تعود ممارسة استخدام النباتات لتحسين الصحة إلى آلاف السنين. وفي الآونة الأخيرة، أدى ازدياد الطلب، مقترنا بممارسات الحصاد غير المستدامة وتغير المناخ، إلى الضغط على سلسلة التوريد. وبسبب هذا، أصبح الزنا النباتي مصدر قلق متزايد، مما يجعل تحديد النباتات جزءًا أساسيًا بشكل متزايد من مراقبة الجودة.
ومن الناحية المثالية، يتم إجراء عملية تحديد الهوية في أقرب مكان ممكن من المصدر، بحيث يمكن تخصيص الموارد بكفاءة لمواد الهوية الصحيحة. هناك عدد من الأساليب لتحديد النباتات. تقليدياً، يتم إجراء تحديد النباتات من خلال التقييم المورفولوجي وطرق التحليل الكيميائي.
ويستند تحديد المورفولوجية على الاختلافات في السمات المجهرية والمجهرية للمواد النباتية. ومع ذلك ، فإنه يتطلب عالم النبات المدربين تدريبا جيدا وتطبيقه على المواد النباتية مسحوق محدود. تستخدم طرق التحليل الكيميائي على نطاق واسع في الأدوية والمختبرات، ولكنها ليست مثالية للاختبار الميداني بسبب حجم الأدوات ومتطلبات البيئة.
وقد برزت مؤخراً طرق الجينوم كتقنية بديلة لتحديد الأنواع النباتية نظراً لالإخلاص العالية وخصوصية المعلومات الجينية في المواد النباتية. مع أدوات التشخيص الجزيئي المتاحة الآن في شكل من أشكال الأجهزة المحمولة، يصبح هذا النهج ممكنا للتطبيق الميداني. والهدف من هذا البروتوكول هو إدخال طريقة لتحديد النباتات في الحالات التي يكون فيها الوصول إلى معدات المختبرات والخبرة محدوداً، مثل المزرعة التي تزود المادة النباتية، باستخدام نظام QPCR محمول.
وقد استخدمت Matricaria chamomilla، المعروف باسم البابونج الألماني، كدواء العشبية لتعزيز الصحة لعدة قرون. ولإثبات خصوصية الطريقة الحالية، يتم تضمين تمايز البابونج الألماني عن زهرة البابونج الأخرى الشائعة الاستخدام، المعروفة باسم البابونج الروماني، للمقارنة. يتم إثبات إجراء تحديد الحقل في وسط مزرعة البابونج الألمانية.
قم بإعداد منطقة اختبار في الحقل بسطح مستو وأفقي. تحديد النبات التمثيلي الذي يعكس خصائص غالبية النباتات في حقل زهرة البابونج. اختيار رأس زهرة من النباتات ممثل باستخدام قفازات معقمة.
ضع العينة في أنبوب جمع 2.0 ملليلتر. كرر وجمع نشرة ما يقرب من 0.5 إلى 0.7 سنتيمتر طويلة من نفس المصنع. سخني حاضنة الحمام الجاف إلى 95 درجة مئوية.
إلى كل أنبوب جمع، إضافة 100 ميكرولترات من محلول الاستخراج من مجموعة استخراج الحمض النووي النباتي. للحصول على كفاءة أفضل لاستخراج الحمض النووي، طحن العينة باستخدام مبيد الأنسجة. أغلق الأنبوب.
تأكد من أن الأنسجة النباتية مشمولة بمحلول الاستخراج طوال عملية الاستخراج. ضع أنابيب الجمع في حاضنة حمام جاف محمّى مسبقًا، وحضن أنابيب التجميع عند درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق بعد 10 دقائق، أخرج الأنابيب من حاضنة الحمام الجاف. إضافة 100 ميكرولترات من محلول التخفيف من عدة استخراج الحمض النووي وخلط الحل عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا عدة مرات.
كرر نفس الخطوة لاستخراج المنشورات. يهز لخلط الحل أكثر من ذلك. لا يبدو أن المشكلة النباتية عادةً قد تدهورت بعد هذه المعاملة.
قد يتغير لون السائل ويصبح غائما. تكوين ظروف الدراجات الحرارية صك qPCR وفقا للجدول الأول، الذي يبدأ مع خطوة درجة حرارة ثابتة للdenaturation الأولية، تليها 25 دورة من التضخيم وينتهي مع درجة الحرارة المنحدر للحصول على منحنى ذوبان عالية الدقة. اذيب المزيج الرئيسي qPCR وال التمهيديات المدرجة في الجدول الثاني في درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
خطة رد الفعل التي سيتم تحميلها في كل بئر. الآبار التي تحتوي على ضوابط إيجابية مع الأنواع المستهدفة، وضوابط إيجابية مع الأنواع غير المستهدفة، والعينات والضوابط السلبية. وفي هذا المثال، تستخدم 10 آبار، خمسة منها لاختبار تحديد هوية البابونج الألماني، وخمسة أخرى لاختبار تحديد هوية البابونج الروماني.
لكل نوع من أنواع اختبار تحديد الأنواع، يحتوي بئر واحد على تحكم إيجابي مع الحمض النووي المستخرج من المواد المرجعية للأنواع المستهدفة، ويحتوي بئر واحد على تحكم إيجابي مع الحمض النووي المستخرج من المواد المرجعية للأنواع غير المستهدفة، ويتم تعبئة بئرين مع عينات من الحمض النووي زهرة وأوراق استخراجها من الحقل، ويتم تخصيص بئر واحد للسيطرة السلبية. ويصف الجدول الثالث كل نوع من أنواع الآبار. إعداد مزيج ماجستير رد فعل وفقا للجدول الرابع لكل اختبار تحديد الأنواع النباتية.
يحتوي مزيج رئيسي نموذجي على مزيج رئيسي qPCR عالمي، مرتين، وا النوع الأمامي وعكسي وا النوع المحدد، والمياه الخالية من النوى. مختلطة تماما مزيج ماجستير رد فعل عن طريق pipetting قبل الاستخدام. ضع خرطوشة تفاعل PCR على سطح مستو ومستقر.
تحميل 18 ميكرولترات من مزيج ماجستير رد فعل تكوينها في الخطوة السابقة في آبار خرطوشة وفقا لآبار محددة هنا. لهذه التظاهرة، إضافة البابونج البابونج تحديد اختبار اختبار ماجستير مزيج التفاعل الرئيسي في الآبار المسمى لاختبار GC، GCT في الآبار واحد، ثلاثة، خمسة، سبعة، تسعة، والبابون الروماني تحديد اختبار التفاعل ماجستير مزيج التفاعل في آبار وصفت لاختبار RC، RCT في الآبار اثنين، أربعة، ستة، ثمانية، 10. نقل اثنين من ميكرولترات من الحمض النووي عينة من عظمى من أنابيب استخراج الحمض النووي والضوابط الحمض النووي إيجابية المستخرجة مسبقا في آبار خرطوشة محملة مسبقا مع مزيج سيد qPCR.
بعد إضافة كل قالب الحمض النووي إلى مزيج سيد qPCR، بلطف مزيج الحل عن طريق الأنابيب. ختم بعناية خرطوشة مع فيلم لاصق. قم بتحميل الكارتريدج على غرفة الدراجات الحرارية ثم أغلقها.
تعيين أداة qPCR لتشغيل. وفي البروتوكول الحالي، تستخدم الصبغة المتداخلة لقياس تضخيم الشظايا المستهدفة في الوقت الحقيقي. يتم تعريف قيمة Ct على أنها عدد الدورات المطلوبة للإشارة الفلورسنت لعبور العتبة المحددة مسبقاً.
واعتبرت قيمة Ct أقل من 25 دورات تضخيم إيجابي. في هذا الرقم، تم تضخيم السيطرة الإيجابية الرومانية فقط في اختبار تحديد البابونج الروماني، ولكن ليس في اختبار تحديد البابونج الألماني. تم تضخيم التحكم الإيجابي للبابونج الألماني وعينات الحقل فقط في اختبار تحديد هوية البابونج الألماني ، ولكن ليس في اختبار تحديد البابونج الروماني.
لم يتم تضخيم عنصر التحكم السالب في أي من الاختبارين. وللتأكد من زيادة التضخيم المحدد في الضوابط الإيجابية والعينات، تم تشغيل كسور من PCR ومنتجات من كل بئر على جل agarose بنسبة 2٪في المختبر. جميع الآبار ذات القيمة المقطعية أقل من 25 أمبيركونز التي أسفرت عن أحجامها المتوقعة، والتي تختلف بين البابونج الألماني والبابونج الروماني.
ولم تُظهر بقية الممرات أي منتج تضخيم محدد، بالاتفاق مع عدم وجود إشارة فلورية لهذه الآبار كما لوحظ في الاختبار الميداني. وبعد تضخيم نظام PCR، تم إجراء تحليل لمنحنى الذوبان باستخدام نفس البرنامج الذي استخدم لرصد الإشارة الفلورية. مع زيادة درجة الحرارة ، تبدأ أمبيركونات ذات حبلا مزدوج في التفكك ، مما يؤدي إلى انخفاض كثافة الفلوريسين.
تم تحويل التغيرات كثافة الفلوريسين إلى منحنيات ذروة الذوبان لمزيد من التمييز بين البابونج الألماني من البابونج الروماني من خلال قمم ذوبانها المميزة. في هذا الرقم، ذروة ذوبان السيطرة الإيجابية البابونج الألمانية 85.6 درجة مئوية، وهو متميز عن ذروة ذوبان السيطرة الإيجابية البابونج الرومانية. تنتج أمبيركونات PCR من عينات الحقل قمم ذوبان قريبة من السيطرة الإيجابية البابونج الألمانية.
يتم تحديد هوية عينة الحقل على أساس تضخيم معين ودرجة حرارة ذوبان مميزة تتطابق مع الضوابط. في هذا المثال، يتم تحديد كل من الزهور والأوراق التي تم جمعها في الحقل باسم Chamomilla Matricaria، البابونج الألماني. نتائج اختبار البابونج الروماني لهذه العينات اثنين سلبية.
ويوضح البروتوكول تحديد البابونج الألماني في الميدان باستخدام نظام qPCR محمول. ويمكن أن نطور أساليب مماثلة لتوسيع محفظة النباتات التي يمكن اختبارها. نأمل أن يوفر هذا الفيديو مواد تدريبية قيمة للعلماء، حتى غير الخبراء لإجراء عملية تحديد النباتات في هذا المجال أو في بيئة ذات معدات مختبرية محدودة.
ولا يسفر اختبار تحديد الهوية الميدانية المستند إلى الحمض النووي عن نتائج دقيقة للغاية تضاهي التحليل المختبري فحسب، بل يقلل أيضاً من الوقت والتكاليف المرتبطة بالطرق التقليدية التي يتم تنفيذها في المختبر.
