A preparação de amostras criogênicas enfrenta desafios que podem limitar sua eficácia, particularmente a distribuição desigual de partículas. Esse problema geralmente leva a uma resolução ruim e precisão reduzida em novas estruturas de proteínas construídas. Várias abordagens experimentais são usadas para superar a distribuição desigual de partículas, incluindo a adição de detergentes ou imitadores de membrana à amostra, modificando o filme de suporte da grade e inclinando o estágio específico durante a coleta de dados.
Este protocolo analisa um método prático simples para lidar com a distribuição desigual de partículas por meio da otimização da preparação de amostras, fornecendo nossa referência para os pesquisadores ilustrarem com eficiência as estruturas de macromoléculas usando criogênio. Para começar, colete as frações de proteína agrupadas contendo a pequena proteína de choque térmico MJ 16.5. Use filtros centrífugos com um limite de peso molecular de 50 kilodalton para concentrar as frações em quatro graus Celsius a aproximadamente 65 miligramas.
Após concentração, centrifugar a amostra a 16 000 g durante 10 minutos a quatro graus Celsius para remover os agregados. Alíquota de volumes de 50 microlitros do sobrenadante em tubos de PCR de parede fina de 0,2 mililitros. Para microscopia eletrônica de transmissão, descongele dois tubos de proteína congelados no gelo.
Depois de descongelado, agite o tubo várias vezes para misturar. Em seguida, centrifugue a solução proteica a 16 000 g durante 10 minutos a quatro graus Celsius para remover os agregados. Em seguida, injectar o sobrenadante numa coluna de cromatografia de exclusão de tamanho e recolher fracções de eluição de 0,5 mililitros.
Coletar as frações elucianas correspondentes ao pico, exibindo a maior absorbância ultravioleta em 280 nanômetros. Para troca de tampão, com uma tesoura, corte uma membrana de diálise em pedaços de 30 por 30 milímetros. Incube as peças em água destilada ou soluções tampão para equilibrá-las.
Em seguida, adicione 55 microlitros da solução de proteína a uma câmara com botões de microdiálise de 50 microlitros. Segure a membrana de diálise verticalmente usando uma pinça e toque suavemente uma borda da membrana contra o lenço de papel para drenar o excesso de líquido. Cubra cuidadosamente o botão de microdiálise com a membrana.
Coloque o O-ring na parte superior da membrana de diálise e enrole-o suavemente na ranhura na borda do botão. Mergulhe cada botão de diálise num copo separado que contenha o tampão de destino com o lado da membrana virado para cima. Use uma seringa com uma agulha fina para perfurar cuidadosamente a membrana e recuperar a solução de proteína da câmara de microdiálise.
Carregue cinco microlitros da amostra a uma concentração de 20 a 120 nanogramas por mililitro em uma grade de descarga luminescente. Prepare três gotas de água de 50 microlitros cada em uma folha de filme de parafina. Esfregue a superfície da grade contra as gotas de água para lavar a amostra.
Agora carregue cinco microlitros de solução filtrada de acetato de mictório a 1% na grade e pipete imediatamente a solução de acetato de mictório. Carregue mais cinco microlitros da solução de acetato de mictório na grade. Toque suavemente no lado da pinça da grelha com papel de filtro para remover o excesso de solução de coloração e deixe a grelha secar.
Monte a pinça e o conjunto da grade de descarga incandescente no instrumento. Em seguida, carregue quatro microlitros da amostra no lado de carbono da grade. Inicie o processo de congelamento por imersão.
Para preparar as grades para carregar no microscópio eletrônico de transmissão, ou TEM, primeiro coloque uma caixa de grade contendo grades vitrificadas na estação de montagem de grade automática e desparafuse a tampa de uma caixa de grade contendo grades vitrificadas. Coloque o anel de grade automática no espaço de recorte designado na estação de montagem. Mova cuidadosamente a grade vitrificada da caixa da grade e encaixe-a dentro do anel de grade automática.
Agora alinhe o disco para posicionar a abertura circular na parte superior do anel de grade automática e do conjunto da grade. Para fixar a grade no anel de grade automática, coloque a ferramenta de inserção do clipe C na parte superior da grade e pressione suavemente para prender o clipe C dentro. Gire o disco para trás e mova as grades montadas para a caixa de armazenamento da grade automática.
Monte a estação de carregamento de e resfrie-a com nitrogênio líquido. Coloque a caixa de armazenamento da grade automática na estação de carregamento. Mova o conjunto de grade da caixa de armazenamento de grade automática para o.
Use a alça para colocar o na cápsula do carregador automático. Verifique o pino no carregador automático para confirmar seu movimento livre e garantir que não esteja congelado. O acúmulo de partículas em matrizes foi observado em todas as grades testadas, independentemente das condições do buffer ou modificações de carga superficial.
Uma concentração de proteína mais alta combinada com grades carregadas negativamente em nove milimolares de mobstress, 50 milimolares de cloreto de sódio e 0,1 milimolar de tampão EDTA resultou na distribuição desejada de partículas únicas dentro dos orifícios da grade, reduzindo a formação de matrizes de proteínas. Essa condição otimizada levou a um alto valor de razão de área cônica FSC de 0,80 e um valor SCF de 0,859, confirmando uma distribuição uniforme de partículas.
