이 연구를 가능하게 한 자금 지원(프로젝트 J-001843 및 J-002021)에 대해 캐나다 농업 및 농식품부(Agriculture and Agri-Food Canada)에 감사드립니다. 이 프로토콜의 비디오 콘텐츠를 촬영해 주신 Brett van Heyningen에게 감사드립니다. 또한 이 원고에 설명된 방법에 대한 통찰력을 제공한 이전 대학원생(Jennifer Vacon과 Mark Nabuurs)에게도 감사드립니다.

이 연구에 사용된 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.
1. 미생물 생물방제 후보 물질 선정
<ol><li>competition plate assay를 사용하여 관심 병원체에 대한 길항 작용을 나타내는 미생물 분리체를 선택합니다. 참고: 이 프로토콜을 입증하기 위해 S. sclerotiorum에 대해 길항작용을 보이는 9개의 바실러스 분리체(Bacillus atrophaeus, mojavensis 및 subtilis 종을 포함)를 선택했습니다.</li>
</ol>2. 미디어 준비
<ol><li>물 1리터당 39g의 배지를 녹여 감자 포도당 한천(PDA)을 준비합니다.</li>
	<li>물 1리터당 45g의 매체를 추가하여 슈도모나스 F 한천을 준비합니다.</li>
	<li>1g의 매체와 물 1리터당 24g의 한천을 추가하여 0.24% 한천으로 감자 포도당 육수(PDB)를 준비합니다.</li>
	<li>효모-포도당-망간(YGM) 육수를 준비합니다. 100mL의 물에 2.5g의 KH2PO4 및 2.5 g K2HPO4로 구성된 완충 용액과 0.58g의 MnSO4로 구성된 염 용액을 만듭니다. H20, 0.5g의 NaCl 및 0.05g의 FeSO4.7H 2 0 100mL의 물.<ol><li>다음으로 효모 추출물 1g, 포도당 1.25g, 물 400mL, 완충 용액 5mL, 소금 용액 5mL 및 물 90mL를 넣어 금속염이 용액에 침전되지 않도록 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>매체를 고압 멸균하고 한천을 100 x 15mm 페트리 플레이트에 붓고 사용하기 전에 모두 실온으로 냉각시킵니다.</li>
</ol>3. 병원균 준비
<ol><li>PDA에서 Sclerotinia sclerotiorum 5접시를 배양하고(2.1단계에서 준비) 25°C에서 3일 동안 배양합니다.</li>
</ol>4. 천연물 추출물 준비
<ol><li>슈도모나스 F 한천(2.2단계에서 준비)에서 각 박테리아 분리물을 배양하고 개별 콜로니가 관찰될 때까지 성장시킵니다.</li>
	<li>단일 박테리아 콜로니를 원심분리기 또는 배양 튜브에서 25mL의 YGM 배지에 하위 배양하고 3일 동안 진탕하여 배양합니다.</li>
	<li>각 추출물의 부분 표본 5mL를 YGM 1L에 옮기고 동일한 조건에서 3일 더 배양합니다.</li>
	<li>각 배양액을 3000 x g 에서 25°C에서 15분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다.</li>
	<li>배양 배지에서 대사 산물을 추출하기 위해 에틸 아세테이트로 상층액을 세 번 디캔팅하고 세척합니다.</li>
	<li>회전 증발을 사용하여 각각의 에틸 아세테이트 층을 결합하고 건조시킵니다.</li>
	<li>추출물을 최소한의 메탄올에 다시 용해시키고 작은 섬광 바이알로 옮긴 다음 회전 증발로 다시 건조시킵니다. 알림: 추출물이 유성 또는 수지 물질로 건조되는 경우 재료를 동결건조하여 정확하게 계량할 수 있는 건조 분말을 얻으십시오.</li>
</ol>5. TLC 플레이트 준비
<ol><li>20cm x 20cm TLC 플레이트를 플레이트 하단에서 2cm, 상단에서 2cm 선을 그려 준비합니다. 맨 아래 줄에 2cm 간격으로 9개의 점을 놓습니다. 맨 위 선 위에 4cm 간격으로 4개의 점을 놓습니다.</li>
	<li>각 추출물 5mg을 메탄올 15μL에 녹이고 피펫을 사용하여 맨 아래 선에 표시된 9개의 점에 각 추출물 5μL를 적용합니다. TLC 플레이트에서 각 추출물 반점을 건조시키고 동일한 반점에 5μL 부분 표본을 더 적용합니다. 모든 재료가 TLC 플레이트에 적재될 때까지 반복합니다.</li>
	<li>디클로로메탄과 메탄올의 1:2 용액을 사용하여 개발 탱크에서 TLC 플레이트를 개발하여 용매가 플레이트 상단에서 2cm(약 45분)로 표시된 선에 도달할 때까지 개발합니다.</li>
	<li>현상이 완료되면 TLC 플레이트를 제거하고 용매 라인 위에 표시된 4개의 점에 일련의 포지티브 컨트롤을 적용합니다. 동일한 대조군의 4가지 농도가 사용됩니다. S. scl. 의 경우 0.5μg/mL, 5μg/mL, 50μg/mL 및 500μg/mL의 Hygromycin B가 양성 대조군입니다.</li>
	<li>플레이트에서 모든 용매가 증발하기 전에 에탄올 멸균 TLC 플레이트 상자에 넣으십시오.</li>
</ol>6. 직접 생체 자폐 분석
<ol><li>은박지로 덮인 큰 비커에 분석에 사용할 재료(크로마토그래피 분무기의 유리 구성 요소, 금속 주걱, 종이 타월 4장, 셀룰로오스 또는 여과지, 물 및 매체)를 고압멸균합니다. 알림: 종이 재료(종이 타월, 셀룰로오스 종이)는 오토클레이브에 젖지 않도록 은박지로 싸야 합니다.</li>
	<li>에탄올 멸균 PTFE 튜브를 사용하여 공기 공급원, 압력 게이지 및 크로마토그래피 분무기를 연결합니다. 크로마토그래피 분무기와 압력 게이지 사이에 HEPA 필터를 연결합니다.</li>
	<li>멸균 금속 주걱을 사용하여 5개의 병원체 플레이트의 균사체 매트를 멸균 주걱을 사용하여 50mL 원심분리 튜브에 수집합니다. 알림: 필요한 경우 균사체를 제거하는 데 도움이 되도록 소량의 액체 육수를 사용하고 멸균 피펫으로 옮깁니다.</li>
	<li>한천 및 멸균 유리 비드로 수정된 PDB 25mL를 50mL 원심분리 튜브에 넣고 5분 동안 와류하여 균사체 매트를 분해합니다.</li>
	<li>바늘 끝이 있는 멸균 주사기를 사용하여 균사체 현탁액을 크로마토그래피 분무기로 옮기면 큰 균사체 조각이 크로마토그래피 분무기가 막히지 않도록 합니다.</li>
	<li>이전에 개발된 TLC 플레이트를 층류 후드의 멸균 종이 타월에 올려 미디어 서스펜션을 적용하는 동안 플레이트와의 손 접촉을 줄입니다.</li>
	<li>공기 압력을 약 4bar로 높이고 TLC 플레이트에 서스펜션을 세 번 코팅하여 플레이트가 적용 사이에 완전히 건조되도록 합니다. 참고: 3개의 레이어가 최적의 양으로 확인되었습니다. 이보다 적으면 병원체가 자랄 수 있는 충분한 매체가 없습니다. 또한 매체가 너무 두꺼워 활성 대사 산물과 병원체가 접촉할 수 없습니다.</li>
	<li>멸균된 플라스틱 플레이트 상자에 멸균수 500mL를 넣고 멸균된 접힌 셀룰로오스 시트 또는 여과지를 양쪽에 놓아 수분을 유지합니다.</li>
	<li>완성된 분석 플레이트를 상자에 있는 4개의 빈 페트리 접시에 놓습니다.</li>
	<li>3일에서 1주일 동안 또는 양성 대조군 및 억제 영역(ZOI) 주변을 제외하고 TLC 플레이트 전체에 균사체의 균일한 층이 고르게 자랄 때까지 분석을 배양합니다.</li>
</ol>7. 액체 크로마토그래피 질량 분석
<ol><li>사진을 사용하여 완료된 분석을 이미지화합니다.</li>
	<li>하단 라인에서 ZOI까지의 거리를 하단 라인에서 상단 라인까지의 거리로 나누어 각 금지 영역에 대한 유지 계수를 계산합니다.</li>
	<li>억제 영역에서 실리카를 긁어내어 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다.</li>
	<li>각 튜브와 와류에 500μL의 메탄올을 첨가하여 실리카에서 대사 산물을 추출합니다.</li>
	<li>20°C에서 8,500 x g 으로 10분 동안 원심분리하고 상층액을 작은 바이알에 옮깁니다.</li>
	<li>회전 증발 또는 질소 흐름에 의해 건조로 증발합니다.</li>
	<li>LC 바이알의 메탄올 50μL에 추출물을 다시 현탁시킵니다.</li>
	<li>LC-MS에 의한 억제 영역의 대사 산물을 분석하고 이를 미가공 추출물의 대사 산물과 비교하여 미가공 추출물의 어떤 대사 산물이 병원체의 억제를 담당하는지 확인합니다16.</li>
	<li>원본 미생물의 속과 종, ZOI에서 확인된 질량을 사용하여 문헌 및 Antibase 및 Dictionary of Natural Products와 같은 관련 데이터베이스를 검색하여 대사 산물을 식별합니다.</li>
</ol>

TLC-Direct Bioautography Assay를 사용하여 생물 방제를 위한 천연 제품 식별

<ol>
	<li>Fisher, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+fungal+threats+to+animal,+plant+and+ecosystem+health.">Emerging fungal threats to animal, plant and ecosystem health.</a> Nature. 484 (7393), 186-194 (2012).</li><li>Savary, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+burden+of+pathogens+and+pests+on+major+food+crops.">The global burden of pathogens and pests on major food crops.</a> Nat Ecol Evol. 3 (3), 430-439 (2019).</li><li>Lin, B. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biopesticides+as+a+promising+alternative+to+synthetic+pesticides:+A+case+for+microbial+pesticides,+phytopesticides,+and+nanobiopesticides.">Biopesticides as a promising alternative to synthetic pesticides: A case for microbial pesticides, phytopesticides, and nanobiopesticides.</a> Front. Microbiol. 14, 1040901 (2023).</li><li>Abdelaziz, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocontrol+of+soil+borne+diseases+by+plant+growth+promoting+rhizobacteria.">Biocontrol of soil borne diseases by plant growth promoting rhizobacteria.</a> Trop. 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Susan Boyetchko 박사는 이 작품이 제출되기 전에 세상을 떠났습니다(2023년 2월 8일). 다른 모든 저자는 이해 상충이 없다고 선언했습니다.

TLC-DB는 가치 있고 잘 정립된 NP 연구 도구이며 마이크로플레이트 생물학적 검정 유도 분리 방법에 대한 간단하고 저렴한 대안입니다17. 액체 크로마토그래피 기술을 사용하여 대사 산물 분리가 필요한 마이크로플레이트 분석에 비해 최소한의 시간과 재료 자원이 필요합니다. 효소 억제제 18,19,20,21,22,23 외에도 항균, 항진균, 항기생충 및 항산화 NP를 검출하는 데 사용할 수 있는 매우 다재다능한 분석법입니다. 생체 활성 식물 화학 물질을 검출하고 식별하는 데 가장 일반적으로 사용되지만, 이 프로토콜18에서 탐구된 바와 같이 박테리아 NP에 동일한 방법을 적용할 수 있습니다. 또한 이 프로토콜은 새로운 생체 활성 NP를 발견하고 평가하는 데 도움이 되도록 다양한 NP 소스 및 표적 병원체와 함께 사용하도록 최적화할 수 있습니다.
박테리아 성장에 사용되는 배지와 추출에 사용되는 용매는 천연 제품 발견 결과에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용된 배지는 슈도모나스(Pseudomonas ) 및 바실러스 종(Bacillus spp)을 포함한 고리형 리포펩타이드를 생성하는 박테리아에 최적화되어 있습니다. 그러나 다른 속을 탐색하는 경우 다른 매체와 영양 공급원을 고려해야 합니다. 다양한 배지에서 성장한 동일한 미생물을 사용하여 TLC-DB를 완성하여 하나의 분리물에서 대사 산물 다양성의 전체 범위를 평가하거나 더 넓은 범위의 분리체에 대해 동일한 성장 조건을 사용할 수 있습니다. 추출 용매의 선택은 검출된 천연 제품에도 영향을 미칩니다. 일반적으로 대부분의 생체 활성 NP는 극성이 낮거나 중간 정도인 것으로 이해되며, 끓는점이 낮아 쉽게 제거할 수 있기 때문에 에틸 아세테이트가 적합한 선택입니다. 그러나 극성 및 비극성 분획도 검사하려는 경우 다른 용매를 사용하여 여러 번 추출할 수 있습니다. 또는 cell-free 추출물을 동결건조하여 분석에 사용하여 모든 대사 산물이 매체로 방출되는 것을 확인할 수 있습니다. 그러나 동결건조된 재료의 건조된 매체 구성 요소를 설명하기 위해 TLC 플레이트에 더 많은 재료를 로드해야 하는 경우가 많습니다. 마찬가지로, 이 방법을 inoculum과 같은 다른 병원체와 함께 사용하는 경우 TLC-DB 분석에 사용되는 균사체의 5개 한천 플레이트를 얻기 위해 사용되는 배지와 배양 조건을 최적화해야 합니다.
TLC-DB는 한천과 접종물의 가장 얇은 층을 사용하기 때문에 접촉 및 침지 생체 자폐 촬영에 비해 유리하며, 이는 한천 층으로의 대사 산물의 확산에 대한 의존도를 최소화하여 더 적은 양의 천연 산물이 병원균 억제를 유도할 수 있도록 할 수 있습니다17. TLC 생체 자사 방법을 사용하여 이전에 발표된 연구 결과는 병원체의 포자 현탁액을 사용하여 분석을 완료했습니다17. 비록 이것이 현탁액 농도에 대한 정밀한 제어를 허용하지만, 특정 균류(24)의 포자형성을 유도하는 것은 대단히 어렵고 시간이 많이 걸릴 수 있다. 이 수정은 분석을 크게 단순화하고 포자가 발생하기 어렵고 이전에 이 방법에서 피했을 수 있는 곰팡이 병원체를 사용하여 분석을 완료할 수 있습니다.
분석에 사용된 박테리아 추출물의 질량은 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. TLC 플레이트에 너무 적은 추출물을 적용하면 활성 화합물의 최소 억제 농도를 초과하지 않고 생체 활성이 검출되지 않을 수 있습니다. 결과적으로, 그림 1 및 그림 2에서 볼 수 있듯이 경우에 따라 TLC 플레이트에 과부하를 일으켜 활동을 쉽게 감지할 수 있는 기능을 위해 분리를 손상시키는 것이 좋습니다. 마찬가지로, 플레이트에 분사되는 병원균 부하가 너무 낮아서는 안 되는데, 이는 병원균 성장을 지원하기 위해 충분한 매체가 적용되지 않기 때문입니다. 이 방법은 다양한 박테리아 추출물 및 병원체를 수용하도록 쉽게 조정할 수 있으며, 프로토콜에 설명된 미생물 추출물 및 접종물의 양은 여러 병원체 및 미생물 추출물에 대한 생체 활성을 검출할 수 있도록 보장했습니다. 분석 완료 시 억제 영역이 관찰되지 않으면 다음 중 하나를 나타낼 수 있습니다. 첫째, 활성 대사 산물은 박테리아 성장에 사용되는 호환되지 않는 매체 또는 NP 생성의 결과가 아닌 박테리아의 활동으로 인해 적용된 추출물에 존재하지 않을 수 있습니다. 추출물을 사용한 디스크 확산 분석을 완료하여 추출물에 활성 NP의 존재를 확인하거나 거부할 수 있습니다. 디스크 확산 분석에서 병원균 억제가 나타나지 않으면 다른 매체를 테스트하여 다른 조건이 생체 활성 NP를 생성하는지 확인할 수 있습니다. 디스크 확산 분석에서 추출물이 병원체를 억제하는 것으로 나타나면 더 많은 양의 박테리아 추출물을 TLC 플레이트에 적용해야 할 수 있으며, 이 경우 다른 분석을 시도할 수 있습니다.
ZOI의 대사 산물을 미정제 추출물과 비교하는 것은 활성 NP를 식별하는 데 필수적입니다. 분석에서 미정제 추출물의 대사 산물은 병원체에 의해 대사되거나 변형될 수 있으며, 이는 LC-MS를 통해 관찰할 수 있습니다. 따라서 미정제 추출물과 ZOI 모두에서 발생하는 대사 산물만이 연구 중인 박테리아에 의해 생성된 NP로 간주될 수 있습니다. ZOI에서 추출한 대사 산물을 미가공 추출물의 대사 산물과 연관시킬 수 없는 경우, 5단계에서 설명한 대로 TLC 플레이트를 준비할 수 있습니다. 생체 autography 분석을 완료하지 않고 완료된 분석에서 관찰된 것과 동일한 머무름 시간에 TLC 플레이트에서 대사 산물을 추출합니다. 이렇게 하면 ZOI의 대사 산물과 미정제 추출물 사이의 상관 관계를 더 쉽게 파악할 수 있어 병원균 억제를 유발할 수 있습니다.
TLC-DB의 한 가지 단점은 TLC의 분리능이 분리를 위해 액체 크로마토그래피가 필요한 기존 마이크로웰 스크리닝 기술을 사용할 때 달성되는 것보다 훨씬 낮다는 것입니다. 따라서, 일부 대사 산물이 생체 활성에 기여하지 않을 수 있는 억제 영역에 여러 대사 산물이 존재하는 것이 일반적입니다. 이 문제는 생체 활성을 보다 명확하게 관찰하기 위해 TLC 플레이트에 과부하를 가하는 관행으로 인해 더욱 발생할 수 있습니다. 최근 연구는 고성능 TLC(HP-TLC)를 사용하여 발표되었는데, 이는 해상도를 크게 향상시키고 기존의 TLC 14,21,22,23을 사용할 때 불가능한 TLC 개발의 자동화를 허용할 수 있습니다. 또한 플레이트를 2차원(2D-TLC)으로 개발하여 유사한 머무름 시간을 가진 대사 산물을 추가로 분리할 수 있습니다. 즉, 증가된 시간 및 재료 비용이 HP 및 2D-TLC25에서 얻은 향상된 해상도를 위한 가치 있는 절충안인지 평가해야 합니다.

곰팡이 농업 병원균은 전 세계적으로 작물 품질과 수확량에 심각한 손실을 초래하여 안정적인 글로벌 식량 생산 시스템의 경제적 및 공급 문제에 기여합니다 1,2. 병원균 피해는 감염에 저항력이 있는 품종을 육종하고 병원균 증식을 억제하기 위한 작물 순환 및 토지 관리 관행을 포함한 통합 작물 관리 시스템을 사용함으로써 예방할 수 있다 3,4. 이러한 방법은 작물에 대한 피해를 줄이지만 일반적으로 화학 살충제는 현장의 곰팡이 생식 구조를 적극적으로 죽이고 더 나아가 피해와 수확량 감소를 방지하기 위해 함께 사용됩니다. 화학 살충제 사용은 효과적이지만 주변 생태계 손상, 토양 비옥도 감소, 관련 인체 건강 위험, 병원체 내성 발달 등 많은 단점이 있으며, 후자는 매년 더 많은 양의 살충제가 필요하게 됩니다 5,6,7.
미생물 기반 해충 및 병원균 관리 제품은 오랫동안 합성 살충제의 잠재적인 대안 또는 보완물로 간주되어 왔습니다. 1900년대 초반부터 Bacillus thuringiensis 는 종자 처리, 엽면 살포 및 직접 토양 처리로 농업 해충 및 병원균을 방제하는 데 널리 사용되어 왔다8. 이러한 제품은 생물 살충제로 명명되었으며 대상 해충 또는 병원체의 활력을 죽이거나 억제하거나 감소시킬 수 있는 자연 발생 미생물 또는 생화학 물질로 특성화됩니다. 생물살충제는 다양한 메커니즘을 통해 병원체의 성장을 제어할 수 있지만, 가장 일반적으로 2차 대사산물의 분비를 통해 조절한다9. 종종 천연물이라고 불리는 2차 대사산물은 1차 대사에 관여하지 않지만 다른 미생물을 능가하기 위한 진화적 이점으로 생산됩니다10.
생물 살충제는 합성 살충제에 비해 많은 이점을 제공합니다. 그들은 합성 해충 관리 제품에 비해 환경, 동물 군 및 인간에 대한 독성 위험이 낮습니다 9,10. 대부분의 생물농약은 수천 년 동안 환경에 자연적으로 존재해 왔기 때문에 미생물 대사 산물에 대한 생분해 경로가 환경에 존재하여 토양 또는 생태계 오염 가능성을 제한하고 합성 살충제가 환경을 파괴하는 데 기여하는 체류 시간을 줄입니다11. 또한 병원체 감염을 완화하기 위해 사용되는 많은 생물살충제는 식물 성장 촉진 특성을 나타내어 영양소 생체이용률을 높이고 식물 전신 저항성을 유발할 수 있습니다12.
가장 일반적으로 생물 살충제는 미생물 접종물의 형태로 적용되며 NP는 살아있는 미생물에 의해 현장에서 분비됩니다 12,13. 이러한 경우 생물 살충제의 활성 원인을 식별하는 것이 매우 중요합니다. 이를 통해 생물 살충제의 작용 메커니즘에 대한 통찰력을 얻고, 특허를 통해 미생물을 보호하기 위한 사례를 구축하는 데 도움이 되며, 구조가 새로운 경우 상당한 과학적 영향을 미칠 수 있습니다. 그러나 가장 중요한 것은 생체 활성 공급원의 식별이 다운스트림 생물 살충제 제품의 제형 가능성을 알려주는 것입니다. NP 자체가 활성화되면 미생물을 대규모 생물 살충제 생산을 위한 생체 분자 공장으로 사용할 수 있습니다. 또한, 생물 제어를 위해 연구된 많은 NP는 인간 의학에서도 잠재적으로 응용될 수 있어 경제적으로 훨씬 더 가치가 있습니다8.
박층 크로마토그래피-직접 생체 자폐학(TLC-DB) 분석은 생물 살충 대사 산물의 생체 활성 유도 분리 및 식별을 위한 저렴하고 간단한 방법입니다. 이 기법은 조잡한 식물 추출물에서 식물 화학물질의 생체 활성 검사를 분리하는 데 일반적으로 사용되지만, 미생물 추출물 분석에도 큰 잠재력을 가지고 있습니다14. TLC는 미생물 추출물에서 NP를 빠르고 저렴하게 분리할 수 있으며, 매체 병원균 현탁액으로 코팅한 후 활성 대사 산물이 포함된 영역을 쉽게 시각화할 수 있습니다. 이러한 영역은 플레이트에서 긁어내고 알려진 대사 산물을 식별하기 위해 질량 분석법(UPLC-MS)과 결합된 초고성능 액체 크로마토그래피로 화학 분석을 위해 추출할 수 있습니다. 이전에 보고된 화합물과 일치하지 않는 대사 산물은 액체 크로마토그래피를 통해 대량으로 분리하여 핵 자기 공명 분광법 및 X선 결정학과 같은 기술을 사용하여 구조 규명 연구를 수행할 수 있습니다15.
이 기사에서는 Bacillus spp. 및 농업 병원균 Sclerotinia sclerotiorum과 함께 TLC-DB를 사용하여 생물 살충제 NP를 발견하고 식별하기 위한 모델 시스템에 대해 설명합니다. 그림 1 은 TLC-DB 절차의 개략적인 개요를 제공합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66967/66967fig01.jpg"> 그림 1: TLC-DB 절차의 4-7단계에 대한 개략도. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66967/66967fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5-5 mL single channel Pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA11020-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Thin Layer Chromatography Sprayer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>KT422530-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 x 15 mm Petri plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89038-970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-1000 &#181;L pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-1000 &#181;L single channel pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76169-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA21008-918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L glass bottle</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS13951L</td>
			<td>Must be autoclave safe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL sterile syringe with needle</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>8935L75</td>
			<td>Detachable needle is recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Microcentrifuge tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA21008-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA11020-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7 mL scintilation vials</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76538-962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% ethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A412-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UZ-01850-34</td>
			<td>8 L, 115 VAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological agar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bin</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1216H91</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9230-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane &#8805;99.8% ACS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1113-4LG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Acetate &#8805;99.8% ACS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1123-4LG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA28297-846</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grinding Beads</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12621-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA80501-074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>CleanTech</td>
			<td>1000-6-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC-MS</td>
			<td>Waters</td>
			<td>LITR10064178</td>
			<td>UPLC/MS/MS TQD system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>700201000</td>
			<td>Temperature collector&#160;-50 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese Sulfate Hydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CAAA10807-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol &#8805;99.8% ACS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH2018-5GLP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89402-824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato Dextrose Agar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA90000-758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato Dextrose Broth</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA90003-494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potsasium Phosphate Dibasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470302-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potsasium Phosphate Monobasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470302-252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Gauge 6mm Union Straight 0-10 bar (0-145 psi)</td>
			<td>Tameson</td>
			<td>F25U6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas F Agar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90003-352</td>
			<td>Also known as Flo Agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE Tubing</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>58697-U</td>
			<td>1/16 inch inner diameter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9286-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Inoculation loops with needle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76534-512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tinfoil</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1086F24</td>
			<td>Can be purchased from supermarket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC Silica Gel 60 RP-18 F254S 25 Glass Plates 20 X 20 cm</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1205Q12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>1472100</td>
			<td>98 L/min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76549-928</td>
			<td>Must accomadate 15 mL and 50 mL centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman in-line HEPA-VENT</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>WHA67235000</td>
			<td>10 filters, 1/4 to 3/8 inch inlet/outlet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-370</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bioassay-guided identification of natural products for biocontrol by thin layer chromatography-direct bioautography

박층 크로마토그래피-직접 생체 자폐학(TLC-DB)은 표적 병원체에 대해 길항작용이 있는 천연 제품(NP)을 분리하고 식별하는 데 사용되는 잘 정립된 생물학적 분석법입니다. 이는 생물 활성을 검사하기 위해 표적 병원체의 직접 적용과 함께 TLC에 의한 분리에 의존하는 NP의 생물학적 검정 유도 분리 및 식별을 위한 빠르고 저렴하며 간단한 옵션입니다. 일반적으로 생체 활성 식물 추출물 분석에 사용되며 박테리아, 곰팡이 및 효소에 대한 억제 활성을 감지합니다. 즉, 박테리아 NP 발견, 특히 관련 농업 병원체에 대한 박테리아 NP를 평가하는 데 큰 잠재력을 가지고 있으며, 이는 농업 산업을 위한 새로운 생물 살충제를 발견하고 개발하는 데 유용합니다. 또한, 생체 활성 화합물의 발견 및 식별에 관한 연구 프로그램에서 다른 표적 병원체 또는 NP의 소스에 적용할 수 있는 조정 가능한 프로토콜입니다. 여기에서는 Bacillus spp. 및 농업 병원균 Sclerotinia sclerotiorum과 함께 TLC-DB를 사용하여 생물 농약 NP를 발견하고 식별하기 위한 모델 시스템을 설명합니다.

Fungal agricultural pathogens cause significant losses in crop quality and yields worldwide, contributing to the economic and supply challenges of a stable global food production system1,2. Pathogen damage can be prevented by breeding cultivars resistant to infection and using integrated crop management systems, including crop rotations and land management practices to suppress pathogen proliferation3,4. Though these methods reduce damage to crops, chemical pesticides are generally used in tandem to actively kill fungal reproductive structures in the field and further prevent damage and yield reductions. Although effective, chemical pesticide usage has many drawbacks, including damage to surrounding ecosystems, a decline in soil fertility, associated human health risks, and the development of pathogen resistance, the latter causing higher doses of pesticides to be required each year5,6,7.
Microbial-based pest and pathogen management products have long been considered potential alternatives or complementary to synthetic pesticides. Since the early 1900s, Bacillus thuringiensis has been widely used to control agricultural pests and pathogens as a seed treatment, as a foliar spray, and in direct soil treatment8. Such products have been named biopesticides and are characterized as naturally occurring microorganisms or biochemicals that can kill, suppress, or reduce the vigor of a target pest or pathogen. Biopesticides can control the growth of a pathogen through various mechanisms but most commonly do so through the secretion of secondary metabolites9. Secondary metabolites, often referred to as natural products, are not involved in primary metabolism but are produced as an evolutionary advantage to outcompete other microorganisms10.
Biopesticides offer many advantages over their synthetic counterparts. They pose a low toxicity risk to the environment, fauna, and humans compared to synthetic pest management products9,10. Since most biopesticides have existed naturally in the environment for millennia, biodegradation pathways for microbial metabolites exist in the environment, limiting the possibility of soil or ecosystem contamination and reducing residence times that contribute to synthetic pesticides being so environmentally destructive11. Additionally, many biopesticides used for mitigating pathogen infection also exhibit plant growth-promoting properties, which can increase nutrient bioavailability and induce plant systemic resistance12.
Most commonly, biopesticides are applied in the form of microbial inoculum, and NPs are secreted by live microorganisms in situ12,13. In such a case, identifying the source of the activity of a biopesticide is of great value. Doing so provides insight into the mechanism of action of the biopesticide, aids with building a case for the protection of a microorganism with a patent, and can have a significant scientific impact if their structures are novel. Most importantly, however, identification of the bioactive source informs formulation possibilities for a downstream biopesticide product. If the NP itself is active, one can use the microorganism as a biomolecule factory for large-scale biopesticide production. Additionally, many NPs that have been explored for biocontrol also have potential applications in human medicine, making them even more economically valuable8.
Thin layer chromatography-direct bioautography (TLC-DB) assays are an inexpensive and straightforward method for the bioactivity-guided isolation and identification of biopesticidal metabolites. Although the technique is commonly used for separating bioactivity testing of phytochemicals from crude plant extracts, it also has great potential for the analysis of microbial extracts14. TLC provides fast and inexpensive separation of NPs in a crude microbial extract, and after coating with a media pathogen suspension, zones that contain active metabolites are easily visualized. Those zones can be scraped from the plate and extracted for chemical analysis by ultra-high-performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) to identify known metabolites. Metabolites that do not match previously reported compounds can be isolated in larger quantities via liquid chromatography to undergo structure elucidation studies using techniques such as nuclear magnetic resonance spectroscopy and X-ray crystallography15.
This article describes a model system for discovering and identifying biopesticide NPs using TLC-DB with Bacillus spp. and the agricultural pathogen Sclerotinia sclerotiorum. Figure 1 provides a schematic overview of the TLC-DB procedure.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66967/66967fig01.jpg" /> 
Figure 1: Schematic overview of steps 4-7 of the procedure of TLC-DB. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66967/66967fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

저자 스포트라이트: 생체 활성 토양 미생물 유래 천연 제품에서 새로운 생물 살충제 발견

박층 크로마토그래피에 의한 생물제어를 위한 천연물의 생물학적 분석 유도 식별-직접 생체 자폐 촬영

In the agricultural industry, research concerning the discovery of alternatives to synthetic pesticides has been growing significantly over the past two decades. By examining the natural products that bioactive soil microbes produce, our team envisions discovering new bio pesticides that already exist in the environment. The layer chromatography direct biotagraphy or TLCDB has primarily been used to determine the bioactivity of plant extracts against pathogenic bacteria and fungi.In this video, bacterial extracts are assayed without the need to induce spoilation of the pathogen, which allows for the examination of a wider range of pathogens. TLCBD will continue to be one of the tools that we use to focus on the discovery of novel natural products For biocontrol, this will benefit the agriculture and AgriFood sectors and help mitigate the resistance that pathogens have been developing to commercial pesticides.

TLC로 미생물 추출물을 분리하면 대사 산물이 TLC 플레이트를 따라 수직으로 분산되어야 합니다. 가시광선 아래에서는 가시광선 범위 내에서 흡수되지 않는 대사 산물을 보기 어려울 수 있습니다. 따라서 UV 광선 하에서 이미징하면 그림 2A, B에서 볼 수 있듯이 대사 산물의 분리를 보는 데 도움이 될 수 있습니다. 배양 기간이 끝나면 병원체는 그림 2C와 같이 활성 대사 산물이 상주하는 양성 대조군 및 억제 영역을 제외하고 전체 플레이트에 걸쳐 고르게 성장하는 것처럼 보여야 합니다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66967/66967fig02v2.jpg"> 그림 2: TLC에 의한 미생물 추출물 분리. (A) 곰팡이 접종물을 적용하기 전에 가시광선 및 (B) 320nm 자외선 아래에서 이미지화한 9개의 바실러스 추출물을 포함하는 TLC 플레이트를 개발했습니다. (C) 양성 대조군 주변에서 성장이 억제되는 곳을 제외하고 플레이트 전체에서 병원체 성장이 관찰된 완료된 생체 자폐 분석 및 각 추출물의 ZOI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66967/66967fig02largev2.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
억제 영역에서 추출한 대사 산물을 LC-MS로 분석하고 미가공 추출물과 비교하여 병원체에 대한 길항작용을 담당하는 NP를 결정합니다. 일치하는 대사 산물은 일치하는 것으로 간주되기 위해 동일한 머무름 시간과 분자 이온 종을 가져야 합니다. 활성 대사 산물이 확인되면 박테리아 배양을 대량으로 성장시켜 구조 화학 또는 생물학적 연구를 위해 관심 있는 활성 대사 산물을 분리할 수 있습니다.

병원균 Sclerotinia sclerotiorum 및 생물 살충 Bacillus isolates 를 모델 시스템으로 사용하여 진균 병원체에 대한 길항 작용을 나타내는 미생물 천연 제품을 식별하기 위해 박층 크로마토그래피, 직접 생체 자폐 분석 분석 및 액체 크로마토그래피-질량 분석법을 사용하는 방법을 설명합니다.

Thin layer chromatography-direct bioautography (TLC-DB) is a well-established bioassay used to separate and identify natural products (NPs) that are ...

bioassay-guided-identification-natural-products-for-biocontrol-thin

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioassay-Guided Identification of Natural Products for Biocontrol by Thin Layer Chromatography-Direct Bioautography

743 조회수.  Agriculture and Agri-Food Canada. 농업 분야에서는 지난 20년 동안 합성 살충제의 대체품 발견에 관한 연구가 크게 성장해 왔습니다. 생체 활성 토양 미생물이 생산하는 천연 제품을 조사함으로써 우리 팀은 환경에 이미 존재하는 새로운 생물 살충제를 발견하는 것을 구상하고 있습니다. 층 크로마토그래피 직접 생물 타그래피(TLCDB)는 주로 병원성 박테리아 및 곰팡이에 대한 식물 추?...

비디오: 저자 스포트라이트: 생체 활성 토양 미생물 유래 천연 제품에서 새로운 생물 살충제 발견

Thin layer chromatography-direct bioautography (TLC-DB) is a well-established bioassay used to separate and identify natural products (NPs) that are antagonistic against a target pathogen. It is a rapid, inexpensive, and simple option for the bioassay-guided isolation and identification of NPs that hinges on separation by TLC coupled with the direct application of a target pathogen to examine bioactivity. It is typically used for the analysis of bioactive plant extracts, detecting inhibitory activity against bacteria, fungi, and enzymes. That being said, it has great potential in bacterial NP discovery, particularly for evaluating bacterial NPs against pertinent agricultural pathogens, which is valuable for discovering and developing novel biopesticides for the agriculture industry. Furthermore, it is a tunable protocol that could be applied to other target pathogens or sources of NPs in research programs concerning the discovery and identification of bioactive compounds. Herein, we describe a model system for discovering and identifying biopesticide NPs using TLC-DB with Bacillus spp. and the agricultural pathogen Sclerotinia sclerotiorum.

We describe the use of thin-layer chromatography direct bioautography assay and liquid chromatography-mass spectrometry to identify microbial natural products that display antagonism against fungal pathogens using the pathogen Sclerotinia sclerotiorum and biopesticidal Bacillus isolates as a model system.

연구

생화학

Thin Layer Chromatography-Direct Bioautography Assay for Microbial Natural Products Displaying Antagonism Against Fungal Pathogens

To begin, using a pipette, spot five microliters of each extract two centimeters apart on the dots marked on the bottom line of the thin-layer chromatography, or TLC, plate. Let the spots dry on the TLC plate and repeat until about five milligrams of each extract are loaded onto the plate. Prepare a 1:2 solution of dichloromethane and methanol in a TLC developing tank.Put the TLC plate into the developing tank and develop it, until the solvent reaches the line marked two centimeters from the top of the plate. Once developed, remove the TLC plate from the tank. Immediately, spot the positive controls on the dots above the solvent line.Place the plate in an ethanol-sterilized TLC plate box before all solvent evaporates. Scrape the mycelial mat of the five pathogen plates using a sterile metal spatula. Then, transfer it into a 50-milliliter centrifuge tube.After adding 25 milliliters of Potato Dextrose Broth amended with agar, add sterile glass beads to the tube, and vortex for five minutes to break up the mycelial mat. After assembling the chromatography sprayer in the hood, attach the tubing. Then, attach the flow meter to the setup.Transfer the mycelial suspension to the chromatography sprayer using a sterile syringe with a needle tip to ensure large pieces of mycelia do not clog the sprayer. Place the previously developed TLC plates on sterile paper towels in the laminar flow hood to reduce hand contact with the plate, while applying the media suspension. Connect the pathogen sample to the assembled sprayer and apply three coats of the suspension to the TLC plate, allowing the plate to dry completely between applications.Next, prepare the incubation setup by adding 50 milliliters of sterile water into a sterilized plastic plate box. Place four Petri plates in it for the TLC plate to sit on. Also, place sterilized folded cellulose sheets or filter paper on each side of the box to hold moisture.Place the completed assay plate onto four empty Petri dishes in the box. Incubate the assay for three days to one week or until an even layer of mycelia grows across the plate, except for around the positive controls and zone of inhibition. Then, using a metal spoon, scrape the silica off the inhibition zones and place it into microcentrifuge tubes.Add 500 microliters of methanol to each tube and vortex to extract the metabolites from the silica. Centrifuge the tubes to pellet the silica and transfer the supernatant to liquid chromatography vials for analysis. Imaging under ultraviolet light showed the separation of metabolites on the TLC plate.After the incubation, the pathogen appeared to grow evenly across the entire plate, except over the positive controls and the inhibition zones.