Quindi l'obiettivo principale della nostra ricerca è studiare le cellule stromali mesenchimali, vescicole extracellulari per la rigenerazione dei tessuti. Un problema e un obiettivo per la nostra ricerca è quello di tradurre l'approccio senza cellule in applicazioni cliniche insieme alle terapie cellulari. La caratterizzazione è fondamentale e oggi avere vescicole pure per una caratterizzazione profonda è molto difficile perché non esistono protocolli per ottenere un'elevata purezza.
Pertanto, abbiamo voluto implementare la tecnologia del selezionatore cellulare per studiare, caratterizzare e, infine, tradurre nella pratica clinica questo nuovo approccio basato sulla vescicola extracellulare, Il nostro protocollo consiste in quattro parti, la preparazione del campione, la caratterizzazione delle vescicole extracellulari, lo smistamento e l'analisi post-smistamento. Ci concentreremo sulla parte di smistamento. Come vedrai, alcuni comandi verranno eseguiti sul software di smistamento mentre altri sul touch screen.
Il nostro protocollo offre vantaggi significativi rispetto ad altri metodi di separazione delle vescicole extracellulari. In primo luogo, l'uso di 70 micro ugelli a 35 psi preserva l'integrità del post-smistamento EV. Successivamente è possibile isolare una specifica popolazione di EV e infine, lo strumento consente di salvare l'impostazione dell'ordinamento per rendere il processo riproducibile.
Nel nostro laboratorio, stiamo lavorando allo sviluppo di un nuovo pannello multicolore per l'analisi delle vescicole extracellulari. In particolare, ci stiamo concentrando sulla configurazione degli strumenti e sullo studio dei fluorocromi. Riteniamo che essere in grado di identificare e separare popolazioni rare di vescicole, potrebbe fornire un buon miglioramento alla loro caratterizzazione e anche allo studio del loro ruolo nei processi biologici.
Per iniziare, aprire la linea di pressione e il sistema di vuoto della selezionatrice di celle. Accendere lo strumento, aprire la cabina di biosicurezza e avviare il software di selezione. Pressurizzare il sistema fluidico e quindi accendere il sistema fluidico.
Attiva l'azionamento a goccia del cristallo piezoelettrico nell'ugello che vibra per generare goccioline. Eseguire la procedura di de-bubbling per eliminare le bolle nel sistema. Quindi far scorrere un tubo da cinque millilitri di soluzione detergente per cinque minuti ad alta pressione differenziale, seguito da un tubo da cinque millilitri di acqua deionizzata per cinque minuti.
Per eseguire la procedura di avvio manuale, accedere alla scheda di controllo del laser e accendere il laser. Esaminare l'allineamento verticale del flusso. Per la determinazione del punto laser, premere la linguetta di intercettazione del flusso laser.
Fare clic sul pulsante freccia verde e seguire le istruzioni sul monitor touchscreen. Inizializzare IntelliSort e impostare la frequenza di rilascio dell'unità insieme al valore di ampiezza predefinito che causa la formazione di una gocciolina nel flusso. Per la procedura di allineamento laser fine, caricare un tubo da cinque millilitri di perline di allineamento QC nel campionatore ed eseguirlo nel protocollo QC.
Nella scheda di allineamento fine, selezionare i parametri desiderati sugli assi X e Y per visualizzare cordoni ben compattati e collosi. Una volta verificato l'allineamento manuale, eseguire il controllo qualità automatico con il diametro delle perline QC impostato su tre micrometri. Salva l'acquisizione del controllo qualità sul protocollo di allineamento software.
Per finalizzare l'IntelliSort, posizionare le piastre di deflessione nella posizione corretta nello smistatore e accendere la tensione a circa 3.000 volt. Scegli l'uscita di ordinamento del supporto a sei tubi. Selezionare i flussi sull'indicatore del flusso per abilitarli ed eseguire il flusso di test.
Abilitare il pulsante di determinazione automatica del ritardo di rilascio IntelliSort per impostare il ritardo di rilascio corretto e verificare nuovamente i flussi. Quindi attivare la modalità di mantenimento IntelliSort e verificare manualmente il ritardo di rilascio. Caricare il protocollo manuale di ritardo di caduta nel software di smistamento e acquisire le perle di controllo fluorescenti.
Dopo aver inserito il supporto per diapositive corretto, selezionare l'ordinamento, seguito dalla procedura guidata di ritardo di rilascio e dalla logica di ordinamento. Verificare con un microscopio a fluorescenza che il 97% delle perle fluorescenti sia presente sulla quinta pozzanghera. Per iniziare, configurare l'ordinatore di celle e attivare IntelliSort.
Dopo aver eseguito la calibrazione della dispersione, eseguire le fasi di acquisizione del campione per ciascun campione. Per creare un nuovo protocollo per l'ordinamento dei campioni, selezionare file seguito da protocollo e nuovo sulla barra degli strumenti. Fare clic su Impostazione acquisizione dati sul software di smistamento.
Nella finestra dei parametri di acquisizione, selezionare i canali di interesse e disabilitare gli altri. Quindi posizionare una provetta da cinque millilitri del campione nel campionatore. Sul touch screen, fare clic sul pulsante di caricamento.
Sulla barra degli strumenti del software di smistamento, selezionare acquisizione e premere Avvia. Quando viene visualizzata la finestra delle proprietà dell'esempio, inserire il nome dell'esempio e fare clic su OK. Per creare la strategia di controllo, selezionare l'istogramma e quindi creare l'istogramma.
Crea tre grafici a punti, il primo con log 488-FSC1-Height sull'asse X e 488-SSC-Height log sull'asse Y. Il secondo con 488-FSC-2 Height log sull'asse X e 488-SSC-Height log sull'asse Y, e il terzo con 488 513 X 26 CFSE Height log sull'asse X e 488-SSC Height log sull'asse Y. Fare clic su acquisizione, quindi su start e inserire il nome del campione.
Durante l'acquisizione, disegnare la regione che identifica gli eventi negativi del CFSE e quella che identifica gli eventi positivi del CFSE. Quindi, nella scheda di ordinamento, identificare l'area da ordinare. Quando la portata è stabile, selezionare l'acquisizione seguita dall'arresto.
Avviare l'ordinamento selezionando Ordina sulla barra degli strumenti del software di smistamento. Per salvare le impostazioni di ordinamento, selezionare ordina nella barra degli strumenti, quindi fare clic su Salva impostazioni di ordinamento. Per verificare la purezza della popolazione selezionata, acquisire prima un tubo da cinque millilitri di soluzione detergente per 10 minuti ad alta pressione differenziale, seguito da un tubo da cinque millilitri di acqua deionizzata per 10 minuti.
Acquisire PBS filtrato da 0,22 micrometri e verificare che non siano presenti eventi positivi alla CFSE. Quindi diluire cinque microlitri del campione selezionato in 100 microlitri di PBS filtrato da 0,22 micrometri. Acquisire i campioni ordinati e registrare i volumi L'espressione di CD9, CD63, CD81 e CD44 nelle vescicole extracellulari di derivazione adiposa non è cambiata dopo lo smistamento CFSE.
L'analisi del tracciamento delle nanoparticelle ha mostrato che la distribuzione dimensionale delle vescicole è rimasta coerente prima e dopo lo smistamento. L'analisi al microscopio elettronico a trasmissione ha indicato che la morfologia delle vescicole non è stata alterata in modo significativo dal processo di smistamento. Inoltre, il trattamento è stato dello 0,1% Triton X-100 ha ridotto il numero di vescicole CFSE positive confermando la loro origine vescicolare.
