Por lo tanto, el enfoque principal de nuestra investigación es estudiar las células estromales mesenquimales, vesículas extracelulares para la regeneración de tejidos. Un problema y un objetivo de nuestra investigación es traducir el enfoque libre de células en una aplicación clínica junto con las terapias celulares. La caracterización es crucial y hoy en día tener vesícula pura para una caracterización profunda es muy difícil porque no existen protocolos para lograr una alta pureza.
Por lo tanto, hemos querido implementar la tecnología de clasificación celular para estudiar, caracterizar y, eventualmente, trasladar a la práctica clínica este nuevo enfoque basado en vesículas extracelulares, Nuestro protocolo consta de cuatro partes, la preparación de la muestra, la caracterización de las vesículas extracelulares, la clasificación y el análisis posterior a la clasificación. Nos centraremos en la parte de clasificación. Como verá, algunos comandos se realizarán en el software clasificador, mientras que otros en la pantalla táctil.
Nuestro protocolo ofrece ventajas significativas en comparación con otros métodos de separación de vehículos eléctricos. En primer lugar, el uso de 70 micro boquillas a 35 psi preserva la integridad de la clasificación posterior de EV. A continuación, es posible aislar una población específica de EV y, finalmente, el instrumento permite guardar la configuración de clasificación para que el proceso sea reproducible.
En nuestro laboratorio, estamos trabajando en el desarrollo de un nuevo panel multicolor para el análisis de vesículas extracelulares. En particular, nos estamos centrando en la configuración del instrumento y en el estudio de los fluorocromos. Creemos que ser capaz de identificar y separar poblaciones raras de vesículas, podría proporcionar una buena mejora para su caracterización y también, para el estudio de su papel en los procesos biológicos.
Para comenzar, abra la línea de presión y el sistema de vacío del clasificador de celdas. Encienda el instrumento, abra el armario de bioseguridad e inicie el software del clasificador. Presurizar el sistema fluídico y, a continuación, encender el sistema fluídico.
Activar la conducción de gotas del cristal piezoeléctrico en la boquilla que vibra para generar gotas. Realice el procedimiento de desburbujeo para eliminar las burbujas en el sistema. A continuación, deje correr un tubo de cinco mililitros de solución limpiadora durante cinco minutos a alta presión diferencial, seguido de un tubo de cinco mililitros de agua desionizada durante cinco minutos.
Para realizar el procedimiento de inicio manual, vaya a la pestaña de control del láser y encienda la alimentación del láser. Examine la alineación vertical de la corriente. Para la determinación del punto láser, presione la pestaña de intercepción del flujo láser.
Haga clic en el botón de flecha verde y siga las instrucciones en el monitor de pantalla táctil. Inicialice IntelliSort y establezca la frecuencia de la unidad de colocación junto con el valor de amplitud predeterminado que hace que la secuencia forme una gota. Para el procedimiento de alineación láser fina, cargue un tubo de cinco mililitros de perlas de alineación QC en el muestreador y ejecútelo en el protocolo QC.
En la pestaña de alineación fina, seleccione los parámetros deseados en los ejes X e Y para visualizar cordones bien compactados y colulados. Una vez verificada la alineación manual, realice el control de calidad automático con el diámetro de las cuentas de control de calidad establecido en tres micrómetros. Guarde la adquisición de control de calidad en el protocolo de alineación de software.
Para finalizar el IntelliSort, ubique las placas de deflexión en la posición correcta en el clasificador y encienda el voltaje a aproximadamente 3.000 voltios. Elija la salida de clasificación de soporte de seis tubos. Seleccione las secuencias en el indicador de secuencia para habilitarlas y realizar la secuencia de prueba.
Habilite el botón de determinación automática de retardo de caída de IntelliSort para establecer el retardo de caída correcto y volver a comprobar las secuencias. A continuación, active el modo de mantenimiento de IntelliSort y compruebe el retraso de caída manualmente. Cargue el protocolo manual de retardo de caída en el software del clasificador y adquiera perlas de control fluorescentes.
Después de insertar el soporte de deslizamiento correcto, seleccione ordenar, seguido del asistente de retardo de caída y la lógica de ordenación. Verifique con un microscopio fluorescente que el 97% de las perlas fluorescentes están presentes en el quinto charco. Para empezar, configure el clasificador de celdas y active IntelliSort.
Después de realizar la calibración de dispersión, realice los pasos de adquisición de muestras para cada muestra. Para crear un nuevo protocolo para la clasificación de muestras, seleccione archivo seguido de protocolo y nuevo en la barra de herramientas. Haga clic en la configuración de adquisición de datos en el software clasificador.
En la ventana de parámetros de adquisición, seleccione los canales de interés y desactive los demás. A continuación, coloque un tubo de cinco mililitros de la muestra en el muestreador. En la pantalla táctil, haga clic en el botón de carga.
En la barra de herramientas del software del clasificador, seleccione adquisición y presione iniciar. Cuando aparezca la ventana de propiedades del ejemplo, inserte el nombre del ejemplo y haga clic en Aceptar. Para crear la estrategia de compuertas, seleccione histograma y, a continuación, cree histograma.
Cree tres diagramas de puntos, el primero con 488-FSC1-Height log en el eje X y 488-SSC-Height log en el eje Y. El segundo con 488-FSC-2 Registro de altura en el eje X y 488-SSC-Registro de altura en el eje Y, y el tercero con 488 513 X 26 Registro de altura CFSE en el eje X y 488-SSC Registro de altura en el eje Y. Haga clic en adquisición seguido de inicio e inserte el nombre de la muestra.
Durante la adquisición, dibuje una región que identifique los eventos negativos de CFSE y otra que identifique los eventos positivos de CFSE. A continuación, en la pestaña de ordenación, identifique la región que se va a ordenar. Cuando el caudal sea estable, seleccione la adquisición seguida de la parada.
Comience a ordenar seleccionando ordenar en la barra de herramientas del software clasificador. Para guardar la configuración de ordenación, seleccione ordenar en la barra de herramientas y, a continuación, haga clic en guardar configuración de ordenación. Para verificar la pureza de la población clasificada, primero adquiera un tubo de cinco mililitros de solución limpiadora durante 10 minutos a alta presión diferencial, seguido de un tubo de cinco mililitros de agua desionizada durante 10 minutos.
Adquiera un PBS filtrado de 0,22 micrómetros y compruebe que no haya eventos positivos de CFSE. A continuación, diluya cinco microlitros de la muestra clasificada en 100 microlitros de PBS filtrado de 0,22 micrómetros. Adquiera las muestras clasificadas y registre los volúmenes La expresión de CD9, CD63, CD81 y CD44 en las vesículas extracelulares derivadas del tejido adiposo no cambió después de la clasificación CFSE.
El análisis de seguimiento de nanopartículas mostró que la distribución del tamaño de las vesículas se mantuvo constante antes y después de la clasificación. El análisis de microscopía electrónica de transmisión indicó que la morfología de las vesículas no se alteró significativamente con el proceso de clasificación. Además, el tratamiento fue del 0,1%Triton X-100 redujo el número de vesículas positivas para CFSE, confirmando su origen vesicular.
