يركز بحثنا على الاستفادة من الخصائص الفريدة للهلاميات المائية الحبيبية للتحقيق في حركة الخلايا ووظائفها لتجديد الأنسجة. تعد استجابة الخلية للبيئة المكروية مهمة للنموذج في فهم الآثار المترتبة على التأثير الانتقالي. مع زيادة استخدام سقالات المنفذ ثلاثية الأبعاد ، تزداد الحاجة إلى فحوصات الهجرة ثلاثية الأبعاد الشاملة التي تكرر سلوك الخلية بشكل أفضل في بيئة التئام الجروح.
لقد قمنا بتطوير خطي أنابيب ثلاثي الأبعاد ، من تطوير السقالة إلى التصوير والتحليل ، للتحقيق في حركة الخلايا وهجرتها في المختبر. من خلال هذين المقياسين الجديدين ، اكتسبنا القدرة على تتبع الخلايا المستجيبة في مرحلتين متميزتين من التئام الجروح: تسلل السقالة الأولي من الأنسجة السائبة وحركة الخلية التي كانت محاطة بسقالة معقدة. للبدء ، لوحة 120،000 خلية الخلايا الليفية الجلدية البشرية لكل سنتيمتر مربع في ستة آبار على الأقل من صفيحة 96 بئرا.
بعد الحضانة الليلية ، قم بإزالة الوسائط من آبار الخلية باستخدام شفاط أو ماصة. أضف الصبغة في 20 ميكرولترا من كل حالة هلامية إلى الآبار باستخدام ماصة الإزاحة الموجبة. باستخدام ملحق جهاز طرد مركزي دوار للوحة على درجة حرارة 25 درجة مئوية ، قم بتدوير اللوحة عند 100 جرام لمدة 15 ثانية مع ضبط التسارع والتباطؤ على 8 لتسطيح الجل.
اقلب اللوحة 180 درجة وقم بتدويرها مرة أخرى لضمان توزيع الجل بشكل متساو عبر قاع البئر. لتصوير الجل بشكل متشابك ، ضع ضوءا مركزا عند 365 نانومتر لمدة 30 ثانية لتلدين السقالة. بعد تشكيل جميع السقالات ، أضف 200 ميكرولتر من الوسائط إلى كل بئر واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
استخدم مجهر متحد البؤر لتصوير الخلايا والتقاط سلوك الهجرة الخاص بها. لتحليل الصور ، افتح برنامج تحويل الصور Imaris للتحويلات المجمعة. قم بسحب وإسقاط صور الفحص المجهري في برنامج التحويل وحدد مجلدا داخل ساحة البرنامج لاستيراد الملفات.
حدد كل ملف على حدة لتعيين حجم Voxel. اضغط على بدء الكل لبدء التحويل. بعد ذلك ، في برنامج Imaris Arena ، حدد صورة من الساحة لبدء المعالجة.
انقر فوق علامة التبويب Image Pros في شريط الأدوات الرئيسي. الآن ، انقر فوق القائمة المنسدلة للقناة 1 وحدد طرح الخلفية. اضغط على موافق للعودة إلى طريقة العرض ثلاثية الأبعاد.
في شريط الأدوات الصغير، انقر فوق الرمز ذو الأشكال الزرقاء المستديرة المسماة إضافة أسطح جديدة لإنشاء علامة تبويب كائنات قابلة للتحرير باسم Surfaces 1. قم بإنشاء معلمات يدويا لجميع النسخ المتماثلة باستخدام زر السهم الأزرق. اضبط تفاصيل السطح على 0.7 ميكرومتر وحدد طرح الخلفية ، التباين المحلي.
أدخل متوسط طول الخلية في قطر أكبر كرة ، والتي تتناسب مع مربع الكائن. للعتبة ، حدد الرسم البياني للشدة لتقسيم الخلايا الأكثر سطوعا فقط. قم بتمكين تقسيم الكائنات التي تلامس ونمو المنطقة وتعيين قطر نقاط البذور لتتناسب مع القطر المستخدم سابقا.
لحفظ معلمات الإنشاء لتحليل الدفعات، انقر فوق أيقونة العصا المسماة إنشاء. انقر فوق مخزن المعلمات للدفعة، وقم بتسمية الملف، ثم انقر فوق موافق. لجمع كل ارتفاعات الخلايا ، انقر فوق علامة التبويب مفصلة. حدد قيما محددة، ثم ضع الموضع Z من القوائم المنسدلة.
انقر على حفظ رمز لتصدير جميع مواضع Z والتصنيفات إلى ملف XLS. للبدء ، صب PBS في طبق بتري تحت الغطاء الرقائقي وقطرات 20 ميكرولتر من محلول وسائط الخلية على الغطاء المقلوب لطبق بتري. ضع الغطاء مرة أخرى على الطبق واحتضان اللوحة للحصول على كرويات ثلاثية الأبعاد معلقة مستزرعة بالقطرات.
لإعداد PLOSMA، استخدم ماصة الإزاحة الموجبة لإضافة 15 ميكرولترا من الجل إلى آبار الصفيحة الشفافة المكونة من 96 بئرا. باستخدام ملحق جهاز طرد مركزي دوار للوحة ، قم بتدوير اللوحة عند 1 ، 000 جم لمدة 10 ثوان لتسطيح الجل. اقلب اللوحة 180 درجة وقم بتدويرها مرة أخرى لضمان توزيع الجل بشكل متساو.
بعد ذلك ، قم بتطبيق الضوء المركز عند 365 نانومتر لمدة 30 ثانية لتلدين السقالة وربط الجل بالصورة من الأعلى. حرك طبق بتري من القطرات المعلقة بشكل معقم في غطاء مزرعة الأنسجة واقلب الغطاء. باستخدام ماصة سعة 20 ميكرولتر ، استنشق قطرة ببطء حتى يدخل الكروي إلى طرف الماصة وقم بإخراج القطرة على السقالة الموجودة في وسط البئر.
احتضان صفيحة البئر عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين للسماح للكرات بالالتصاق بالسقالة. بعد الحضانة ، ضع ماصة 15 ميكرولترا إضافيا من الجل فوق كل كروي. قم بالطرد المركزي للوحة عند 300 جرام لمدة 15 ثانية في كل اتجاه لضمان توزيع متساو للهلام.
قم بتلدين الطبقة العليا من الجل لاستخدام الأشعة فوق البنفسجية كما هو موضح سابقا. ضع اللوحة تحت مجهر متحد البؤر وقم بتصوير الكرويات بعد تحديد أدنى وأعلى مستويات Z. بعد استيراد الصور إلى برنامج Imaris Arena ، انقر فوق القائمة المنسدلة للقناة 1 وحدد طرح الخلفية.
اضغط على موافق في أسفل اللوحة. في طريقة العرض ثلاثية الأبعاد، اضغط على ضبط تلقائي لجميع القنوات في النافذة المنبثقة ضبط الشاشة وقم بإجراء التصحيحات حسب الحاجة. في شريط الأدوات الأصغر، انقر فوق أيقونة Add New Reference Frame لإنشاء علامة تبويب تسمى Reference Frame 1.
انقل الأصل إلى مركز الكرة الكروية في جميع الطائرات الثلاثة. في شريط الأدوات نفسه ، انقر فوق الرمز الذي يحتوي على المجالات البرتقالية لإضافة نقاط جديدة ، وإنشاء علامة تبويب باسم Spots 1 ، واضغط على زر السهم الأزرق للمتابعة. للعتبة، اضبط الرسم البياني للشدة لتقسيم الأجزاء الأكثر سطوعا فقط.
استخدم مقسم طريقة العرض للتنقل عبر مكدس الصور للحصول على الدقة. اضغط على السهم الأزرق "التالي" ثلاث مرات. قم بإلغاء تحديد Render on Slicer أو انقر فوق رمز المربع الأصفر في لوحة الإعداد.
انقر فوق علامة التبويب الإحصائيات. في القوائم المنسدلة، حدد قيما محددة والمسافة من الإطار المرجعي للأصل. انقر فوق أيقونة حفظ.
لحفظ جميع التغييرات والتحليلات ، انقر فوق حفظ في شريط الأدوات الرئيسي. تم استخدام هذه الطريقة لتقييم التسلل الخلوي في واجهة الأنسجة. زاد الموضع المتوسط في المحور Z للخلايا المهاجرة بشكل ملحوظ من صفر إلى 24 ساعة ، مما يشير إلى حركة الخلية الرأسية الملحوظة.
تضاعف تغيير الطية في هجرة الخلايا على طول المحور Z بعد 24 ساعة. أظهرت الخلايا المزروعة باستخدام طريقة PLOSMA انتشارا وهجرة كبيرين من اللب الكروي بعد 24 ساعة. أظهرت العروض ثلاثية الأبعاد انتشارا واسعا للخلايا في سقالة PLOSMA بعد 24 ساعة ، مع إسقاطات مرئية تمتد إلى الخارج.
كشفت الصور ثلاثية الأبعاد المعالجة باستخدام وظيفة البقع عن مواضع الخلايا المشتتة في السقالة ، مما يشير إلى هجرة واسعة النطاق. قطعت الخلايا مسافة متوسطة تزيد عن 200 ميكرومتر مع نتائج متسقة عبر العينات. كان تغيير الطية Z-height للخلايا في سقالة PLOSMA حوالي 4 ، مما يشير إلى حركة تصاعدية كبيرة.
