لذا فإن التركيز الرئيسي لبحثنا هو دراسة الخلايا اللحمية الوسيطة ، الحويصلة خارج الخلية لتجديد الأنسجة. تتمثل إحدى القضايا والهدف لبحثنا في ترجمة النهج الخالي من الخلايا إلى تطبيق سريري جنبا إلى جنب مع العلاجات الخلوية. يعد التوصيف أمرا بالغ الأهمية واليوم أن يكون لديك حويصلة نقية لتوصيف عميق أمر صعب للغاية لأنه لا توجد بروتوكولات لتحقيق نقاء عال.
لذلك ، أردنا تنفيذ تقنية فرز الخلايا لدراسة وتوصيف هذا النهج الجديد القائم على الحويصلة خارج الخلية ، ويتكون بروتوكولنا من أربعة أجزاء ، وإعداد العينة ، وتوصيف الحويصلات خارج الخلية ، والفرز ، وتحليل ما بعد الفرز. سنركز على جزء الفرز. كما سترى ، سيتم تنفيذ بعض الأوامر على برنامج الفرز بينما البعض الآخر على شاشة اللمس.
يوفر بروتوكولنا مزايا كبيرة مقارنة بالطرق الأخرى لفصل المركبات الكهربائية. أولا ، يحافظ استخدام 70 فوهة صغيرة عند 35 رطل لكل بوصة مربعة على سلامة الفرز اللاحق للمركبات الكهربائية. ثم من الممكن عزل مجموعة معينة من EV ثم أخيرا ، تسمح الأداة بحفظ إعداد الفرز من أجل جعل العملية قابلة للتكرار.
في مختبرنا ، نعمل على تطوير لوحة جديدة متعددة الألوان لتحليل الحويصلات خارج الخلية. على وجه الخصوص ، نحن نركز على إعداد الأداة وعلى دراسة الفلوروكروم. نعتقد أن القدرة على تحديد وفصل مجموعات نادرة من الحويصلات ، يمكن أن توفر تحسنا جيدا لتوصيفها وأيضا لدراسة دورها في العمليات البيولوجية.
للبدء ، افتح خط الضغط ونظام التفريغ لفارز الخلايا. قم بتشغيل الجهاز ، وافتح خزانة السلامة الحيوية ، وقم بتشغيل برنامج الفرز. اضغط على نظام السوائل ثم قم بتشغيل نظام السوائل.
قم بتنشيط محرك البلورة الكهروإجهادية في الفوهة التي تهتز لتوليد قطرات. قم بإجراء إزالة الفقاعات للتخلص من الفقاعات في النظام. ثم قم بتشغيل أنبوب خمسة ملليلتر من محلول التنظيف لمدة خمس دقائق عند ضغط تفاضلي مرتفع ، متبوعا بأنبوب سعة خمسة مليلتر من الماء منزوع الأيونات لمدة خمس دقائق.
لتنفيذ إجراء بدء التشغيل اليدوي ، انتقل إلى علامة تبويب التحكم بالليزر وقم بتشغيل طاقة الليزر. افحص المحاذاة الرأسية للدفق. لتحديد بقعة الليزر ، اضغط على علامة تبويب اعتراض دفق الليزر.
انقر فوق زر السهم الأخضر واتبع التعليمات الموجودة على شاشة اللمس. قم بتهيئة IntelliSort ، وقم بتعيين تردد محرك الأقراص مع قيمة السعة الافتراضية التي تتسبب في تكوين الدفق قطرة. لإجراء محاذاة الليزر الدقيقة, تحميل أنبوب خمسة ملليلتر من حبات محاذاة مراقبة الجودة في أخذ العينات وتشغيله في بروتوكول مراقبة الجودة.
في علامة تبويب المحاذاة الدقيقة ، حدد المعلمات المطلوبة على المحورين X و Y لتصور الخرز المضغوط والمجمعة جيدا. بمجرد التحقق من المحاذاة اليدوية ، قم بإجراء مراقبة الجودة التلقائية مع ضبط قطر حبات مراقبة الجودة على ثلاثة ميكرومترات. احفظ اكتساب مراقبة الجودة على بروتوكول محاذاة البرنامج.
لإنهاء IntelliSort ، حدد موقع لوحات الانحراف في الموضع الصحيح في الفرز ، وقم بتشغيل الجهد إلى حوالي 3 ، 000 فولت. اختر إخراج فرز حامل ستة أنابيب. حدد التدفقات الموجودة على مؤشر الدفق لتمكينها وإجراء دفق الاختبار.
قم بتمكين زر تحديد تأخير السقوط التلقائي IntelliSort لتعيين تأخير الإسقاط الصحيح والتحقق من التدفقات مرة أخرى. ثم قم بتنشيط وضع صيانة IntelliSort وتحقق من تأخير الإسقاط يدويا. قم بتحميل بروتوكول تأخير الإسقاط اليدوي في برنامج الفرز واحصل على حبات التحكم في الفلورسنت.
بعد إدخال حامل الشريحة الصحيح ، حدد فرز، متبوعا بمعالج تأخير الإسقاط ومنطق الفرز. تحقق باستخدام المجهر الفلوري من وجود 97٪ من حبات الفلورسنت في البركة الخامسة. للبدء ، قم بإعداد فارز الخلايا وقم بتنشيط IntelliSort.
بعد إجراء معايرة المبعثر، قم بتنفيذ خطوات الحصول على العينة لكل عينة. لإنشاء بروتوكول جديد لفرز العينات، حدد الملف متبوعا بالبروتوكول والجديد على شريط الأدوات. انقر فوق إعداد الحصول على البيانات في برنامج الفرز.
في نافذة معلمة الاكتساب ، حدد قنوات الاهتمام وقم بتعطيل الآخرين. ثم ضع أنبوبا سعة خمسة ملليلتر من العينة في جهاز أخذ العينات. على شاشة اللمس، انقر فوق زر التحميل.
في شريط أدوات برنامج الفرز، حدد اكتساب، واضغط على ابدأ. عند ظهور نافذة خصائص العينة، أدخل اسم العينة وانقر فوق موافق. لإنشاء استراتيجية البوابات ، حدد الرسم البياني ثم قم بإنشاء الرسم البياني.
قم بإنشاء ثلاث مخططات نقطية، الأولى مع سجل 488-FSC1-Height على المحور X وسجل 488-SSC-Height على المحور Y. والثاني مع سجل ارتفاع 488-FSC-2 على المحور X وسجل 488-SSC-Height على المحور Y ، والثالث مع سجل ارتفاع 488 513 × 26 CFSE على المحور X وسجل ارتفاع 488-SSC على المحور Y. انقر فوق اكتساب متبوعا بالبدء وأدخل اسم العينة.
أثناء الاستحواذ ، ارسم منطقة تحدد الأحداث السلبية CFSE ، وواحدة تحدد الأحداث الإيجابية CFSE. ثم في علامة التبويب فرز، حدد المنطقة المراد فرزها. عندما يكون معدل التدفق مستقرا، حدد الاستحواذ متبوعا بالإيقاف.
ابدأ الفرز عن طريق تحديد فرز على شريط أدوات برنامج الفرز. لحفظ إعدادات الفرز، حدد فرز في شريط الأدوات، ثم انقر فوق حفظ إعدادات الفرز. للتحقق من نقاء السكان الذين تم فرزهم ، احصل أولا على أنبوب سعة خمسة ملليلتر من محلول التنظيف لمدة 10 دقائق عند ضغط تفاضلي عال متبوعا بأنبوب خمسة ملليلتر من الماء منزوع الأيونات لمدة 10 دقائق.
احصل على 0.22 ميكرومتر ، PBS مفلتر وتحقق من عدم وجود أحداث إيجابية CFSE. ثم قم بتخفيف خمسة ميكرولترات من العينة المصنفة في 100 ميكرولتر من 0.22 ميكرومتر ، PBS مفلتر. الحصول على العينات التي تم فرزها وتسجيل الأحجام لم يتغير التعبير عن CD9 و CD63 و CD81 و CD44 في الحويصلات خارج الخلية المشتقة من الدهون بعد فرز CFSE.
أظهر تحليل تتبع الجسيمات النانوية أن توزيع حجم الحويصلات ظل ثابتا قبل الفرز وبعده. أشار تحليل المجهر الإلكتروني للإرسال إلى أن مورفولوجيا الحويصلات لم تتغير بشكل كبير من خلال عملية الفرز. بالإضافة إلى ذلك ، كان العلاج 0.1٪ Triton X-100 قلل من عدد الحويصلات الإيجابية CFSE التي تؤكد أصلها الحويصلي.
