هذا البروتوكول يجعل من الممكن لتطوير السقالات الأوعية الدموية باستخدام الكلى في نموذج الفئران. الكلى هي الجهاز الأكثر ملاءمة لسقالات الخلايا الجذعية المتمايزة. هذا هو بروتوكول ناجح للغاية لdeellularization من الكلى.
يزيل النوى بفعالية مع الحد الأدنى من تدمير البنية الفوقية ECM. يمكن تطبيق هذه التقنية على طب الزرع وهندسة الأنسجة. إثبات الإجراء سيكون كيم جو Hyoung ، دكتوراه في الطب / دكتوراه أستاذ مشارك في الجراحة التجميلية من مختبري.
للبدء، ضع فأر سبراغ دولي البالغ من العمر ثمانية أسابيع على لوحة احترار، وضع مسبار ميزان الحرارة المستقيم في المستقيم لمراقبة درجة الحرارة الأساسية. بعد تخدير الجرذ، وضعه في وضع ية، وتأمين الأطراف الأربعة إلى الطاولة مع الشريط. حلق وتنظيف البطن بالصابون المبيد للجراثيم.
تطبيق 2٪ بيتادين لمدة دقيقة إلى دقيقتين على الأقل, ثم مسح تشغيله مع محلول الإيثانول 70٪. كرر هذا التسلسل ثلاث مرات. غطي الحقل الجراحي بستائر معقمة وناقمة.
إجراء شق البطن العمودي، وفضح الكلى اليسرى، الحالب، الشريان الأورطي البطني، والكافا الوريد السفلي. تشريح الأنسجة قبل قطع باديكل. إعداد 50 ملليلتر من محلول التغلغل لكل فأر عن طريق خلط برنامج تلفزيوني مع ما يقرب من 10 وحدات لكل ملليلتر الهيبارين.
مزيج كميات متساوية من 8٪ PFA مع برنامج تلفزيوني لجعل الحل PFA 4٪. تمديد شق البطن الرأسي cranially، مع التأكد من رسم مقص بعيدا عن الأجهزة عند قطع لتجنب الضرر. مواصلة شق من خلال القفص الصدري، ومن ثم قطع من خلال الحجاب الحاجز عن طريق رفع القص.
تراجع عن رفرف فضفاضة من الجلد للخروج من الطريق مع المشبك أليس، وتحرير القلب عن طريق تمزيق أي النسيج الضام مع ملقط. افتح خط PBS وتأكد من تدفقه قبل وضع الإبرة في البطين الأيسر. عقد القلب بلطف مع ملقط حادة، واستخدام hemostat للسيطرة على الإبرة.
يجب إدخال الإبرة لا يزيد عن ربع بوصة. في حين دعم القلب مع الإبرة والهوموستات، وتحديد موقع الأذين الأيمن، وقص من خلال ذلك مع مقص استئصال القزحية. بقية hemostat على جسم الجرذ، وتأكد من الإبرة لا تزال في وضع داخل القلب.
استمر في ممارسة التشويش على برنامج تلفزيوني لمدة أربع دقائق أو أكثر إذا كان لا يزال هناك دم مرئي في الكلى والكبد. حصاد الكلى اليسرى مع الشريان الأورطي البطني والكافا الوريد السفلي. Ligate الحالب، الشريان الأورطي الصدري، متفوقة فينا كافا، وفروع الشريان الأورطي البطني.
الحفاظ على الجهاز رطب في DPBS في طبق بيتري 10 سم. Cannulate الشريان الأورطي البطني والكافا الوريد السفلي مع قسطرة قياس 23. لإزالة الدم المتبقي، قم بتوصيل القنية بمضخة تمعج، واغسل العضو ب 500 ملليلتر من DPBS و16 وحدة لكل ملليلتر هيبارين لمدة 90 دقيقة عند خمس دورات في الدقيقة و37 درجة مئوية.
لتكبيل الكلى، قم بترطيبها ب 1٪ تريتون X-100 لمدة ثلاث ساعات ثم مع محلول SDS بنسبة 0.75٪ لمدة ست ساعات بضغط مستمر يبلغ 40 ملليلتر من الزئبق. لإزالة SDS المتبقية، قم بثقب العينة بنسبة 1٪ بنسلين في الماء المقطر لمدة 18 ساعة ثم مع DPBS معقم و16 وحدة لكل ملليلتر هيبارين لمدة 90 دقيقة. كان مورفولوجيا الفئران الإجمالية حمراء داكنة.
بعد التفكيك ، أصبحت الكلية شاحبة وشفافة. تم قياس الحمض النووي الجينومي المتبقي كميا في سقالات الكلى المزيلة ومقارنته بالحمض النووي في الكلى الأصلية ، مما يؤكد أن الحمض النووي الجينومي للأنسجة تم القضاء عليه تقريبا بعد إزالة الخلايا. من 14 حالة، كان متوسط محتويات الحمض النووي 115.05 نانوغرام لكل ميكرولتر للتحكم و 1.96 نانوغرام لكل ميكرولتر للسقالة المزيلة.
في المجموع، تمت إزالة 98.3٪ من الحمض النووي. تم الحفاظ على الهيكل ثلاثي الأبعاد ، وتم الحفاظ على الكبيبات اللاخلية في البارينشيما القشرية. عند إدخال الإبرة في البطين الأيسر، يجب إدخالها لا يزيد عن ربع بوصة.
قد يخرج أي إدخال آخر من الجانب الآخر. ونحن على ثقة من أن هذه التقنية ستفتح آفاقا جديدة في مجال هندسة الأنسجة.
