واعدة في مجال هندسة أنسجة الكبد. يحدد هذا البروتوكول إجراءات تحضير DSM للفئران ، والتي تشمل حصاد طحال الفئران ، وإزالة الخلايا منها من خلال التروية ، وتقييم DSM الناتج لتأكيد خصائصه.

Liver transplantation is the primary treatment for end-stage liver disease. However, the shortage and inadequate quality of donor organs necessitate the ...

نحن نهدف إلى استراتيجية جديدة تتضمن استخدام مصفوفة الطحال منزوعة الخلايا كسقالة بديلة للكبد الاصطناعي الحيوي. أظهرنا الإجراء التفصيلي لحصاد طحال الفئران وإعداد مصفوفة الطحال منزوعة الخلايا التي تحافظ على الهياكل الكبيرة ومكونات المصفوفة خارج الخلية. يوفر بروتوكولنا مصفوفة طحال متاحة بسهولة كبديل لكبد المتبرعين النادرة.يقدم بروتوكولنا طريقة لإعداد مصفوفات الطحال منزوعة الخلايا. من خلال إظهار الكفاءة والاستقرار والحد الأدنى من التدخل الجراحي ، تحافظ هذه الطريقة على البنية المتأصلة في الطحال وتكوينه وشبكة الأوعية الدموية الطبيعية. إنه يوفر سقالة لزرع الخلايا والثقافة الديناميكية ثلاثية الأبعاد ، وبالتالي إنشاء أساس لتطوير التحقيقات في الكبد المصمم من الأنسجة.

fabrication-of-decellularized-spleen-matrix-derived-from-rats

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fabrication of Decellularized Spleen Matrix Derived from Rats

457 Views.  The First Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University. نحن نهدف إلى استراتيجية جديدة تتضمن استخدام مصفوفة الطحال منزوعة الخلايا كسقالة بديلة للكبد الاصطناعي الحيوي. أظهرنا الإجراء التفصيلي لحصاد طحال الفئران وإعداد مصفوفة الطحال منزوعة الخلايا التي تحافظ على الهياكل الكبيرة ومكونات المصفوفة خارج الخلية. يوفر بروتوكولنا مص?...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: استخدام مصفوفة الطحال المنزوعة الخلايا للكبد الاصطناعي الحيوي

Liver transplantation is the primary treatment for end-stage liver disease. However, the shortage and inadequate quality of donor organs necessitate the development of alternative therapies. Bioartificial livers (BALs) utilizing decellularized liver matrix (DLM) have emerged as promising solutions. However, sourcing suitable DLMs remains challenging. The use of a decellularized spleen matrix (DSM) has been explored as a foundation for BALs, offering a readily available alternative. In this study, rat spleens were harvested and decellularized using a combination of freeze-thaw cycles and perfusion with decellularization reagents. The protocol preserved the microstructures and components of the extracellular matrix (ECM) within the DSM. The complete decellularization process took approximately 11 h, resulting in an intact ECM within the DSM. Histological analysis confirmed the removal of cellular components while retaining the ECM's structure and composition. The presented protocol provides a comprehensive method for obtaining DSM, offering potential applications in liver tissue engineering and cell therapy. These findings contribute to the development of alternative approaches for the treatment of end-stage liver disease.

The decellularized spleen matrix (DSM) holds promising applications in the field of liver tissue engineering. This protocol outlines the procedure for preparing rat DSM, which includes harvesting rat spleens, decellularizing them through perfusion, and evaluating the resulting DSM to confirm its characteristics.