עבודה זו נתמכה על ידי מענקי SAAG ו- SEED מאוניברסיטת האוקיינוס השקט. אנו מודים לד"ר ויליאם צ'אן על מתן גישה למערכת Odyssey Infrared Imaging 205 ולד"ר ג'ון לייבסי על מתן גישה לקורא הלוחות SpectraMax iD3. אנו מודים לד"ר מלאני פלמלי על הייעוץ הטכני בנוגע לפרוטוקולים של בעלי חיים.

המחקר בבעלי חיים בוצע באישור הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) באוניברסיטת האוקיינוס השקט (פרוטוקולים לבעלי חיים 19R10 ו-22R10). במחקר הנוכחי נעשה שימוש בשמונה עכברים עירומים אתימיים זכרים בגילאי 5-6 שבועות, במשקל 20-25 גרם, שגודלו עם דיאטת המכרסמים הנזכרת ושוכנו בתנאים נטולי פתוגן (SPF). כלובים, מצעים ומי שתייה הוחלפו והוחלפו באופן קבוע. סכמה של חיסון גידולי בעכברים מוצגת באיור 1. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים והמכשירים המשמשים בפרוטוקול זה.
1. הקמת MCS תלת מימדי של תאי A549-iRFP
<ol><li>לדגור על תאי A549-iRFP (אדנוקרצינומה של ריאות אנושיות) באטמוספירה לחה עם 5% CO2 ב-37°C ולגדל אותם ב-DMEM בינוני לצמיחה מלאה המכיל 10% נסיוב בקר עוברי, 1% פניצילין-סטרפטומיצין ו-1 מיקרוגרם/מ"ל פורומיצין.</li>
	<li>זרעו תאי A549-iRFP למיקרו-פלטה ספרואידית בעלת תחתית עגולה של 96 בארות בצפיפות זריעה של 4,000 תאים/באר, תוך שימוש ב-100 מיקרוליטר של מדיום גידול מלא בתוספת 0.3% קולגן.</li>
	<li>צנטריפוגה את microplates ב 300 × גרם במשך 7 דקות ב 4 ° C כדי להקל על היווצרות MCS. בחן את המורפולוגיה של MCS תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח צבירת תאים לאחר צנטריפוגה.</li>
	<li>לאחר 48 שעות, הוסף 100 μL של מדיום צמיחה מלא לכל באר כדי להשיג נפח כולל של 200 μL של מדיום צמיחה לכל באר.</li>
	<li>החלף 100 μL של מדיום גידול בכל באר עם מדיום צמיחה מלא טרי כל יומיים.</li>
</ol>2. אפיון A549-iRFP MCS
<ol><li>התבונן וצלם את המורפולוגיה של MCS באמצעות מיקרוסקופ והערך את נפח MCS על ידי סימולציה עם התוכנה המוזכרת מ- MATLAB בהתבסס על תמונות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה.<ol><li>פתח תמונת MCS אחת בתוכנת ImageJ.</li>
		<li>השתמש בבחירות Freehand כדי לבחור את הקצה של MCS ולהוסיף אותו למנהל החזר ההשקעה.</li>
		<li>לחץ על ערוך | בחירה | צרו מסיכה.</li>
		<li>לחץ על ערוך | הפוך.</li>
		<li>לחץ על קובץ | שמירה בשם | טיף.</li>
		<li>פתח את תוכנת ReViSP.</li>
		<li>פתח את תמונת TIFF שנשמרה על-ידי לחיצה על עיון.</li>
		<li>לחץ על התחל כדי להשלים את סימולציית MCS.</li>
	</ol></li>
	<li>מדוד את האות הפלואורסצנטי iRFP באמצעות מערכת דימות אינפרא אדום בערוץ 700 ננומטר וכמת את האות הפלואורסצנטי באמצעות תוכנה (לדוגמה, Image Studio).<ol><li>תוכנת Open Image Studio.</li>
		<li>בכרטיסיה ערוצים, בחר 700 ועוצמה = 5.</li>
		<li>בכרטיסיה פקדי סריקה , בחר 84 מיקרומטר, בינוני, 0.0 מ"מ והפוך תמונה. שמור את כל השאר כברירת מחדל.</li>
		<li>לחץ על התחל כדי להתחיל בסריקה.</li>
	</ol></li>
	<li>הערך וכמת את כדאיות התא באמצעות בדיקת כדאיות התא התלת-ממדית בהתאם לפרוטוקול הספק.</li>
	<li>להעריך ולכמת חלבון תאי באמצעות בדיקת BCA בהתאם לפרוטוקול הספק.</li>
</ol>3. בחירת MCS לחיסון הגידול
הערה: לאחר ש-MCS נזרעים לתוך מיקרו-צלחות ספרואידיות ומגודלים במשך 2-3 שבועות עם חילופי מדיום גידול קבועים, בחר MCS עם המאפיינים המתאימים הבאים לחיסון הגידול.
<ol><li>התבוננו במורפולוגיה של MCS תחת מיקרוסקופ ובחרו MCS עם צורה עגולה עם קצוות חלקים באופן כללי, אבל עם 5-10 ניצנים מחוספסים (חצים באיור 2F) וקוטר בטווח של 700-800 מיקרומטר.</li>
	<li>מדוד את הפלואורסצנטיות של iRFP (עיין בשלב 2.2) ובחר את MCS שהאותות הפלואורסצנטיים שלו נמצאים בסטיית תקן אחת מהממוצע.</li>
</ol>4. חיסון MCS תוך ריאתי
הערה: יש להשתמש בתרסיס איזופרופיל אלכוהול 70% כדי לנקות את תחנת הניתוח ואת הכלים לפני הטיפול בבעלי החיים.
<ol><li>להרדים כל עכבר בהזרקת IP של 80 מ"ג/ק"ג קטמין ו-12 מ"ג/ק"ג קסילזין; צבטו את רגלי העכבר במלקחיים כדי להבטיח הרדמה מלאה.</li>
	<li>להזריק 10 μL של buprenorphine hydrochloride (0.3 מ"ג / מ"ל) תת עורית כדי להפחית את הכאב.</li>
	<li>החל משחה אופתלמית על העיניים כדי למנוע יובש.</li>
	<li>הניחו את העכבר בתנוחה גבית ואבטחו את הגפיים במצב מתיחה בעזרת קלטות.</li>
	<li>לעקר את העור האחורי עם מקלות יוד ואלכוהול.</li>
	<li>חתכו חתך של 0.5-1 ס"מ באמצעות מספריים כירורגיים בצד שמאל האחורי (איור 1B). השתמש בזהירות במלקחיים כדי להפריד את רקמות השריר והשומן עד שקיר החזה ותנועת הריאות נראים לעין.</li>
	<li>העבירו MCS נבחר אחד ממיקרו-צלחת לצלחת פטרי מזכוכית המכילה PBS קר כקרח, באמצעות פיפטה.</li>
	<li>חברו מחט של 20 גרם למזרק זכוכית של 100 מיקרוליטר, קררו אותם מראש על קרח ושאבו 20 מיקרוליטר של תערובת מקוררת מראש של PBS ומטריג'ל (1:1 v/v).</li>
	<li>השתמש במזרק כדי לשאוף במהירות MCS אחד מצלחת פטרי בנפח מינימלי של תערובת PBS-Matrigel, תוך שמירה על MCS בחלק המתכתי של המחט. הערה: שמור על אחיזה הדוקה במזרק ובבוכנה כדי למנוע מה-MCS להחליק החוצה מהמחט.</li>
	<li>הכנס בעדינות את המחט במאונך בין שתי עצמות צלעות לעומק ~3 מ"מ והזריק לאט את כל תערובת PBS ומטריג'ל 20 μL המכילה את MCS. הערה: יש להימנע משימוש בכוח מופרז במהלך ההחדרה כדי למנוע נזק לריאה, לכלי הדם או ללב.</li>
	<li>בזהירות להסיר את המחט ולהחיל משחה אנטיביוטית משולשת על הפצע.</li>
	<li>לאטום את החתך עם קליפים כירורגיים, אשר יוסרו לאחר 2 שבועות. הערה: אין לתפור את החתך מכיוון שקווי התפרים עלולים להפריע להדמיית פלואורסצנטיות. העכברים העירומים מסוגלים להחלים באופן טבעי לאחר הניתוח.</li>
	<li>הניחו את בעל החיים על כרית חום אינפרא אדום וכסו אותו במגבוני מעבדה כדי לשמור על טמפרטורת הגוף. לפקח על החיה לפחות 30-60 דקות עד שהוא מתעורר ונע כראוי.</li>
	<li>הזריקו 10 μL של buprenorphine hydrochloride (0.3 מ"ג / מ"ל) תת עורית 3 פעמים ביום במשך 48 השעות הראשונות כדי להפחית את הכאב.</li>
</ol>5. ניטור לאחר ניתוח
<ol><li>למדוד את משקל הגוף כל 3-4 ימים.</li>
	<li>מדוד את האות הפלואורסצנטי iRFP מהגידול xenograft כל 3-4 ימים על מערכת הדמיה של בעלי חיים קטנים בערוץ 700 ננומטר בארבע תנוחות: שמאל, ימין, גבי וגחוני, בעוד העכברים נשמרים תחת הרדמה על ידי שאיפת איזופלורן (קצב זרימה: 1.5-2 ליטר / דקה חמצן המכיל 1.5% איזופלורן) במשך 2-3 דקות.</li>
	<li>כמת את העוצמה הפלואורסצנטית נטו של סרטן xenograft in vivo באמצעות תוכנה (למשל, Image Studio).<ol><li>השתמש במלבן קבוע (A1, 200 x 125 פיקסלים) כחלון הדגימה לאזור החזה של העכברים.</li>
		<li>השתמש בפונקציית היד החופשית כדי לעקוב אחר צורת העכברים בתוך המלבן (A1) ולמדוד את עוצמת הפלואורסצנט (F1) באזור A1.</li>
		<li>השתמש במלבן קטן יותר (A2, 25 x 40 פיקסלים) כדי למדוד את פלואורסצנטיות הרקע (F2) של העכברים באזור הירך.</li>
		<li>השתמש במשוואה (1) כדי לחשב את עוצמת הפלואורסצנט נטו של סרטן xenograft בכל עכבר: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66787/66787eq01.jpg" style="margin: auto;">(1)</li>
	</ol></li>
</ol>

חיסון תוך ריאתי של ספרואידים רב תאיים למודל NSCLC אורתוטופי

<ol>
	<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics.">Cancer statistics.</a> CA Cancer J Clin. 70 (1), 7-30 (2020).</li><li>Bray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cancer+statistics+2018:+Globocan+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries.">Global cancer statistics 2018: Globocan estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA Cancer J Clin. 68 (6), 394-424 (2018).</li><li>Travis, W. D., Brambilla, E., Riely, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+pathologic+classification+of+lung+cancer:+Relevance+for+clinical+practice+and+clinical+trials.">New pathologic classification of lung cancer: Relevance for clinical practice and clinical trials.</a> J Clin Oncol. 31 (8), 992-1001 (2013).</li><li>Ducote, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+artificial+intelligence+to+identify+tumor+microenvironment+heterogeneity+in+non-small+cell+lung+cancers.">Using artificial intelligence to identify tumor microenvironment heterogeneity in non-small cell lung cancers.</a> Lab Invest. 103 (8), 100176 (2023).</li><li>Lim, Z. F., Ma, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+insights+of+tumor+heterogeneity+and+drug+resistance+mechanisms+in+lung+cancer+targeted+therapy.">Emerging insights of tumor heterogeneity and drug resistance mechanisms in lung cancer targeted therapy.</a> J Hematol Oncol. 12 (1), 134 (2019).</li><li>Wang, D. C., Wang, W., Zhu, B., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+cancer+heterogeneity+and+new+strategies+for+drug+therapy.">Lung cancer heterogeneity and new strategies for drug therapy.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 58, 531-546 (2018).</li><li>Peterson, J. K., Houghton, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+pharmacology+and+in+vivo+cancer+models+in+preclinical+and+clinical+drug+development.">Integrating pharmacology and in vivo cancer models in preclinical and clinical drug development.</a> Eur J Cancer. 40 (6), 837-844 (2004).</li><li>Madero-Visbal, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+correlates+with+tumor+progression+in+an+orthotopic+mouse+model+of+lung+cancer.">Bioluminescence imaging correlates with tumor progression in an orthotopic mouse model of lung cancer.</a> Surg Oncol. 21 (1), 23-29 (2012).</li><li>Mclemore, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+intrapulmonary+model+for+orthotopic+propagation+of+human+lung+cancers+in+athymic+nude+mice.">Novel intrapulmonary model for orthotopic propagation of human lung cancers in athymic nude mice.</a> Cancer Res. 47 (19), 5132-5140 (1987).</li><li>Zanoni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3d+tumor+spheroid+models+for+in+vitro+therapeutic+screening:+A+systematic+approach+to+enhance+the+biological+relevance+of+data+obtained.">3d tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: A systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained.</a> Sci Rep. 6, 19103 (2016).</li><li>Kim, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+tissue+culture+models+in+cancer+biology.">Three-dimensional tissue culture models in cancer biology.</a> Semin Cancer Biol. 15 (5), 365-377 (2005).</li><li>Chaicharoenaudomrung, N., Kunhorm, P., Noisa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture+systems+as+an+in+vitro+platform+for+cancer+and+stem+cell+modeling.">Three-dimensional cell culture systems as an in vitro platform for cancer and stem cell modeling.</a> World J Stem Cells. 11 (12), 1065-1083 (2019).</li><li>Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opportunities+and+challenges+for+use+of+tumor+spheroids+as+models+to+test+drug+delivery+and+efficacy.">Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy.</a> J Control Release. 164 (2), 192-204 (2012).</li><li>Huang, B. W., Gao, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+3d+cultured+multicellular+spheroid+tumor+models+in+tumor-targeted+drug+delivery+system+research.">Application of 3d cultured multicellular spheroid tumor models in tumor-targeted drug delivery system research.</a> J Control Release. 270, 246-259 (2018).</li><li>Hirschhaeuser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+tumor+spheroids:+An+underestimated+tool+is+catching+up+again.">Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again.</a> J Biotechnol. 148 (1), 3-15 (2010).</li><li>Sethi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3d+tumor+tissue+analogs+and+their+orthotopic+implants+for+understanding+tumor-targeting+of+microenvironment-responsive+nanosized+chemotherapy+and+radiation.">3d tumor tissue analogs and their orthotopic implants for understanding tumor-targeting of microenvironment-responsive nanosized chemotherapy and radiation.</a> Nanomedicine. 11 (8), 2013-2023 (2015).</li><li>Valta, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+culture+of+lucap+136+patient-derived+xenograft+enables+versatile+preclinical+models+of+prostate+cancer.">Spheroid culture of lucap 136 patient-derived xenograft enables versatile preclinical models of prostate cancer.</a> Clin Exp Metastasis. 33 (4), 325-337 (2016).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrapulmonary+inoculation+of+multicellular+spheroids+to+construct+an+orthotopic+lung+cancer+xenograft+model+that+mimics+four+clinical+stages+of+non-small+cell+lung+cancer.">Intrapulmonary inoculation of multicellular spheroids to construct an orthotopic lung cancer xenograft model that mimics four clinical stages of non-small cell lung cancer.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. , 106885 (2020).</li><li>Lemjabbar-Alaoui, H., Hassan, O. U., Yang, Y. W., Buchanan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+cancer:+Biology+and+treatment+options.">Lung cancer: Biology and treatment options.</a> Biochim Biophys Acta. 1856 (2), 189-210 (2015).</li><li>Detterbeck, F. C., Boffa, D. J., Kim, A. W., Tanoue, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+eighth+edition+lung+cancer+stage+classification.">The eighth edition lung cancer stage classification.</a> Chest. 151 (1), 193-203 (2017).</li></ol>

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

הבנייה של A549-iRFP MCS היא הליך מעבדה פשוט וניתן לשכפול וניתן לתרגם אותו להיווצרות MCS עבור קווי תאים מרובים. MCS שנוצר בעזרת צנטריפוגה וקולגן מציג מבנה אינטגרלי יותר דמוי גידול מוצק בתוך 3-4 ימים. שיטה זו מבטיחה היווצרות של ספרואידים חזקים השומרים על המבנה האינטגרלי שלהם לתקופות ממושכות, בדרך כלל ...

מבין כל ההפרעות האונקולוגיות, סרטן הריאות לא רק גורם לאובדן החיים הגבוה ביותר, אלא גם טוען למספר השני בגובהו של חולים חדשים מדי שנה בארה"ב1. ממאירות הרסנית זו עומדת כמכשול מרכזי בשירותי הבריאות המודרניים, ודוחקת להבנה עמוקה יותר של הביולוגיה המורכבת שלה ולשיטות טיפוליות יעילות יותר2. סרטן ריאות מסוג תאים לא קטנים (NSCLC) מהווה 85% ממקרי סרטן הריאה ונוטה להתפתח לגידולים מוצקים3. אחד האתגרים החשובים ביותר בסרטן הריאה הוא המיקרו-סביבה הדינמית וההטרוגנית של הגידול, המשפיעה עמוקות על התקדמות הסרטן ועל תגובותיו להתערבויות טיפוליות 4,5,6. הבנה מעמיקה יותר של יחסי הגומלין בין תאים סרטניים לבין המיקרו-סביבה שלהם בשלבים שונים של NSCLC דורשת מודלים פתולוגיים מעודנים המשחזרים את המאפיינים ההיסטולוגיים של התקדמות NSCLC.
בהקשר זה, מודלים אורתוטופיים של בעלי חיים מתגלים כאפיק מבטיח למחקר NSCLC. בניגוד למודלים תת-עורייםנפוצים של קסנוגרפט 7, מודלים אורתוטופיים כוללים תאים סרטניים המחוסנים ישירות לאיבר המוצא. עבור סרטן ריאות, משמעות הדבר היא השתלת תאים סרטניים ישירות לתוך רקמת הריאה 8,9. כתוצאה מכך, מודלים אורתוטופיים של סרטן ריאות מחקים טוב יותר את המיקרו-סביבה הטבעית של הגידול, כולל הרקמות, כלי הדם והמרכיבים החיסוניים השכנים, ובכך משפרים את הרלוונטיות הפיזיולוגית והקלינית שלהם.
ספרואידים רב-תאיים תלת-ממדיים (MCS) מייצגים גישה מבטיחה נוספת לשחזור תכונות של סביבת הגידול. רוב סוגי הסרטן מאופיינים במיקרו-סביבה הגידולית המורכבת שלהם, כולל אינטראקציות תא-תאים שונות, המטריצה החוץ תאית, והשיפועים בחמצן ובחומרי מזון10,11. תרביות תאים דו-ממדיות מסורתיות חסרות את המורכבות המרחבית והמבנית כדי לשחזר תכונות ספציפיות אלהלגידול 12. לעומת זאת, MCS בגודל המתאים מתאפיין במבנה הטרוגני עם ליבה היפוקסית ונמקית, אשר משחזרת לא רק את המיקרו-סביבה התוך-גידולית אלא גם את המחסום הפיזיולוגי מפני חדירת תרופות, שהוא מנגנון עיקרי של עמידות לתרופות בטיפול אנטי-סרטני 13,14,15.
תוך ניצול המודלים האורתוטופיים של בעלי חיים וטכניקות הטיפוח של MCS, MCS חוסנו לעכברים מדוכאי חיסון כדי לבנות בהצלחה מודלים אורתוטופיים של סרטן השד וסרטן הערמונית16,17. במאמר זה אנו מדווחים על המתודולוגיה המפורטת לבנייה ואפיון של מודל קסנוגרפט אורתוטופי של סרטן ריאות. שיטה זו משתמשת בחיסון תוך-ריאתי של MCS תלת-ממדי שמקורו בתאי סרטן ריאה אנושיים פלואורסצנטיים (A549-iRFP)18. מודל זה מציע הזדמנות יוצאת דופן לצפות בהתקדמות in vivo של סרטן ריאות דרך שלבים המקבילים באופן הדוק לארבעת השלבים הקליניים של NSCLC. יתר על כן, סרטן xenograft של מודל זה הגיב לתרופה נגד סרטן ריאות מבוססת קלינית, cisplatin.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 &#181;L Glass Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>Part/REF #80601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 G Needle</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>14 826D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Ultra-Low-Attachment Spheroid Microplate&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15-100-173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549-iRFP</td>
			<td>Imanis Life Sciences&#160;</td>
			<td>CL082-STAN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AIN-93M Mature Rodent Diet&#160;</td>
			<td>Research Diets, Inc.</td>
			<td>D10012M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Athymic Nude Mouse</td>
			<td>Charles River Laboratories, Inc.</td>
			<td>Strain Code: 490; homozygous</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine Hydrochloride</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>NDC Number: 42023-179-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1064401&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT10013CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Cytiva HyClone</td>
			<td>SH3039603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Open source tool (https://imagej.net/ij/)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio&#160;</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>Version 5.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>NDC Number: 17033-0091-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>NDC Number: 50989-0161-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope&#160;</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>Model number: BZ-X710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB-40234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Infrared Imaging 205 System&#160;</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>Model number: 9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT21040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pearl Trilogy small animal imaging system&#160;</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>Model number: 9430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT30002CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>AAJ67236XF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReViSP software from MATLAB&#160;</td>
			<td>Open source tool on Sourceforge (https://sourceforge.net/projects/revisp/)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Clips--AutoClip System</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12020-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>NDC Number: 61133-6017-01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

construction of an orthotopic xenograft model of non-small cell lung cancer mimicking disease progression and predicting drug activities

סרטן ריאות של תאים לא קטנים (NSCLC) הוא מחלה קטלנית ביותר עם מיקרו-סביבה סרטנית מורכבת והטרוגנית. כיום, מודלים נפוצים של בעלי חיים המבוססים על חיסון תת-עורי של תרחיפים של תאים סרטניים אינם משחזרים את המיקרו-סביבה של הגידול ב- NSCLC. במאמר זה אנו מתארים מודל סרטן ריאות אורתוטופי של מורין המשתמש בחיסון תוך ריאתי של ספרואידים רב-תאיים תלת-ממדיים (MCS). באופן ספציפי, תאי NSCLC אנושיים פלואורסצנטיים (A549-iRFP) גודלו בתרבית במיקרו-צלחות בעלות חיבור נמוך של 96 בארות עם קולגן במשך 3 שבועות כדי ליצור MCS, אשר חוסנו לאחר מכן באופן בין-קוסטלי לתוך הריאה השמאלית של עכברים עירומים אתימיים כדי לבסס את מודל סרטן הריאה האורתוטופי.
בהשוואה לקו התאים המקורי של A549, MCS של קו התאים A549-iRFP הגיב באופן דומה לתרופות נגד סרטן. האות הפלואורסצנטי באורך הגל הארוך של תאי A549-iRFP נמצא בקורלציה חזקה עם סמנים נפוצים של צמיחת תאים סרטניים, כולל נפח ספרואידים, כדאיות התא ורמת החלבון התאי, ובכך מאפשר ניטור דינמי של צמיחת הסרטן in vivo על ידי הדמיה פלואורסצנטית. לאחר החיסון לעכברים, A549-iRFP MCS xenograft התקדם באופן אמין דרך שלבים דומים מאוד לשלבים הקליניים של NSCLC, כולל הרחבת הגידול הראשוני, הופעתם של גידולים משניים שכנים, וגרורות של תאים סרטניים לריאה הימנית הנגדית ולאיברים מרוחקים. יתר על כן, המודל הגיב לתרופה נגד סרטן ריאות, ציספלטין עם הרעילות הצפויה והתקדמות סרטן איטית יותר. לכן, מודל קסנוגרפט אורתוטופי זה של NSCLC ישמש פלטפורמה לשחזור התקדמות המחלה ולהקל על פיתוח תרופות אנטי-סרטניות פוטנציאליות.

Among all oncological disorders, lung cancer not only inflicts the highest life loss but also claims the second-highest number of new patients every year in the US1. This devastating malignancy stands as a major obstacle in modern healthcare, urging for a deeper understanding of its intricate biology and more efficacious therapeutic modalities2. Non-small cell lung cancer (NSCLC) accounts for 85% of lung cancer and tends to develop into solid tumors3. One of the foremost challenges in lung cancer is the dynamic and heterogeneous tumor microenvironment, which profoundly influences the cancer&#39;s progression and responses to therapeutic interventions4,5,6. A deeper understanding of the interplay between cancer cells and their microenvironment at different stages of NSCLC calls for refined pathological models that recapitulate the histological features of NSCLC progression.
In this regard, orthotopic animal models emerge as a promising avenue for NSCLC research. Unlike commonly employed subcutaneous xenograft models7, orthotopic models feature cancer cells that are directly inoculated into the organ of origin. For lung cancer, this means implanting cancer cells directly into the lung tissue8,9. Consequently, orthotopic models of lung cancer better mimic the native tumor microenvironment, including the neighboring tissues, vessels, and immune components, thus improving their physiological and clinical relevance.
Three-dimensional multicellular spheroids (MCS) represent another promising approach to recapitulating features of the tumor environment. Most cancers are characterized by their complex tumor microenvironment, including the various cell-cell interactions, the extracellular matrix, and the gradients in oxygen and nutrients10,11. Traditional 2D cell cultures lack the spatial and structural complexity to recapitulate these tumor-specific features12. In contrast, MCS of appropriate size feature a heterogeneous structure with a hypoxic and necrotic core, which recapitulates not only the intratumoral microenvironment but also the physiological barrier against drug penetration, which is a major mechanism of drug resistance in anticancer therapy13,14,15.
Taking advantage of both the orthotopic animal models and the MCS culturing techniques, MCS have been inoculated to immune-compromised mice to successfully construct orthotopic models of breast cancer and prostate cancer16,17. Herein, we report the detailed methodology to construct and characterize a murine orthotopic xenograft model of lung cancer. This method employs the intrapulmonary inoculation of 3D MCS derived from fluorescent human lung cancer cells (A549-iRFP)18. This model offers an exceptional opportunity to observe the in vivo progression of lung cancer through stages that closely parallel the four clinical stages of NSCLC. Furthermore, the xenograft cancer of this model responded to the clinically established antilung cancer drug, cisplatin.

מחבר זרקור: הקמת מודל סרטן ריאות של תאים לא קטנים לפיתוח ננו-פורמולציות של תרופות אנטי-סרטניות

בניית מודל קסנוגרפט אורתוטופי של סרטן ריאה מסוג תאים לא קטנים המחקה את התקדמות המחלה ומנבא פעילויות תרופתיות

Our research focused on developing nanoformulations of anticancer drugs. In order to evaluate anticancer activities, we established this murine non-small cell lung cancer model by inoculation of multicellular spheroids. We aim to validate this model's ability to replicate clinical stages, drug tumor progression, reflux imaging, and response to therapeutic treatments.We aim to establish a more clinically relevant model of non-small cell lung cancer. Traditional model using subcutaneous inoculation of 2D cell suspension lack the fidelity to a tumor microenvironment and disease progression. By utilizing multicellular spheroids and orthotopic inoculation, we bridge this gap, better mimicking non-small cell lung cancer complexity and therapy response.With this orthotopic animal model, we have opened avenues to investigate non-small cell lung cancer tumor microenvironment and screen normal molecule for anticancer activity. Our finding paved the way for deeper exploration into tumor biology and the developments of anticancer therapies.

אפיון MCS A549-iRFP A549-iRFP MCS תורבתו בהצלחה במיקרו-צלחות ספרואידים בעזרת קולגן וצנטריפוגה. כאשר MCS הגיע לקוטר של כ-500 מיקרומטר לאחר שבוע אחד, הן A549 והן A549-iRFP MCS נחשפו למגוון תרופות ותכשירים נגד סרטן במשך 3 ימים ולאחר מכן נשמרו במדיום גידול ללא תרופות במשך 4 ימים נוספים. A549-iRFP MCS הציג דפוס תגו...

Read this Scientific Article Protocol about Construction of An Orthotopic Xenograft Model of Non-small Cell Lung Cancer Mimicking Disease Progression and Predicting Drug Activities at JoVE.com

מחקר זה מציג מודל אורתוטופי של סרטן ריאות מסוג תאים לא קטנים (NSCLC) המבוסס על חיסון תוך ריאתי של ספרואידים רב-תאיים של תאי A549-iRFP פלואורסצנטיים. המודל משחזר שלבים קליניים של NSCLC ומגיב לציספלטין, על פי ניטור דינמי in vivo של פלואורסצנטיות באורך גל ארוך.

Non-small cell lung cancer (NSCLC) is a highly lethal disease with a complex and heterogeneous tumor microenvironment. Currently, common animal models ...

construction-an-orthotopic-xenograft-model-non-small-cell-lung-cancer

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Construction of An Orthotopic Xenograft Model of Non-Small Cell Lung Cancer Mimicking Disease Progression and Predicting Drug Activities

648 Views.  University of the Pacific. המחקר שלנו התמקד בפיתוח ננו-פורמולציות של תרופות אנטי-סרטניות. על מנת להעריך פעילויות אנטי-סרטניות, ביססנו את מודל סרטן הריאה של תאים לא קטנים על ידי חיסון של ספרואידים רב-תאיים. אנו שואפים לאמת את יכולתו של מודל זה לשכפל שלבים קליניים, התקדמות גידול תרופת...

Video: מחבר זרקור: הקמת מודל סרטן ריאות של תאים לא קטנים לפיתוח ננו-פורמולציות של תרופות אנטי-סרטניות

Non-small cell lung cancer (NSCLC) is a highly lethal disease with a complex and heterogeneous tumor microenvironment. Currently, common animal models based on subcutaneous inoculation of cancer cell suspensions do not recapitulate the tumor microenvironment in NSCLC. Herein we describe a murine orthotopic lung cancer xenograft model that employs the intrapulmonary inoculation of three-dimensional multicellular spheroids (MCS). Specifically, fluorescent human NSCLC cells (A549-iRFP) were cultured in low-attachment 96-well microplates with collagen for 3 weeks to form MCS, which were then inoculated intercostally into the left lung of athymic nude mice to establish the orthotopic lung cancer model.
Compared with the original A549 cell line, MCS of the A549-iRFP cell line responded similarly to anticancer drugs. The long-wavelength fluorescent signal of the A549-iRFP cells correlated strongly with common markers of cancer cell growth, including spheroid volume, cell viability, and cellular protein level, thus allowing dynamic monitoring of the cancer growth in vivo by fluorescent imaging. After inoculation into mice, the A549-iRFP MCS xenograft reliably progressed through phases closely resembling the clinical stages of NSCLC, including the expansion of the primary tumor, the emergence of neighboring secondary tumors, and the metastases of cancer cells to the contralateral right lung and remote organs. Moreover, the model responded to the benchmark antilung cancer drug, cisplatin with the anticipated toxicity and slower cancer progression. Therefore, this murine orthotopic xenograft model of NSCLC would serve as a platform to recapitulate the disease&#39;s progression and facilitate the development of potential anticancer drugs.

This study presents an orthotopic non-small cell lung cancer (NSCLC) model based on intrapulmonary inoculation of multicellular spheroids of fluorescent A549-iRFP cells. The model recapitulates clinical NSCLC stages and responds to cisplatin, according to dynamic in vivo monitoring of long-wavelength fluorescence.

Establishment of 3D Multicellular Spheroids from A549-iRFP Cells for Tumor Inoculation

To begin, establish the three dimensional multicellular spheroids or MCS from human lung adenocarcinoma or A549 iRFP cells. Seed the cells in 96 well ultra-low attachment round bottom spheroid micro plate using 100 microliters of complete growth medium supplemented with 0.3%collagen. Centrifuge the micro plates at 300 G for seven minutes at four degrees Celsius to facilitate the MCS formation.After centrifugation, examine the spheroid morphology under a microscope to ensure cell aggregation. Replace 100 microliters of growth medium in each well with fresh complete growth medium every other day. While observing under a microscope, choose spheroids with a round shape and overall smooth edges, but with five to 10 rough buddings and an appropriate diameter.Measure the iRFP fluorescence to select the MCS with fluorescent signals within one standard deviation of the average.

הקמת ספרואידים רב-תאיים תלת-ממדיים מתאי A549-iRFP לחיסון גידולים

Mouse Surgery for Intrapulmonary Inoculation of A549-iRFP Cell-Derived Multicellular Spheroids

Begin the surgical procedure on the properly anesthetized mouse by injecting buprenorphine hydrochloride subcutaneously to reduce the pain. Apply ophthalmic ointment to the eyes to prevent dryness. Place the mouse in a dorsal posture and secure the limbs in a stretching position with tapes.Disinfect the back skin using alternating swabs of iodine and alcohol, at least three times each. Next, using surgical scissors, cut a 0.5-to-one-centimeter incision on the left back side of the animal. Carefully use forceps to separate the muscle and fat tissues until the chest wall and lung motion are visible.Using a pipette, transfer one selected multicellular steroid, or MCS, from a microplate into a glass Petri dish containing ice-cold PBS. Attach a 20-gauge needle to a 100-microliter glass syringe and pre-cool them on ice. Then draw 20 microliters of a pre-cooled mixture of PBS and Matrigel.Use the syringe to quickly aspirate one MCS from the Petri dish in a minimum volume of PBS-Matrigel mixture, keeping the spheroid in the metal part of the needle. Gently insert the needle vertically between two rib bones to a depth of approximately three millimeters and slowly inject all 20 microliters of the mixture containing the aspirated MCS. Then carefully remove the needle.Apply triple antibiotic ointment to the wound. Seal the incision with surgical clips to be removed after two weeks. Place the animal on an infrared heat pad and cover it with laboratory wipes to maintain the body temperature.Monitor the animal for at least 30 to 60 minutes until it wakes up and moves properly. Using a small animal imaging system at a 700-nanometer channel, measure the IRFP fluorescent signal from the tumor xenograft of the anesthetized mouse every three to four days. Measure the fluorescence in four postures, left, right, dorsal and ventral.The net fluorescence intensity from both the left and ventral sides showed a similar trend of tumor progression, with fluorescence from the ventral side growing slightly slower than the fluorescence from the left side.