تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82004031) وبرنامج سيتشوان للعلوم والتكنولوجيا (2022NSFSC1303). نعرب عن تقديرنا الكبير لجيايي صن في المعهد المبتكر للطب الصيني والصيدلة ، جامعة تشنغدو للطب الصيني التقليدي ، للمساعدة في اللطخة الغربية.

التحقق من صحة تفاعل Xanthatin-Keap1 مع الإرساء و CETSA

<ol>
	<li>Soleymani, F., Paquet, E., Viktor, H., Michalowski, W., Spinello, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interaction+prediction+with+deep+learning:+A+comprehensive+review.">Protein-protein interaction prediction with deep learning: A comprehensive review.</a> Computat Struct Biotechnol J. 20, 5316-5341 (2022).</li><li>Du, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+protein-ligand+interactions:+mechanisms,+models,+and+methods.">Insights into protein-ligand interactions: mechanisms, models, and methods.</a> Int J Mol Sci. 17 (2), 144 (2016).</li><li>Wu, Q., Peng, Z., Zhang, Y., Yang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COACH-D:+improved+protein-ligand+binding+sites+prediction+with+refined+ligand-binding+poses+through+molecular+docking.">COACH-D: improved protein-ligand binding sites prediction with refined ligand-binding poses through molecular docking.</a> Nucleic Acids Res. 46, W438-W442 (2018).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PROBselect:+accurate+prediction+of+protein-binding+residues+from+proteins+sequences+via+dynamic+predictor+selection.">PROBselect: accurate prediction of protein-binding residues from proteins sequences via dynamic predictor selection.</a> Bioinfo. 36, i735-i744 (2020).</li><li>Kandel, J., Tayara, H., Chong, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PUResNet:+prediction+of+protein-ligand+binding+sites+using+deep+residual+neural+network.">PUResNet: prediction of protein-ligand binding sites using deep residual neural network.</a> J Cheminfo. 13 (1), 65 (2021).</li><li>Dhakal, A., Mckay, C., Tanner, J. J., Cheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+intelligence+in+the+prediction+of+protein-ligand+interactions:+recent+advances+and+future+directions.">Artificial intelligence in the prediction of protein-ligand interactions: recent advances and future directions.</a> Brief Bioinform. 23 (1), 476 (2022).</li><li>Hatty, C. R., Banati, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-ligand+and+membrane-ligand+interactions+in+pharmacology:+the+case+of+the+translocator+protein+(TSPO).">Protein-ligand and membrane-ligand interactions in pharmacology: the case of the translocator protein (TSPO).</a> Pharmacol Res. 100, 58-63 (2015).</li><li>Chaires, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calorimetry+and+thermodynamics+in+drug+design.">Calorimetry and thermodynamics in drug design.</a> Ann Rev Biophys. 37, 135-151 (2008).</li><li>Huang, S. Y., Zou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+challenges+in+protein-ligand+docking.">Advances and challenges in protein-ligand docking.</a> Int J Mo Sci. 11 (8), 3016-3034 (2010).</li><li>Li, J., Fu, A., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+scoring+functions+used+for+protein-ligand+interactions+in+molecular+docking.">An overview of scoring functions used for protein-ligand interactions in molecular docking.</a> Interdiscip Sci. 11 (2), 320-328 (2019).</li><li>Crampon, K., Giorkallos, A., Deldossi, M., Baud, S., Steffenel, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Machine-learning+methods+for+ligand-protein+molecular+docking.">Machine-learning methods for ligand-protein molecular docking.</a> Drug Discov Today. 27 (1), 151-164 (2022).</li><li>Pinzi, L., Rastelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+docking:+Shifting+paradigms+in+drug+discovery.">Molecular docking: Shifting paradigms in drug discovery.</a> Int J Mol Sci. 20 (18), 4331 (2019).</li><li>Abdolmaleki, A., Ghasemi, F., Ghasemi, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer-aided+drug+design+to+explore+cyclodextrin+therapeutics+and+biomedical+applications.">Computer-aided drug design to explore cyclodextrin therapeutics and biomedical applications.</a> Chem Biol Drug Des. 89 (2), 257-268 (2017).</li><li>Chen, G., Seukep, A. J., Guo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+molecular+docking+for+the+research+and+discovery+of+potential+marine+drugs.">Recent advances in molecular docking for the research and discovery of potential marine drugs.</a> Mar Drugs. 18 (11), 545 (2020).</li><li>Li, T., Guo, R., Zong, Q., Ling, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+molecular+docking+in+elaborating+molecular+mechanisms+and+interactions+of+supramolecular+cyclodextrin.">Application of molecular docking in elaborating molecular mechanisms and interactions of supramolecular cyclodextrin.</a> Carbohydr Polym. 276, 118644 (2022).</li><li>Martinez Molina, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+drug+target+engagement+in+cells+and+tissues+using+the+cellular+thermal+shift+assay.">Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay.</a> Science. 341 (6141), 84-87 (2013).</li><li>Tu, Y., Tan, L., Tao, H., Li, Y., Liu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CETSA+and+thermal+proteome+profiling+strategies+for+target+identification+and+drug+discovery+of+natural+products.">CETSA and thermal proteome profiling strategies for target identification and drug discovery of natural products.</a> Phytomedicine. 116, 154862 (2023).</li><li>Dai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontal+cell+biology:+Monitoring+global+changes+of+protein+interaction+states+with+the+proteome-wide+cellular+thermal+shift+assay+(CETSA).">Horizontal cell biology: Monitoring global changes of protein interaction states with the proteome-wide cellular thermal shift assay (CETSA).</a> Annu Rev Biochem. 88, 383-408 (2019).</li><li>Lade, D. M., Nicoletti, R., Mersch, J., Agazie, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+synthesis+of+improved+active-site+SHP2+inhibitors+with+anti-breast+cancer+cell+effects.">Design and synthesis of improved active-site SHP2 inhibitors with anti-breast cancer cell effects.</a> Eur J Med Chem. 247, 115017 (2023).</li><li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+chemical-structure+TPOR+agonist,+TMEA,+promotes+megakaryocytes+differentiation+and+thrombopoiesis+via+mTOR+and+ERK+signalings.">Novel chemical-structure TPOR agonist, TMEA, promotes megakaryocytes differentiation and thrombopoiesis via mTOR and ERK signalings.</a> Phytomedicine. 110, 154637 (2023).</li><li>Mateus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+proteome+profiling+for+interrogating+protein+interactions.">Thermal proteome profiling for interrogating protein interactions.</a> Mol Syst Biol. 16 (3), 9232 (2020).</li><li>Sanchez, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+cellular+thermal+shift+assay+to+monitor+target+engagement.">Real-time cellular thermal shift assay to monitor target engagement.</a> ACS Chem Biol. 17 (9), 2471-2482 (2022).</li><li>Tolvanen, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+advances+in+CETSA.">Current advances in CETSA.</a> Front Mol Biosci. 9, 866764 (2022).</li><li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xanthatin+inhibits+STAT3+and+NF-&#954;B+signalling+by+covalently+binding+to+JAK+and+IKK+kinases.">Xanthatin inhibits STAT3 and NF-&#954;B signalling by covalently binding to JAK and IKK kinases.</a> J Cell Mol Med. 23 (6), 4301-4312 (2019).</li><li>Liu, Y., Chen, W., Zheng, F., Yu, H., Wei, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xanthatin+alleviates+LPS-Induced+inflammatory+response+in+RAW264.7+macrophages+by+Inhibiting+NF-&#954;B,+MAPK+and+STATs+activation.">Xanthatin alleviates LPS-Induced inflammatory response in RAW264.7 macrophages by Inhibiting NF-&#954;B, MAPK and STATs activation.</a> Molecules. 27 (14), 4603 (2022).</li><li>Dinkova-Kostova, A. T., Kostov, R. V., Canning, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keap1,+the+cysteine-based+mammalian+intracellular+sensor+for+electrophiles+and+oxidants.">Keap1, the cysteine-based mammalian intracellular sensor for electrophiles and oxidants.</a> Arch Biochem Biophys. 617, 84-93 (2017).</li><li>Tabana, Y., Babu, D., Fahlman, R., Siraki, A. G., Barakat, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+identification+of+small+molecules:+An+overview+of+the+current+applications+in+drug+discovery.">Target identification of small molecules: An overview of the current applications in drug discovery.</a> BMC Biotechnol. 23 (1), 44 (2023).</li><li>Schenone, M., Dan&#269;&#237;k, V., Wagner, B. K., Clemons, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+identification+and+mechanism+of+action+in+chemical+biology+and+drug+discovery.">Target identification and mechanism of action in chemical biology and drug discovery.</a> Nat Chem Biol. 9 (4), 232-240 (2013).</li><li>Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+early+drug+discovery.">Principles of early drug discovery.</a> Br J Pharmacol. 162 (6), 1239-1249 (2011).</li><li>Chakraborty, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+protein+drug+targets+landscape:+A+potential+pharmacological+insight+view+for+the+new+drug+development.">SARS-CoV-2 protein drug targets landscape: A potential pharmacological insight view for the new drug development.</a> Expert Rev Clin Pharmacol. 14 (2), 225-238 (2021).</li><li>Ziegler, S., Pries, V., Hedberg, C., Waldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+identification+for+small+bioactive+molecules:+Finding+the+needle+in+the+haystack.">Target identification for small bioactive molecules: Finding the needle in the haystack.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 52 (10), 2744-2792 (2013).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+effective+identification+of+drug+targets+at+the+proteome+level+by+pH-dependent+protein+precipitation.">Highly effective identification of drug targets at the proteome level by pH-dependent protein precipitation.</a> Chem Sci. 13 (42), 12403-12418 (2022).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+thermal+proteome+profiling+approach+to+screen+protein+targets+of+a+ligand.">A simplified thermal proteome profiling approach to screen protein targets of a ligand.</a> Proteomics. 20, 1900372 (2020).</li><li>Hou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salidroside+intensifies+mitochondrial+function+of+CoCl2-damaged+HT22+cells+by+stimulating+PI3K-AKT-MAPK+signaling+pathway.">Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway.</a> Phytomedicine. 109, 154568 (2022).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salidroside,+a+phenyl+ethanol+glycoside+from+Rhodiolacrenulata,+orchestrates+hypoxic+mitochondrial+dynamics+homeostasis+by+stimulating+Sirt1/p53/Drp1+signaling.">Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiolacrenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling.</a> J Ethnopharmacol. 293, 115278 (2022).</li></ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

يرتبط تحديد أهداف المرض واكتشاف الأدوية وتطويرها ارتباطا وثيقا27. من خلال استهداف أهداف محددة بدقة ، يمكن تطوير الأدوية المرشحة لعلاج أمراض معينة بشكل أكثر فعالية مع تقليل الآثار الجانبية المرتبطة بالأدوية28,29 في نفس الوقت. الأهداف الأكثر استخ?...

البروتينات هي جزيئات كبيرة الأهمية في الكائنات الحية وتمتلك مجموعة متنوعة من الوظائف الفريدة داخل الخلايا ، مثل تكوين الغشاء ، وتكوين الهيكل الخلوي ، ونشاط الإنزيم ، والنقل ، وإشارات الخلية ، والمشاركة في كل من الآليات داخل الخلايا وخارجها1،2،3. تظهر البروتينات وظائفها البيولوجية في المقام الأول من خلال تفاعلات محددة مع مجموعة متنوعة من الجزيئات ، بما في ذلك البروتينات الأخرى والأحماض النووية وروابط الجزيئات الصغيرة وأيونات المعادن 1,4. الروابط هي مركبات جزيئية صغيرة ترتبط تحديدا بالبروتينات في الكائن الحي. يحدث التفاعل بين البروتينات والروابط في مواقع محددة على البروتين ، تسمى مواقع الربط ، والمعروفة أيضا باسم جيوب الربط5. في أبحاث الكيمياء الطبية ، يكمن التركيز في تحديد البروتينات الرئيسية المرتبطة بوضوح بالأمراض ، والتي تعمل كأهداف للعقاقير6. لذلك ، فإن اكتساب فهم عميق لمواقع الارتباط بين البروتينات والروابط له أهمية قصوى في تعزيز اكتشاف الأدوية وتصميمها والبحثعنها 7,8.
الالتحام الجزيئي هو أداة حسابية مستخدمة على نطاق واسع لدراسة ارتباط البروتين ، والذي يستخدم الهياكل ثلاثية الأبعاد للبروتينات والروابط لاستكشاف أنماط الارتباط الأولية والصلات عند تكوين معقدات مستقرة9،10،11. تطبيق تكنولوجيا الالتحام الجزيئي نشأت في سبعينيات القرن العشرين. استنادا إلى مبدأ القفل والاقتران بالمفاتيح واستخدام خوارزميات برامج الإرساء الجزيئي ، يمكن للمرء تحديد التفاعل بين المركبات والأهداف الجزيئية من خلال تحليل نتائج الإرساء. يتيح هذا النهج التنبؤ بمواقع الارتباط النشطة لكل من المركب والجزيء المستهدف. وبالتالي ، فإنه يسهل تحديد شكل الربط الأمثل (يسمى هنا نموذج الربط) لتفاعلات مستقبلات الرباط ، وهو أمر بالغ الأهمية لفهم آليات هذه الارتباطات الجزيئية12،13،14،15. بينما يوفر الالتحام الجزيئي تنبؤات قيمة قائمة على الكمبيوتر لتفاعلات مستقبلات الرباط ، من المهم ملاحظة أن هذه نتائج أولية. وبالتالي ، فإن المزيد من التحقق التجريبي ضروري لتأكيد هذه التفاعلات.
يعمل اختبار التحول الحراري الخلوي (CETSA) ، الذي اقترحه في البداية فريق بحث Pär Nordlund في عام 2013 ، كطريقة للتحقق من صحة تفاعلات البروتين المستهدف للدواء. تختبر هذه التقنية على وجه التحديد الاستقرار الحراري للبروتينات المستهدفة الناتجة عن ربط الدواء ، مما يوفر نهجا عمليا لتأكيد التفاعلات الجزيئية16،17،18. يعتمد هذا النهج على المبدأ الأساسي القائل بأن ربط الليجند يبدأ تحولا حراريا داخل البروتينات المستهدفة وينطبق على مجموعة واسعة من العينات البيولوجية ، بما في ذلك محللات الخلايا والخلايا الحية السليمة والأنسجة19,20. يدعم CETSA المشاركة المستهدفة المباشرة للجزيئات الصغيرة في الخلايا السليمة عن طريق الكشف عن الاستقرار الديناميكي الحراري للبروتينات بسبب ارتباط الرباط وربط الاستجابة المظهرية المرصودة بالمركب المستهدف21,22. من بين المنهجيات المختلفة المستمدة من CETSA ، يعتبر Western Blot-CETSA (WB-CETSA) نهجا كلاسيكيا. بعد تحضير العينة باستخدام طريقة CETSA ، يتم استخدام تحليل اللطخة الغربية للكشف عن التغيرات في الاستقرار الحراري للبروتين المستهدف. هذا يسمح بالتحديد الدقيق لتفاعلات البروتين الدوائي داخل الأنظمة الخلوية 17,23.
Xanthatin هو مركب نشط بيولوجيا معزول من نبات Xanthium L. مع خصائص مثل المضادة للالتهابات ، والتي تم استخدامها في الطب الصيني التقليدي لعلاج أمراض مثل التهاب الجيوب الأنفية والتهاب المفاصل24,25. البروتين 1 المرتبط ب ech الشبيه ب kelch (Keap1) هو أحد مكونات مركب البروتين متعدد الوحدات متعدد الوحدات Cullin-RING E3 ubiquitin ligase القائم على Cullin3 ومنظم مهم لتوازن الأكسدة والاختزال داخل الخلايا ، والذي يؤثر على شدة ومدة الاستجابة الالتهابية عن طريق تعديل حالة الأكسدة والاختزال داخل الخلايا26. في هذه الدراسة ، استخدمنا أولا الالتحام الجزيئي للتحقيق في التفاعل بين الزانثاتين (جزيء صغير) وبروتين Keap1 ، بهدف التنبؤ بوضع الارتباط الخاص بهما. بعد ذلك ، استخدمنا طريقة CETSA للتحقق من صحة هذا التفاعل من خلال تقييم تأثير الزانثاتين على الاستقرار الحراري لبروتين Keap1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;m Polyvinylidene fluoride membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PR05509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous ethanol</td>
			<td>Chron chemicals</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>BioFroxx</td>
			<td>4240GR100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Broad-spectrum protease inhibitor mixtures</td>
			<td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td>
			<td>AR1193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td>
			<td>PYG0040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enhanced chemiluminescence reagent</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>P0018S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH antibody</td>
			<td>ProteinTech Group Co., Ltd</td>
			<td>10494-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Imaging Instrument</td>
			<td>E-BLOT</td>
			<td>Touch Imager Pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gradient PCR instrument</td>
			<td>Biometra TADVANCED</td>
			<td>Biometra Tadvanced 96SG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed freezing centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Allegra X-30R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase-conjugated affiniPure goat antibody</td>
			<td>ProteinTech Group Co., Ltd</td>
			<td>SA00001-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol&#160;</td>
			<td>Chron chemicals</td>
			<td>67-63-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keap1 antibody</td>
			<td>Zen BioScience Co., Ltd</td>
			<td>R26935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal bath</td>
			<td>Analytik Jena</td>
			<td>TSC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Chron chemicals</td>
			<td>67-56-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ncmblot rapid transfer buffer (20&#215;)</td>
			<td>NCM Biotech Co., Ltd</td>
			<td>WB4600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omni-Easy OneStep PAGE gel fast preparation kie</td>
			<td>Epizyme Biotech Co., Ltd</td>
			<td>PG212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline</td>
			<td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td>
			<td>PYG0021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestained Color Protein Marker</td>
			<td>Biosharp&#160;</td>
			<td>BL741A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Blotting Electrophoresis System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MiniPROTEAN&#210;Tetra Cell</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAW264.7 cell</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>C7505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAW264.7 cell-specific medium</td>
			<td>Procell Life Science&#38;Technology Co., Ltd</td>
			<td>CM-0597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE protein loading buffer</td>
			<td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td>
			<td>AR1112-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE running buffer powder</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G2018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffered saline powder</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>BioFroxx</td>
			<td>1247ML100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>WNE10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water purifier</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Milli- IQ 7005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xanthatin</td>
			<td>ChemConst Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>CONST210706</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protein target prediction and validation of small molecule compound

البروتينات أساسية لعلم وظائف الأعضاء البشرية ، مع أهدافها الحاسمة في البحث وتطوير الأدوية. أصبح تحديد أهداف البروتين الحاسمة والتحقق من صحتها جزءا لا يتجزأ من تطوير الأدوية. الالتحام الجزيئي هو أداة حسابية تستخدم على نطاق واسع للتحقيق في ارتباط البروتين ، خاصة في سياق التفاعلات المستهدفة للدواء والبروتين. للتحقق التجريبي من الربط والوصول إلى ربط الدواء وهدفه مباشرة ، يتم استخدام طريقة مقايسة التحول الحراري الخلوي (CETSA). تهدف هذه الدراسة إلى دمج الالتحام الجزيئي مع CETSA للتنبؤ والتفاعلات بين الأدوية وأهداف البروتين الحيوية والتحقق من صحتها. على وجه التحديد ، توقعنا التفاعل بين بروتين الزانثاتين و Keap1 بالإضافة إلى وضع الربط من خلال تحليل الالتحام الجزيئي ، متبوعا بالتحقق من التفاعل باستخدام مقايسة CETSA. أظهرت نتائجنا أن الزانثاتين يمكن أن ينشئ روابط هيدروجينية مع بقايا أحماض أمينية محددة من بروتين Keap1 ويقلل من الثبات الحراري لبروتين Keap1 ، مما يشير إلى أن الزانثاتين يمكن أن يتفاعل مباشرة مع بروتين Keap1.

Proteins are highly important macromolecules in living organisms and possess a diverse range of unique functions within cells, such as membrane composition, cytoskeleton formation, enzyme activity, transportation, cell signaling, and involvement in both intracellular and extracellular mechanisms1,2,3. Proteins manifest their biological functions primarily through specific interactions with a variety of molecules, including other proteins, nucleic acids, small molecule ligands, and metal ions1,4. Ligands are small molecular compounds that specifically bind to proteins in an organism. The interaction between proteins and ligands occurs at specific sites on the protein, called the binding sites, also known as the binding pockets5. In medicinal chemistry research, the focus lies in identifying key proteins that are clearly associated with diseases, which serve as targets for drugs6. Therefore, gaining a deep understanding of the binding sites between proteins and ligands is of utmost importance in promoting drug discovery, design, and research7,8.
Molecular docking is a widely used computational tool for studying protein-ligand binding, which employs the three-dimensional structures of proteins and ligands to explore their primary binding modes and affinities when forming stable complexes9,10,11. The application of molecular docking technology originated in the 1970s. Based on the lock and key pairing principle and utilizing the algorithms of molecular docking software, one can determine the interaction between compounds and molecular targets by analyzing docking results. This approach enables the prediction of active binding sites for both the compound and the target molecule. Consequently, it facilitates the identification of an optimal binding conformation (here called the binding model) for ligand-receptor interactions, which is crucial for understanding the mechanics of these molecular engagements12,13,14,15. While molecular docking provides valuable computer-based predictions of ligand-receptor interactions, it is important to note that these are preliminary findings. Consequently, further experimental verification is essential to confirm these interactions.
The cellular thermal shift assay (CETSA), initially proposed by P&#228;r Nordlund&#39;s research team in 2013, serves as a method for validating drug-target protein interactions. This technique specifically tests the thermal stability of target proteins induced by drug binding, providing a practical approach for confirming molecular interactions16,17,18. This approach is based on the fundamental principle that ligand binding initiates a thermal shift within target proteins and is applicable to a wide array of biological samples, including cell lysates, intact living cells, and tissues19,20. CETSA supports direct target engagement of small molecules in intact cells by detecting thermodynamic stabilization of proteins due to ligand binding and linking the observed phenotypic response to the target compound21,22. Among the various methodologies derived from CETSA, Western Blot-CETSA (WB-CETSA) is considered a classical approach. Following sample preparation using the CETSA method, western blot analysis is utilized to detect alterations in the thermal stability of the target protein. This allows for the precise determination of drug-protein interactions within cellular systems17,23.
Xanthatin is a bioactive compound isolated from the plant Xanthium L. with properties such as anti-inflammatory, which has been used in traditional Chinese medicine to treat diseases like nasal sinusitis and arthritis24,25. The kelch-like ECH-associated protein 1 (Keap1) is a component of the Cullin3-based Cullin-RING E3 ubiquitin ligase multi-subunit protein complex and an important regulator of intracellular redox homeostasis, which influences the intensity and duration of the inflammatory response by modulating the intracellular redox state26. In this study, we first utilized molecular docking to investigate the interaction between xanthatin (small molecule) and Keap1 protein, aiming to predict their binding mode. Subsequently, we employed the CETSA method to validate this interaction by assessing the impact of xanthatin on the thermal stability of the Keap1 protein.

تسليط الضوء على المؤلف: تبسيط التنبؤ بالهدف البروتيني والتحقق من صحته عبر الالتحام الجزيئي و CETSA

التنبؤ بالبروتين المستهدف والتحقق من صحة مركب الجزيئات الصغيرة

Our research focuses on protein targets, prediction and validation of small molecular compounds. The experiment used here shows a method of molecular docking combined with similar thermal shift assay to predict and validate the interaction between small molecules and protein targets. These steps of CETSA are complicated and any steps errors during the operation can have a great impact on the results.Our protocol combines prediction with verification, effectively reducing both time consumption and economic costs. Furthermore, the experimental instruments and materials are easy to opt in. Finally, the CETSA samples are easy to prepare in test, which ensures the producibility of the samples.

توقع تحليل الالتحام الجزيئي التفاعل بين الزانثاتين وبروتين Keap1. يوضح الشكل 2 تكوين روابط هيدروجينية بين الزانثاتين وبقايا الأحماض الأمينية Gly-367 و Val-606 من بروتين Keap1 ، بطول رابطة هيدروجينية يبلغ 2.17 Å ل Gly-367 و 2.13 Å ل Val-606. بالإضافة إلى ذلك ، تشير درجة الالتحام المحسوبة البالغة -5...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Streamlining Protein Target Prediction and Validation via Molecular Docking and CETSA at JoVE.com

تظهر التجربة المستخدمة هنا طريقة الالتحام الجزيئي جنبا إلى جنب مع مقايسة التحول الحراري الخلوي للتنبؤ والتحقق من التفاعل بين الجزيئات الصغيرة وأهداف البروتين.

Proteins are fundamental to human physiology, with their targets being crucial in research and drug development. The identification and validation of ...

يركز بحثنا على أهداف البروتين والتنبؤ والتحقق من المركبات الجزيئية الصغيرة. تظهر التجربة المستخدمة هنا طريقة للالتحام الجزيئي جنبا إلى جنب مع مقايسة التحول الحراري المماثلة للتنبؤ والتحقق من التفاعل بين الجزيئات الصغيرة وأهداف البروتين. هذه الخطوات من CETSA معقدة وأي خطوات الأخطاء أثناء العملية يمكن أن يكون لها تأثير كبير على النتائج.يجمع بروتوكولنا بين التنبؤ والتحقق ، مما يقلل بشكل فعال من استهلاك الوقت والتكاليف الاقتصادية. علاوة على ذلك ، من السهل اختيار الأدوات والمواد التجريبية. أخيرا ، من السهل تحضير عينات CETSA في الاختبار ، مما يضمن قابلية إنتاج العينات.

protein-target-prediction-and-validation-of-small-molecule-compound

Research

JoVE Journal

Medicine

Protein Target Prediction and Validation of Small Molecule Compound

1.5K Views.  Chengdu University of Traditional Chinese Medicine. يركز بحثنا على أهداف البروتين والتنبؤ والتحقق من المركبات الجزيئية الصغيرة. تظهر التجربة المستخدمة هنا طريقة للالتحام الجزيئي جنبا إلى جنب مع مقايسة التحول الحراري المماثلة للتنبؤ والتحقق من التفاعل بين الجزيئات الصغيرة وأهداف البروتين. هذه الخطوات من CETSA معقدة وأي خطوا?...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: تبسيط التنبؤ بالهدف البروتيني والتحقق من صحته عبر الالتحام الجزيئي و CETSA

Proteins are fundamental to human physiology, with their targets being crucial in research and drug development. The identification and validation of crucial protein targets have become integral to drug development. Molecular docking is a computational tool widely utilized to investigate protein-ligand binding, especially in the context of drug and protein target interactions. For the experimental verification of the binding and to access the binding of the drug and its target directly, the cellular thermal shift assay (CETSA) method is used. This study aimed to integrate molecular docking with CETSA to predict and validate interactions between drugs and vital protein targets. Specifically, we predicted the interaction between xanthatin and Keap1 protein as well as its binding mode through molecular docking analysis, followed by verification of the interaction using the CETSA assay. Our results demonstrated that xanthatin could establish hydrogen bonds with specific amino acid residues of Keap1 protein and reduce the thermostability of Keap1 protein, indicating that xanthatin could directly interact with Keap1 protein.

The experiment used here shows a method of molecular docking combined with cellular thermal shift assay to predict and validate the interaction between small molecules and protein targets.