يواجه تحضير عينة التبريد تحديات يمكن أن تحد من فعاليتها ، وخاصة التوزيع غير المتكافئ للجسيمات. غالبا ما تؤدي هذه المشكلة إلى ضعف الدقة وانخفاض الدقة في هياكل البروتين الجديدة المنشأة. يتم استخدام طرق تجريبية مختلفة للتغلب على التوزيع غير المتكافئ للجسيمات ، بما في ذلك إضافة المنظفات أو تقليد الغشاء إلى العينة ، وتعديل فيلم دعم الشبكة وإمالة مرحلة معينة أثناء جمع البيانات.
يحلل هذا البروتوكول طريقة عملية بسيطة لمعالجة التوزيع غير المتكافئ للجسيمات من خلال تحسين تحضير العينة ، مما يوفر مرجعنا للباحثين لتوضيح هياكل الجزيئات الكبيرة بكفاءة باستخدام المبرد. للبدء ، اجمع أجزاء البروتين المجمعة التي تحتوي على بروتين صدمة حرارية صغير MJ 16.5. استخدم مرشحات الطرد المركزي مع قطع الوزن الجزيئي 50 كيلودالتون لتركيز الكسور عند أربع درجات مئوية إلى حوالي 65 ملليغرام.
بعد التركيز ، قم بالطرد المركزي للعينة عند 16 ، 000 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية لإزالة الركام. Aliquot 50 ميكرولتر من المواد الطافية في أنابيب PCR رقيقة الجدار 0.2 ملليلتر. للفحص المجهري الإلكتروني للإرسال ، قم بإذابة أنبوبين من البروتين المجمدين على الجليد.
بمجرد إذابته ، انقر فوق الأنبوب عدة مرات للخلط. ثم قم بالطرد المركزي لمحلول البروتين عند 16 ، 000 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية لإزالة الركام. بعد ذلك ، قم بحقن المادة الطافية على عمود كروماتوغرافيا استبعاد الحجم واجمع كسور شطف 0.5 ملليلتر.
اجمع الكسور الإيلوسي المقابلة للذروة ، وتظهر أعلى امتصاص للأشعة فوق البنفسجية عند 280 نانومتر. لتبادل العازلة ، باستخدام مقص ، قم بتقطيع غشاء غسيل الكلى إلى قطع 30 × 30 ملم. احتضان القطع في الماء المقطر أو المحاليل العازلة لتوازنها.
بعد ذلك ، أضف 55 ميكرولترا من محلول البروتين إلى غرفة بها أزرار غسيل الكلى المجهري سعة 50 ميكرولتر. أمسك غشاء غسيل الكلى عموديا باستخدام ملقط ولمس إحدى حواف الغشاء برفق على المناديل الورقية لتصريف السوائل الزائدة. قم بتغطية زر غسيل الكلى المجهري بعناية بالغشاء.
ضع الحلقة O أعلى غشاء غسيل الكلى ولفها برفق في الأخدود الموجود على حافة الزر. اغمر كل زر غسيل الكلى في دورق منفصل يحتوي على المخزن المؤقت للوجهة بحيث يكون جانب الغشاء متجها لأعلى. استخدم حقنة بإبرة رفيعة لكمة الغشاء بعناية واستعادة محلول البروتين من غرفة غسيل الكلى المجهري.
قم بتحميل خمسة ميكرولترات من العينة بتركيز 20 إلى 120 نانوغرام لكل مليلتر على شبكة تفريغ توهج. قم بإعداد ثلاث قطرات ماء سعة كل منها 50 ميكرولترا على ورقة فيلم البارافين. افركي سطح الشبكة بقطرات الماء لغسل العينة.
الآن قم بتحميل خمسة ميكرولترات من محلول أسيتات المبولة المصفى بنسبة 1٪ على الشبكة ، وقم على الفور بإزالة محلول أسيتات المبولة. قم بتحميل خمسة ميكرولترات أخرى من محلول أسيتات المبولة على الشبكة. المس برفق جانب الملقط من الشبكة بورق ترشيح لإزالة محلول التلوين الزائد وترك الشبكة تجف.
قم بتركيب الملقط ومجموعة شبكة تفريغ التوهج على الجهاز. ثم قم بتحميل أربعة ميكرولترات من العينة على جانب الكربون من الشبكة. ابدأ عملية التجميد الغاطس.
لإعداد الشبكات للتحميل على المجهر الإلكتروني للإرسال ، أو TEM ، ضع أولا صندوقا شبكيا يحتوي على شبكات مزججة في محطة تجميع الشبكة التلقائية وفك غطاء صندوق الشبكة الذي يحتوي على شبكات مزججة. ضع حلقة الشبكة التلقائية في مساحة القطع المخصصة في محطة التجميع. حرك الشبكة المزججة بعناية من صندوق الشبكة وقم بتثبيتها داخل حلقة الشبكة التلقائية.
الآن قم بمحاذاة القرص لوضع الفتحة الدائرية أعلى حلقة الشبكة التلقائية ومجموعة الشبكة. لتثبيت الشبكة في حلقة الشبكة التلقائية ، ضع أداة إدخال المشبك C أعلى الشبكة واضغط لأسفل برفق لتأمين المشبك C بالداخل. قم بتدوير القرص للخلف وانقل الشبكات المجمعة إلى صندوق تخزين الشبكة التلقائية.
قم بتجميع محطة تحميل الكاسيت وتبريدها بالنيتروجين السائل. ضع صندوق تخزين الشبكة التلقائية في محطة التحميل. انقل مجموعة الشبكة من صندوق تخزين الشبكة التلقائية إلى الدرج.
استخدم المقبض لوضع الدرج في كبسولة التحميل التلقائي. افحص الدبوس الموجود في اللودر التلقائي للتأكد من حركته الحرة والتأكد من عدم تجميده. لوحظ تراكم الجسيمات في المصفوفات على جميع الشبكات المختبرة بغض النظر عن ظروف العازلة أو تعديلات الشحنة السطحية.
أدى تركيز البروتين العالي جنبا إلى جنب مع الشبكات سالبة الشحنة في تسعة ملليمولار من الغوغاء ، و 50 ملليمولار من كلوريد الصوديوم و 0.1 ملليمولار من المخزن المؤقت EDTA إلى التوزيع المطلوب للجسيمات المفردة داخل ثقوب الشبكة ، مما يقلل من تكوين مصفوفة البروتين. أدت هذه الحالة المحسنة إلى قيمة نسبة مساحة FSC مخروطية عالية تبلغ 0.80 وقيمة SCF تبلغ 0.859 ، مما يؤكد توزيعا موحدا للجسيمات.
