تم دعم هذا العمل من خلال منح SAAG و SEED من جامعة المحيط الهادئ. نشكر الدكتور ويليام تشان على منح حق الوصول إلى نظام Odyssey Infrared Imaging 205 والدكتور جون ليفيسي لمنحه حق الوصول إلى قارئ لوحة SpectraMax iD3. نشكر الدكتورة ميلاني فيلملي على المشورة الفنية بشأن بروتوكولات.

تم إجراء الدراسة على بموافقة اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام (IACUC) في جامعة المحيط الهادئ (بروتوكولات 19R10 و 22R10). تم استخدام ثمانية ذكور من الفئران عارية athymic الذين تتراوح أعمارهم بين 5-6 أسابيع ، ويزن 20-25 جم ، تم تربيتها مع حمية القوارض المشار إليها وإيوائها في ظروف خالية من مسببات الأمراض (SPF) ، في هذه الدراسة. تم تعقيم الأقفاص والفراش ومياه الشرب وتغييرها بانتظام. يوضح الشكل 1 مخططا لتلقيح الورم في الفئران. انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع المواد والأدوات المستخدمة في هذا البروتوكول.
1. إنشاء MCS ثلاثي الأبعاد لخلايا A549-iRFP
<ol><li>احتضان خلايا A549-iRFP (سرطان الرئة الغدي البشري) في جو مرطب مع 5٪ CO2 عند 37 درجة مئوية وتنميتها في وسط نمو كامل DMEM يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني ، 1٪ بنسلين ستربتومايسين ، و 1 ميكروغرام / مل بوروميسين.</li>
	<li>قم بزرع خلايا A549-iRFP في صفيحة كروية مستديرة القاع ذات 96 بئرا منخفضة للغاية بكثافة بذر تبلغ 4000 خلية / بئر ، باستخدام 100 ميكرولتر من وسط النمو الكامل المكمل ب 0.3٪ كولاجين.</li>
	<li>أجهزة الطرد المركزي الصفائح الدقيقة عند 300 × جم لمدة 7 دقائق عند 4 درجات مئوية لتسهيل تشكيل MCS. فحص مورفولوجيا MCS تحت المجهر لضمان تجميع الخلايا بعد الطرد المركزي.</li>
	<li>بعد 48 ساعة ، أضف 100 ميكرولتر من وسط النمو الكامل إلى كل بئر لتحقيق حجم إجمالي قدره 200 ميكرولتر من وسط النمو لكل بئر.</li>
	<li>استبدل 100 ميكرولتر من وسط النمو في كل بئر بوسط نمو كامل جديد كل يوم.</li>
</ol>2. توصيف A549-iRFP MCS
<ol><li>مراقبة وتصوير مورفولوجيا MCS باستخدام المجهر وتقدير حجم MCS عن طريق المحاكاة باستخدام البرنامج المرجعي من MATLAB بناء على صور مجهر تباين الطور.<ol><li>افتح صورة MCS واحدة في برنامج ImageJ.</li>
		<li>استخدم التحديدات اليدوية لتحديد حافة MCS وإضافتها إلى مدير عائد الاستثمار.</li>
		<li>انقر فوق تحرير | الاختيار | إنشاء قناع.</li>
		<li>انقر فوق تحرير | عكس.</li>
		<li>انقر فوق ملف | حفظ باسم | المشاجرة.</li>
		<li>افتح برنامج ReViSP.</li>
		<li>افتح صورة TIFF المحفوظة بالنقر فوق استعراض.</li>
		<li>انقر فوق ابدأ لإكمال محاكاة MCS.</li>
	</ol></li>
	<li>قم بقياس إشارة الفلورسنت iRFP باستخدام نظام التصوير بالأشعة تحت الحمراء عند قناة 700 نانومتر وحدد كمية إشارة الفلورسنت باستخدام برنامج (على سبيل المثال ، Image Studio).<ol><li>افتح برنامج Image Studio.</li>
		<li>في علامة التبويب القنوات ، حدد 700 والكثافة = 5.</li>
		<li>في علامة التبويب عناصر التحكم في المسح الضوئي ، حدد 84 ميكرومتر، متوسط، 0.0 مم، وانعكاس الصورة. احتفظ بكل شيء آخر كإعداد افتراضي.</li>
		<li>انقر فوق ابدأ لبدء المسح.</li>
	</ol></li>
	<li>تقييم وقياس صلاحية الخلية باستخدام مقايسة صلاحية الخلية 3D وفقا لبروتوكول البائع.</li>
	<li>تقييم وقياس البروتين الخلوي باستخدام مقايسة BCA وفقا لبروتوكول البائع.</li>
</ol>3. اختيار MCS لتلقيح الورم
ملاحظة: بعد أن يتم زرع MCS في صفائح مجهرية كروية وتنمو لمدة 2-3 أسابيع مع تبادل متوسط النمو المنتظم ، حدد MCS مع الخصائص المناسبة التالية لتلقيح الورم.
<ol><li>راقب مورفولوجيا MCS تحت المجهر واختر MCS بشكل دائري مع حواف ناعمة بشكل عام ولكن مع 5-10 براعم خشنة (أسهم في الشكل 2F) وقطر في نطاق 700-800 ميكرومتر.</li>
	<li>قم بقياس مضان iRFP (راجع الخطوة 2.2) وحدد MCS الذي تكون إشاراته الفلورية ضمن انحراف معياري واحد عن المتوسط.</li>
</ol>4. التلقيح MCS داخل الرئة
ملاحظة: استخدم 70٪ رذاذ كحول الأيزوبروبيل لتنظيف المحطة الجراحية والأدوات قبل التعامل مع.
<ol><li>تخدير كل فأر بحقنة IP مقدارها 80 مغ/كغ من الكيتامين و12 مغ/كغ من الزيلازين؛ قرصة أقدام الماوس بالملقط لضمان التخدير الكامل.</li>
	<li>حقن 10 ميكرولتر من هيدروكلوريد البوبرينورفين (0.3 ملغ / مل) تحت الجلد لتقليل الألم.</li>
	<li>ضع مرهم العيون على العينين لمنع الجفاف.</li>
	<li>ضع الماوس في وضع ظهري وقم بتأمين الأطراف في وضع التمدد باستخدام الأشرطة.</li>
	<li>تعقيم الجلد الخلفي مع اليود وعصي مسحة الكحول.</li>
	<li>قطع شق 0.5-1 سم باستخدام مقص جراحي على الجانب الخلفي الأيسر (الشكل 1 ب). استخدم الملقط بعناية لفصل الأنسجة العضلية والدهنية حتى يظهر جدار الصدر وحركة الرئة.</li>
	<li>انقل MCS محددا من طبق دقيق إلى طبق زجاجي بتري يحتوي على برنامج تلفزيوني بارد ، باستخدام ماصة.</li>
	<li>قم بتوصيل إبرة 20 جم على حقنة زجاجية سعة 100 ميكرولتر ، وقم بتبريدها مسبقا على الثلج ، وارسم 20 ميكرولتر من خليط مبرد مسبقا من PBS و Matrigel (1: 1 فولت / فولت).</li>
	<li>استخدم المحقنة لاستنشاق MCS واحد بسرعة من طبق بتري في الحد الأدنى من حجم خليط PBS-Matrigel ، مع الحفاظ على MCS في الجزء المعدني من الإبرة. ملاحظة: حافظ على قبضة محكمة على المحقنة والمكبس لمنع MCS من الانزلاق من الإبرة.</li>
	<li>أدخل الإبرة برفق عموديا بين عظمتي ضلع إلى عمق ~ 3 مم وقم بحقن كل خليط PBS و Matrigel سعة 20 ميكرولتر الذي يحتوي على MCS برفق. ملاحظة: تجنب القوة المفرطة أثناء الإدخال لمنع تلف الرئة أو الأوعية الدموية أو القلب.</li>
	<li>قم بإزالة الإبرة بعناية وتطبيق مرهم مضاد حيوي ثلاثي على الجرح.</li>
	<li>ختم شق مع مقاطع جراحية, التي سيتم إزالتها بعد 2 أسابيع. ملاحظة: لا تقم بخياطة الشق لأن خطوط الخياطة قد تتداخل مع التصوير الفلوري. الفئران العارية قادرة على الشفاء بشكل طبيعي بعد الجراحة.</li>
	<li>ضع على وسادة حرارة بالأشعة تحت الحمراء وقم بتغطيتها بمناديل مختبرية للحفاظ على درجة حرارة الجسم. راقب لمدة 30-60 دقيقة على الأقل حتى يستيقظ ويتحرك بشكل صحيح.</li>
	<li>حقن 10 ميكرولتر من هيدروكلوريد البوبرينورفين (0.3 مجم / مل) تحت الجلد 3 مرات يوميا لأول 48 ساعة لتقليل الألم.</li>
</ol>5. مراقبة ما بعد الجراحة
<ol><li>قياس وزن الجسم كل 3-4 أيام.</li>
	<li>قم بقياس إشارة الفلورسنت iRFP من الطعم الخارجي للورم كل 3-4 أيام على نظام تصوير حيواني صغير عند قناة 700 نانومتر في أربعة أوضاع: اليسار واليمين والظهرية والبطنية ، بينما يتم الاحتفاظ بالفئران تحت التخدير عن طريق استنشاق الأيزوفلوران (معدل التدفق: 1.5-2 لتر / دقيقة أكسجين يحتوي على 1.5٪ إيزوفلوران) على مدى 2-3 دقائق.</li>
	<li>حدد كثافة الفلورسنت الصافية لسرطان الطعم الأجنبي في الجسم الحي باستخدام برنامج (على سبيل المثال ، Image Studio).<ol><li>استخدم مستطيلا ثابتا (A1 ، 200 × 125 بكسل) كنافذة لأخذ العينات لمنطقة صدر الفئران.</li>
		<li>استخدم وظيفة اليد الحرة لتتبع شكل الفئران داخل المستطيل (A1) وقياس شدة الفلورسنت (F1) في المنطقة A1.</li>
		<li>استخدم مستطيلا أصغر آخر (A2 ، 25 × 40 بكسل) لقياس مضان الخلفية (F2) للفئران في منطقة الفخذ.</li>
		<li>استخدم المعادلة (1) لحساب صافي شدة الفلورسنت لسرطان الطعم الأجنبي في كل فأر: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66787/66787eq01.jpg" style="margin: auto;">(1)</li>
	</ol></li>
</ol>

التلقيح داخل الرئة للكرويات متعددة الخلايا لنمذجة NSCLC التقويمية

<ol>
	<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics.">Cancer statistics.</a> CA Cancer J Clin. 70 (1), 7-30 (2020).</li><li>Bray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cancer+statistics+2018:+Globocan+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries.">Global cancer statistics 2018: Globocan estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA Cancer J Clin. 68 (6), 394-424 (2018).</li><li>Travis, W. D., Brambilla, E., Riely, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+pathologic+classification+of+lung+cancer:+Relevance+for+clinical+practice+and+clinical+trials.">New pathologic classification of lung cancer: Relevance for clinical practice and clinical trials.</a> J Clin Oncol. 31 (8), 992-1001 (2013).</li><li>Ducote, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+artificial+intelligence+to+identify+tumor+microenvironment+heterogeneity+in+non-small+cell+lung+cancers.">Using artificial intelligence to identify tumor microenvironment heterogeneity in non-small cell lung cancers.</a> Lab Invest. 103 (8), 100176 (2023).</li><li>Lim, Z. F., Ma, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+insights+of+tumor+heterogeneity+and+drug+resistance+mechanisms+in+lung+cancer+targeted+therapy.">Emerging insights of tumor heterogeneity and drug resistance mechanisms in lung cancer targeted therapy.</a> J Hematol Oncol. 12 (1), 134 (2019).</li><li>Wang, D. C., Wang, W., Zhu, B., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+cancer+heterogeneity+and+new+strategies+for+drug+therapy.">Lung cancer heterogeneity and new strategies for drug therapy.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 58, 531-546 (2018).</li><li>Peterson, J. K., Houghton, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+pharmacology+and+in+vivo+cancer+models+in+preclinical+and+clinical+drug+development.">Integrating pharmacology and in vivo cancer models in preclinical and clinical drug development.</a> Eur J Cancer. 40 (6), 837-844 (2004).</li><li>Madero-Visbal, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+correlates+with+tumor+progression+in+an+orthotopic+mouse+model+of+lung+cancer.">Bioluminescence imaging correlates with tumor progression in an orthotopic mouse model of lung cancer.</a> Surg Oncol. 21 (1), 23-29 (2012).</li><li>Mclemore, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+intrapulmonary+model+for+orthotopic+propagation+of+human+lung+cancers+in+athymic+nude+mice.">Novel intrapulmonary model for orthotopic propagation of human lung cancers in athymic nude mice.</a> Cancer Res. 47 (19), 5132-5140 (1987).</li><li>Zanoni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3d+tumor+spheroid+models+for+in+vitro+therapeutic+screening:+A+systematic+approach+to+enhance+the+biological+relevance+of+data+obtained.">3d tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: A systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained.</a> Sci Rep. 6, 19103 (2016).</li><li>Kim, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+tissue+culture+models+in+cancer+biology.">Three-dimensional tissue culture models in cancer biology.</a> Semin Cancer Biol. 15 (5), 365-377 (2005).</li><li>Chaicharoenaudomrung, N., Kunhorm, P., Noisa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture+systems+as+an+in+vitro+platform+for+cancer+and+stem+cell+modeling.">Three-dimensional cell culture systems as an in vitro platform for cancer and stem cell modeling.</a> World J Stem Cells. 11 (12), 1065-1083 (2019).</li><li>Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opportunities+and+challenges+for+use+of+tumor+spheroids+as+models+to+test+drug+delivery+and+efficacy.">Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy.</a> J Control Release. 164 (2), 192-204 (2012).</li><li>Huang, B. W., Gao, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+3d+cultured+multicellular+spheroid+tumor+models+in+tumor-targeted+drug+delivery+system+research.">Application of 3d cultured multicellular spheroid tumor models in tumor-targeted drug delivery system research.</a> J Control Release. 270, 246-259 (2018).</li><li>Hirschhaeuser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+tumor+spheroids:+An+underestimated+tool+is+catching+up+again.">Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again.</a> J Biotechnol. 148 (1), 3-15 (2010).</li><li>Sethi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3d+tumor+tissue+analogs+and+their+orthotopic+implants+for+understanding+tumor-targeting+of+microenvironment-responsive+nanosized+chemotherapy+and+radiation.">3d tumor tissue analogs and their orthotopic implants for understanding tumor-targeting of microenvironment-responsive nanosized chemotherapy and radiation.</a> Nanomedicine. 11 (8), 2013-2023 (2015).</li><li>Valta, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+culture+of+lucap+136+patient-derived+xenograft+enables+versatile+preclinical+models+of+prostate+cancer.">Spheroid culture of lucap 136 patient-derived xenograft enables versatile preclinical models of prostate cancer.</a> Clin Exp Metastasis. 33 (4), 325-337 (2016).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrapulmonary+inoculation+of+multicellular+spheroids+to+construct+an+orthotopic+lung+cancer+xenograft+model+that+mimics+four+clinical+stages+of+non-small+cell+lung+cancer.">Intrapulmonary inoculation of multicellular spheroids to construct an orthotopic lung cancer xenograft model that mimics four clinical stages of non-small cell lung cancer.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. , 106885 (2020).</li><li>Lemjabbar-Alaoui, H., Hassan, O. U., Yang, Y. W., Buchanan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+cancer:+Biology+and+treatment+options.">Lung cancer: Biology and treatment options.</a> Biochim Biophys Acta. 1856 (2), 189-210 (2015).</li><li>Detterbeck, F. C., Boffa, D. J., Kim, A. W., Tanoue, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+eighth+edition+lung+cancer+stage+classification.">The eighth edition lung cancer stage classification.</a> Chest. 151 (1), 193-203 (2017).</li></ol>

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

يعد بناء A549-iRFP MCS إجراء مختبريا مباشرا وقابلا للتكرار بدرجة كبيرة ويمكن ترجمته إلى تشكيل MCS لخطوط خلايا متعددة. يظهر MCS الذي تم إنشاؤه بمساعدة الطرد المركزي والكولاجين بنية أكثر تكاملا وشبيهة بالورم الصلب في غضون 3-4 أيام. تضمن هذه الطريقة تكوين كرويات قوية تحافظ على هيكلها المتكامل لفترات ط...

من بين جميع اضطرابات الأورام ، لا يتسبب سرطان الرئة في أعلى خسارة في الأرواح فحسب ، بل يدعي أيضا ثاني أكبر عدد من المرضى الجدد كل عام في الولايات المتحدة1. يقف هذا الورم الخبيث المدمر كعقبة رئيسية في الرعاية الصحية الحديثة ، ويحث على فهم أعمق لبيولوجيته المعقدة وطرائق علاجية أكثر فعالية2. يمثل سرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة (NSCLC) 85٪ من سرطان الرئة ويميل إلى التطور إلى أورام صلبة3. أحد أهم التحديات في سرطان الرئة هو البيئة المكروية الديناميكية وغير المتجانسة للورم ، والتي تؤثر بعمق على تطور السرطان واستجاباته للتدخلات العلاجية4،5،6. إن الفهم الأعمق للتفاعل بين الخلايا السرطانية وبيئتها المكروية في مراحل مختلفة من NSCLC يستدعي نماذج مرضية محسنة تلخص السمات النسيجية لتطور NSCLC.
في هذا الصدد ، تظهر النماذج الحيوانية التقويمية كوسيلة واعدة لأبحاث NSCLC. على عكس نماذج xenograft تحت الجلد المستخدمة بشكل شائع7 ، تتميز النماذج التقويمية بالخلايا السرطانية التي يتم تلقيحها مباشرة في العضو الأصلي. بالنسبة لسرطان الرئة ، هذا يعني زرع الخلايا السرطانية مباشرة في أنسجة الرئة 8,9. وبالتالي ، فإن النماذج التقويمية لسرطان الرئة تحاكي بشكل أفضل البيئة المكروية للورم الأصلي ، بما في ذلك الأنسجة والأوعية والمكونات المناعية المجاورة ، وبالتالي تحسين أهميتها الفسيولوجية والسريرية.
تمثل الأجسام الكروية ثلاثية الأبعاد متعددة الخلايا (MCS) نهجا واعدا آخر لتلخيص ميزات بيئة الورم. تتميز معظم أنواع السرطان ببيئتها المكروية المعقدة للورم ، بما في ذلك التفاعلات المختلفة بين الخلايا والخلايا ، والمصفوفة خارج الخلية ، والتدرجات في الأكسجين والمواد المغذية10,11. تفتقر ثقافات الخلايا ثنائية الأبعاد التقليدية إلى التعقيد المكاني والهيكلي لتلخيص هذه الميزات الخاصة بالورم12. في المقابل ، يتميز MCS ذو الحجم المناسب ببنية غير متجانسة مع نواة ناقصة الأكسجين ونخرية ، والتي تلخص ليس فقط البيئة المكروية داخل الورم ولكن أيضا الحاجز الفسيولوجي ضد تغلغل الأدوية ، وهو آلية رئيسية لمقاومة الأدوية في العلاج المضاد للسرطان13،14،15.
بالاستفادة من كل من النماذج الحيوانية التقويمية وتقنيات زراعة MCS ، تم تلقيح MCS للفئران التي تعاني من ضعف المناعة لبناء نماذج تقويم العظام بنجاح لسرطان الثدي وسرطان البروستاتا16,17. هنا ، نبلغ عن المنهجية التفصيلية لبناء وتوصيف نموذج xenograft لتقويم الفئران لسرطان الرئة. تستخدم هذه الطريقة التلقيح داخل الرئة ل 3D MCS المشتق من خلايا سرطان الرئة البشرية الفلورية (A549-iRFP) 18. يوفر هذا النموذج فرصة استثنائية لمراقبة تطور سرطان الرئة في الجسم الحي من خلال مراحل توازي بشكل وثيق المراحل السريرية الأربع ل NSCLC. علاوة على ذلك ، استجاب سرطان xenograft لهذا النموذج لعقار سرطان الرئة المضاد للسرطان المنشأ سريريا ، سيسبلاتين.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 &#181;L Glass Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>Part/REF #80601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 G Needle</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>14 826D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Ultra-Low-Attachment Spheroid Microplate&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15-100-173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549-iRFP</td>
			<td>Imanis Life Sciences&#160;</td>
			<td>CL082-STAN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AIN-93M Mature Rodent Diet&#160;</td>
			<td>Research Diets, Inc.</td>
			<td>D10012M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Athymic Nude Mouse</td>
			<td>Charles River Laboratories, Inc.</td>
			<td>Strain Code: 490; homozygous</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine Hydrochloride</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>NDC Number: 42023-179-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1064401&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT10013CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Cytiva HyClone</td>
			<td>SH3039603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Open source tool (https://imagej.net/ij/)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio&#160;</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>Version 5.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>NDC Number: 17033-0091-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>NDC Number: 50989-0161-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope&#160;</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>Model number: BZ-X710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB-40234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Infrared Imaging 205 System&#160;</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>Model number: 9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT21040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pearl Trilogy small animal imaging system&#160;</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>Model number: 9430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT30002CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>AAJ67236XF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReViSP software from MATLAB&#160;</td>
			<td>Open source tool on Sourceforge (https://sourceforge.net/projects/revisp/)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Clips--AutoClip System</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12020-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>NDC Number: 61133-6017-01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

construction of an orthotopic xenograft model of non-small cell lung cancer mimicking disease progression and predicting drug activities

سرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة (NSCLC) هو مرض مميت للغاية مع بيئة مجهرية معقدة وغير متجانسة للورم. في الوقت الحالي ، لا تلخص النماذج الحيوانية الشائعة القائمة على التلقيح تحت الجلد لمعلقات الخلايا السرطانية البيئة المكروية للورم في NSCLC. هنا نصف نموذج xenograft لسرطان الرئة المتعامد الذي يستخدم التلقيح داخل الرئة للكرويات متعددة الخلايا ثلاثية الأبعاد (MCS). على وجه التحديد ، تم استزراع خلايا NSCLC البشرية الفلورية (A549-iRFP) في صفائح دقيقة منخفضة التعلق 96 جيدا مع الكولاجين لمدة 3 أسابيع لتشكيل MCS ، والتي تم تلقيحها بعد ذلك بشكل تفاعلي في الرئة اليسرى للفئران العارية athymic لإنشاء نموذج سرطان الرئة التقويمي.
بالمقارنة مع خط الخلايا الأصلي A549 ، استجاب MCS لخط الخلايا A549-iRFP بشكل مشابه للأدوية المضادة للسرطان. ترتبط إشارة الفلورسنت ذات الطول الموجي الطويل لخلايا A549-iRFP ارتباطا وثيقا بالعلامات الشائعة لنمو الخلايا السرطانية ، بما في ذلك حجم الكرة ، وصلاحية الخلية ، ومستوى البروتين الخلوي ، مما يسمح بالمراقبة الديناميكية لنمو السرطان في الجسم الحي عن طريق التصوير الفلوري. بعد التلقيح في الفئران ، تقدم A549-iRFP MCS xenograft بشكل موثوق عبر مراحل تشبه إلى حد كبير المراحل السريرية ل NSCLC ، بما في ذلك توسع الورم الرئيسي ، وظهور الأورام الثانوية المجاورة ، ونقائل الخلايا السرطانية إلى الرئة اليمنى المقابلة والأعضاء البعيدة. علاوة على ذلك ، استجاب النموذج لعقار سيسبلاتين القياسي المضاد لسرطان الرئة مع السمية المتوقعة وتطور السرطان الأبطأ. لذلك ، فإن نموذج xenograft التقويمي للفئران من NSCLC سيكون بمثابة منصة لتلخيص تطور المرض وتسهيل تطوير الأدوية المضادة للسرطان المحتملة.

Among all oncological disorders, lung cancer not only inflicts the highest life loss but also claims the second-highest number of new patients every year in the US1. This devastating malignancy stands as a major obstacle in modern healthcare, urging for a deeper understanding of its intricate biology and more efficacious therapeutic modalities2. Non-small cell lung cancer (NSCLC) accounts for 85% of lung cancer and tends to develop into solid tumors3. One of the foremost challenges in lung cancer is the dynamic and heterogeneous tumor microenvironment, which profoundly influences the cancer&#39;s progression and responses to therapeutic interventions4,5,6. A deeper understanding of the interplay between cancer cells and their microenvironment at different stages of NSCLC calls for refined pathological models that recapitulate the histological features of NSCLC progression.
In this regard, orthotopic animal models emerge as a promising avenue for NSCLC research. Unlike commonly employed subcutaneous xenograft models7, orthotopic models feature cancer cells that are directly inoculated into the organ of origin. For lung cancer, this means implanting cancer cells directly into the lung tissue8,9. Consequently, orthotopic models of lung cancer better mimic the native tumor microenvironment, including the neighboring tissues, vessels, and immune components, thus improving their physiological and clinical relevance.
Three-dimensional multicellular spheroids (MCS) represent another promising approach to recapitulating features of the tumor environment. Most cancers are characterized by their complex tumor microenvironment, including the various cell-cell interactions, the extracellular matrix, and the gradients in oxygen and nutrients10,11. Traditional 2D cell cultures lack the spatial and structural complexity to recapitulate these tumor-specific features12. In contrast, MCS of appropriate size feature a heterogeneous structure with a hypoxic and necrotic core, which recapitulates not only the intratumoral microenvironment but also the physiological barrier against drug penetration, which is a major mechanism of drug resistance in anticancer therapy13,14,15.
Taking advantage of both the orthotopic animal models and the MCS culturing techniques, MCS have been inoculated to immune-compromised mice to successfully construct orthotopic models of breast cancer and prostate cancer16,17. Herein, we report the detailed methodology to construct and characterize a murine orthotopic xenograft model of lung cancer. This method employs the intrapulmonary inoculation of 3D MCS derived from fluorescent human lung cancer cells (A549-iRFP)18. This model offers an exceptional opportunity to observe the in vivo progression of lung cancer through stages that closely parallel the four clinical stages of NSCLC. Furthermore, the xenograft cancer of this model responded to the clinically established antilung cancer drug, cisplatin.

تسليط الضوء على المؤلف: إنشاء نموذج لسرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة لتطوير تركيبات نانوية للأدوية المضادة للسرطان

بناء نموذج Xenograft لسرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة الذي يحاكي تطور المرض ويتنبأ بأنشطة الأدوية

Our research focused on developing nanoformulations of anticancer drugs. In order to evaluate anticancer activities, we established this murine non-small cell lung cancer model by inoculation of multicellular spheroids. We aim to validate this model's ability to replicate clinical stages, drug tumor progression, reflux imaging, and response to therapeutic treatments.We aim to establish a more clinically relevant model of non-small cell lung cancer. Traditional model using subcutaneous inoculation of 2D cell suspension lack the fidelity to a tumor microenvironment and disease progression. By utilizing multicellular spheroids and orthotopic inoculation, we bridge this gap, better mimicking non-small cell lung cancer complexity and therapy response.With this orthotopic animal model, we have opened avenues to investigate non-small cell lung cancer tumor microenvironment and screen normal molecule for anticancer activity. Our finding paved the way for deeper exploration into tumor biology and the developments of anticancer therapies.

توصيف A549-iRFP MCS تم استزراع A549-iRFP MCS بنجاح في صفائح كروية بمساعدة الكولاجين والطرد المركزي. عندما وصل MCS إلى قطر حوالي 500 ميكرومتر بعد أسبوع 1 ، تعرض كل من A549 و A549-iRFP MCS لمجموعة متنوعة من الأدوية والتركيبات المضادة للسرطان لمدة 3 أيام ثم تم الاحتفاظ بها في وسط نمو خال من الأدوية لمدة 4 أي...

Read this Scientific Article Protocol about Construction of An Orthotopic Xenograft Model of Non-small Cell Lung Cancer Mimicking Disease Progression and Predicting Drug Activities at JoVE.com

تقدم هذه الدراسة نموذجا لسرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة (NSCLC) يعتمد على التلقيح داخل الرئة للكرويات متعددة الخلايا لخلايا A549-iRFP الفلورية. يلخص النموذج مراحل NSCLC السريرية ويستجيب للسيسبلاتين ، وفقا للمراقبة الديناميكية في الجسم الحي للتألق طويل الطول الموجي.

Non-small cell lung cancer (NSCLC) is a highly lethal disease with a complex and heterogeneous tumor microenvironment. Currently, common animal models ...

construction-an-orthotopic-xenograft-model-non-small-cell-lung-cancer

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Construction of An Orthotopic Xenograft Model of Non-Small Cell Lung Cancer Mimicking Disease Progression and Predicting Drug Activities

648 Views.  University of the Pacific. ركز بحثنا على تطوير تركيبات نانوية للأدوية المضادة للسرطان. من أجل تقييم الأنشطة المضادة للسرطان ، أنشأنا نموذج سرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة عن طريق تلقيح كرويات متعددة الخلايا. نهدف إلى التحقق من قدرة هذا النموذج على تكرار المراحل السريرية ، وتطو?...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: إنشاء نموذج لسرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة لتطوير تركيبات نانوية للأدوية المضادة للسرطان

Non-small cell lung cancer (NSCLC) is a highly lethal disease with a complex and heterogeneous tumor microenvironment. Currently, common animal models based on subcutaneous inoculation of cancer cell suspensions do not recapitulate the tumor microenvironment in NSCLC. Herein we describe a murine orthotopic lung cancer xenograft model that employs the intrapulmonary inoculation of three-dimensional multicellular spheroids (MCS). Specifically, fluorescent human NSCLC cells (A549-iRFP) were cultured in low-attachment 96-well microplates with collagen for 3 weeks to form MCS, which were then inoculated intercostally into the left lung of athymic nude mice to establish the orthotopic lung cancer model.
Compared with the original A549 cell line, MCS of the A549-iRFP cell line responded similarly to anticancer drugs. The long-wavelength fluorescent signal of the A549-iRFP cells correlated strongly with common markers of cancer cell growth, including spheroid volume, cell viability, and cellular protein level, thus allowing dynamic monitoring of the cancer growth in vivo by fluorescent imaging. After inoculation into mice, the A549-iRFP MCS xenograft reliably progressed through phases closely resembling the clinical stages of NSCLC, including the expansion of the primary tumor, the emergence of neighboring secondary tumors, and the metastases of cancer cells to the contralateral right lung and remote organs. Moreover, the model responded to the benchmark antilung cancer drug, cisplatin with the anticipated toxicity and slower cancer progression. Therefore, this murine orthotopic xenograft model of NSCLC would serve as a platform to recapitulate the disease&#39;s progression and facilitate the development of potential anticancer drugs.

This study presents an orthotopic non-small cell lung cancer (NSCLC) model based on intrapulmonary inoculation of multicellular spheroids of fluorescent A549-iRFP cells. The model recapitulates clinical NSCLC stages and responds to cisplatin, according to dynamic in vivo monitoring of long-wavelength fluorescence.

Establishment of 3D Multicellular Spheroids from A549-iRFP Cells for Tumor Inoculation

To begin, establish the three dimensional multicellular spheroids or MCS from human lung adenocarcinoma or A549 iRFP cells. Seed the cells in 96 well ultra-low attachment round bottom spheroid micro plate using 100 microliters of complete growth medium supplemented with 0.3%collagen. Centrifuge the micro plates at 300 G for seven minutes at four degrees Celsius to facilitate the MCS formation.After centrifugation, examine the spheroid morphology under a microscope to ensure cell aggregation. Replace 100 microliters of growth medium in each well with fresh complete growth medium every other day. While observing under a microscope, choose spheroids with a round shape and overall smooth edges, but with five to 10 rough buddings and an appropriate diameter.Measure the iRFP fluorescence to select the MCS with fluorescent signals within one standard deviation of the average.

إنشاء كرويات متعددة الخلايا 3D من خلايا A549-iRFP لتلقيح الورم

Mouse Surgery for Intrapulmonary Inoculation of A549-iRFP Cell-Derived Multicellular Spheroids

Begin the surgical procedure on the properly anesthetized mouse by injecting buprenorphine hydrochloride subcutaneously to reduce the pain. Apply ophthalmic ointment to the eyes to prevent dryness. Place the mouse in a dorsal posture and secure the limbs in a stretching position with tapes.Disinfect the back skin using alternating swabs of iodine and alcohol, at least three times each. Next, using surgical scissors, cut a 0.5-to-one-centimeter incision on the left back side of the animal. Carefully use forceps to separate the muscle and fat tissues until the chest wall and lung motion are visible.Using a pipette, transfer one selected multicellular steroid, or MCS, from a microplate into a glass Petri dish containing ice-cold PBS. Attach a 20-gauge needle to a 100-microliter glass syringe and pre-cool them on ice. Then draw 20 microliters of a pre-cooled mixture of PBS and Matrigel.Use the syringe to quickly aspirate one MCS from the Petri dish in a minimum volume of PBS-Matrigel mixture, keeping the spheroid in the metal part of the needle. Gently insert the needle vertically between two rib bones to a depth of approximately three millimeters and slowly inject all 20 microliters of the mixture containing the aspirated MCS. Then carefully remove the needle.Apply triple antibiotic ointment to the wound. Seal the incision with surgical clips to be removed after two weeks. Place the animal on an infrared heat pad and cover it with laboratory wipes to maintain the body temperature.Monitor the animal for at least 30 to 60 minutes until it wakes up and moves properly. Using a small animal imaging system at a 700-nanometer channel, measure the IRFP fluorescent signal from the tumor xenograft of the anesthetized mouse every three to four days. Measure the fluorescence in four postures, left, right, dorsal and ventral.The net fluorescence intensity from both the left and ventral sides showed a similar trend of tumor progression, with fluorescence from the ventral side growing slightly slower than the fluorescence from the left side.