ですから、私たちの研究の主な焦点は、組織再生のための細胞外小胞である間葉系間質細胞を研究することです。私たちの研究の課題と目標は、無細胞アプローチを細胞治療と並行して臨床応用に転換することです。キャラクタリゼーションは非常に重要であり、今日では、高純度を達成するためのプロトコルがないため、深いキャラシーゼーションのために純粋な小胞を持つことは非常に困難です。
したがって、私たちは細胞外小胞に基づくこの新しいアプローチを研究し、特性評価し、最終的には臨床診療に変換するために、セルソーター技術を実装したいと考えていました。私たちのプロトコルは、サンプル調製、細胞外小胞の特性評価、ソーティング、およびソーティング後の分析の4つの部分で構成されています。仕分け部分に絞っていきます。ご覧のとおり、一部のコマンドはソーターソフトウェアで実行され、他のコマンドはタッチスクリーンで実行されます。
当社のプロトコルは、他のEV分離方法と比較して大きな利点を提供します。まず、35 psiで70マイクロノズルを使用することで、EVの選別後の完全性が維持されます。その後、EVの特定の母集団を分離し、最後に、プロセスを再現可能にするために、装置はソート設定を保存できるようにします。
当研究室では、細胞外小胞解析のための新しい多色パネルの開発に取り組んでいます。特に、装置のセットアップと蛍光色素の研究に注力しています。私たちは、小胞の希少な集団を特定し、分離することができれば、その特性評価を改善し、生物学的プロセスにおける小胞の役割の研究にも役立つと考えています。
まず、セルソーターの圧力ラインと真空システムを開きます。装置の電源を入れ、バイオセーフティキャビネットを開き、ソーターソフトウェアを起動します。流体システムを加圧してから、流体システムのスイッチを入れます。
液滴駆動を作動させると、ノズル内の圧電結晶が振動して液滴が発生します。バブリング解除手順を実行して、システム内の気泡を排除します。次に、5ミリリットルの洗浄液チューブを高差圧で5分間運転し、続いて5ミリリットルの脱イオン水チューブを5分間運転します。
手動起動手順を実行するには、レーザー制御タブに移動し、レーザー出力をオンにします。ストリームの垂直方向の配置を調べます。レーザースポットを決定するには、レーザーストリームインターセプトタブを押します。
緑色の矢印ボタンをクリックし、タッチスクリーンモニターの指示に従います。IntelliSort を初期化し、ドロップ ドライブ周波数と、ストリームがドロップレットを形成する既定の振幅値を設定します。ファインレーザーアライメント手順では、5ミリリットルのQCアライメントビーズのチューブをサンプラーにロードし、QCプロトコルで実行します。
[ファインアライメント]タブで、X軸とY軸で目的のパラメータを選択して、十分に圧縮されたビーズと照合されたビーズを視覚化します。手動アライメントを確認したら、QCビーズの直径を3マイクロメートルに設定して自動QCを実行します。QC取り込みをソフトウェアアライメントプロトコルに保存します。
IntelliSortを完成させるには、ソーターの正しい位置に偏向プレートを配置し、電圧を約3, 000ボルトにオンにします。6チューブホルダーソート出力を選択します。ストリーム インジケータでストリームを選択して有効にし、テスト ストリームを実行します。
IntelliSort の自動ドロップ遅延決定ボタンを有効にして、正しいドロップ遅延を設定し、ストリームを再度確認します。次に、IntelliSort 保守モードをアクティブにし、ドロップ遅延を手動で確認します。ソーターソフトウェアに手動のドロップ遅延プロトコルをロードし、蛍光コントロールビーズを取得します。
正しいスライドホルダーを挿入した後、ソートを選択し、続いてドロップ遅延ウィザードとソートロジックを選択します。蛍光顕微鏡で、5番目の水たまりに97%の蛍光ビーズが存在することを確認します。まず、セルソーターをセットアップし、IntelliSortをアクティブにします。
散乱キャリブレーションを行った後、各サンプルのサンプル取得手順を実行します。サンプルのソーティング用に新しいプロトコルを作成するには、ツールバーで「file」、「protocol」の順に選択し、newを選択します。ソーターソフトウェアのデータ収集設定をクリックします。
取得パラメータウィンドウで、目的のチャネルを選択し、他のチャネルを無効にします。次に、サンプルの5ミリリットルのチューブをサンプラーに入れます。タッチスクリーンで、ロードボタンをクリックします。
ソーターソフトウェアのツールバーで、acquisitionを選択し、startを押します。サンプルのプロパティ ウィンドウが表示されたら、サンプル名を挿入し、[OK] をクリックします。ゲーティング戦略を作成するには、ヒストグラムを選択してから、ヒストグラムを作成します。
3 つのドット プロットを作成し、最初のドット プロットは X 軸に 488-FSC1-Height log、Y 軸に 488-SSC-Height log を配置します。2 つ目は、X 軸に 488-FSC-2 Height log、Y 軸に 488-SSC-Height log、3 つ目は X 軸に 488 513 X 26 CFSE Height log、Y 軸に 488-SSC Height log です。acquisition に続いて start をクリックし、サンプルの名前を挿入します。
取得中に、CFSE ネガティブ イベントを識別する領域と、CFSE ポジティブ イベントを識別する 1 つの領域を描画します。次に、[並べ替え] タブで、並べ替える領域を特定します。流量が安定したら、アクイジションを選択し、続いてストップを選択します。
ソーターソフトウェアのツールバーでソートを選択して、ソートを開始します。並べ替え設定を保存するには、ツールバーで [並べ替え] を選択し、[並べ替え設定の保存] をクリックします。選別された母集団の純度を確認するには、まず5ミリリットルの洗浄液チューブを高差圧で10分間取得し、次に5ミリリットルの脱イオン水チューブを10分間取得します。
0.22 マイクロメートルのフィルタリングされた PBS を取得し、CFSE 陽性イベントが存在しないことを確認します。次に、選別したサンプルの5マイクロリットルを、ろ過されたPBSの0.22マイクロリットルの100マイクロリットルに希釈します。選別したサンプルを取得し、脂肪由来の細胞外小胞におけるCD9、CD63、CD81、CD44の発現量を記録します。CFSE選別後も変化はありませんでした。
ナノ粒子追跡分析により、小胞のサイズ分布は、選別前と選別後で一貫していることが示されました。透過型電子顕微鏡分析により、選別プロセスによって小胞の形態が大きく変化しなかったことが示されました。さらに、治療は0.1%でしたトリトンX-100は、CFSE陽性小胞の数を減らし、それらの小胞起源を確認しました。
