حقق العلاج بالخلايا التائية CAR نجاحا غير مسبوق في علاج بعض السرطانات المرضية. في هذه الدراسة ، قدمنا نهجا غير فيروسي طويل التكامل لتوليد الخلايا التائية المستضدة وتوفير إجراءات مستهدفة لتقييم وظيفة الخلايا التائية في مستقبلات المستضدات الوهمية. يهدف بحثنا إلى توليد خلايا تائية مستقبلات المستضدات المستضدة المستضدة الآمنة والفعالة في نهج أكثر فعالية من حيث التكلفة.
عادة ما تتولد الخلايا التائية المستضدة الخيمرية عن طريق التنبيغ الفيروسي. الفيروسات القهقرية ومضادات الفيروسات هي أكثر النواقل الفيروسية شيوعا لإيصال جين CAR يعد تصنيع النواقل الفيروسية معقدا ومكلفا ، ويؤدي التنبيغ الفيروسي إلى تكامل الحمض النووي العشوائي والدائم لترميز CAR في جينوم الخلايا التائية ، مما قد يسبب مخاوف تتعلق بالسلامة.
يقدم بروتوكولنا نهجا غير فيروسي لتوليد الخلايا التائية المستضدة للرضاعة المنضدة التي تعبر عن CAR بشكل متعدي فقط. تستخدم هذه الطريقة mRNA للتعبير عن CAR وتستخدم التثقيب الكهربائي لتوصيل mRNA إلى الخلايا التائية. هذا ليس له تكامل جيني مع جينوم الخلايا التائية ، وإجراءات التصنيع أبسط وأكثر فعالية من حيث التكلفة.
للبدء ، قم بخطية الحمض النووي لبلازميد CAR باستخدام إنزيم التقييد BGL2 وإجراء إجراء استخراج الحمض النووي للكحول الأيزوأميل من كلوروفورم الفينول. بعد تنقية الحمض النووي الخطي ، تحقق من حجم وسلامة القالب باستخدام الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز. بالنسبة للنسخ في المختبر، امزج مكونات التفاعل واحتضن خليط التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين على الأقل.
بعد النسخ ، أضف ميكرولترين من الريبونوكلياز III ، DNase I إلى التفاعل. تخلط بلطف وتحتضن لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية لتحلل الحمض النووي للقالب. قم بتنقية CAR MRNA المكتوب باستخدام مجموعة تنظيف الحمض النووي الريبي وتخفيفه بماء خال من النوكلياز.
قم بقياس تركيز الرنا المرسال باستخدام مقياس الطيف الضوئي قبل تخزينه عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. قم بإذابة عينة mRNA للسيارة المنسوخة والنقية في المختبر على الجليد. قم بتعليق واحد في 10 إلى قوة ست خلايا أحادية النواة للدم المحيطي للإنسان المحفوظ بالتبريد في مليلتر واحد من وسط CAR T.
لتنشيط الخلايا التائية ، أضف عددا متساويا من حبات CD3 / CD28 المنشطة البشرية المغسولة مسبقا. زراعة الخلايا وتوسيعها عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة ب 5٪ ثاني أكسيد الكربون لعدة أيام. أضف ملليلترا واحدا من وسط CAR T لكل بئر إلى بئرين من صفيحة 12 بئرا واحتضانها عند 37 درجة مئوية للتوازن.
الآن ، انقل خمسة في 10 أس ست خلايا تائية إلى أنبوب معقم. لإزالة حبات CD3 / CD28 ، ضع الأنبوب على حامل مغناطيسي وقم بسحب تعليق الخلية بعناية في أنبوب جديد. قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 300 جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.
بعد التخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق حبيبات الخلية في مليلتر واحد من PBS المعقم. الطرد المركزي للأنبوب مرة أخرى وإعادة تعليق حبيبات الخلية في 200 ميكرولتر من عازلة النيون T.Mix خمسة ميكروغرامات من CAR MNA المخففة في عازلة النيون T و 100 ميكرولتر من الخلايا بحجم إجمالي قدره 125 ميكرولتر. أضف 25 ميكرولترا من عازلة النيون T إلى 100 ميكرولتر المتبقية من الخلايا ، والتي تعمل كعنصر تحكم سلبي.
اضبط نظام التثقيب الكهربائي النيون على 1 ، 800 فولت ، 10 مللي ثانية ، ونبضة واحدة. استخدم ماصة النيون لشفط خليط CAR mRNA للخلايا التائية إلى طرف نيون 100 ميكرولتر وتغذية الخلايا بالكهرباء. انقل الخلايا الكهربائية على الفور إلى وسط الثقافة المتوازن في اللوحة المكونة من 12 بئرا وأعد اللوحة إلى الحاضنة لتوسيع الخلايا حتى تصبح جاهزة للاستخدام.
استرجع الخلايا التائية المنقولة باستخدام CAR mRNA لتحليل قياس التدفق الخلوي في وقت مبكر يصل إلى ست ساعات بعد التثقيب الكهربائي. امزج الخلايا التائية CAR عدة مرات باستخدام ماصة وانقلها مرة واحدة على الأقل 10 إلى قوة خمس خلايا إلى أنبوب فرز الخلايا المنشط بالفلورة سعة خمسة ملليلتر. أضف ثلاثة ملليلتر من محلول الغسيل البارد إلى الأنبوب وقم بالطرد المركزي للأنبوب عند 500 جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.
بعد التخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق حبيبات الخلية في 100 ميكرولتر من محلول الغسيل. أضف ميكرولترين من الجسم المضاد للكشف المسمى بالتألق وسبعة صبغة قابلية للحياة AAD إلى الخلايا العالقة. امزج العينة واحتضانها على الثلج لمدة 30 دقيقة ، مع تجنب التعرض للضوء ، ثم اغسل الخلايا بثلاثة ملليلتر من محلول الغسيل البارد وقم بالطرد المركزي للأنبوب مرة أخرى عند 500 جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.
بعد التخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من عازلة الغسيل وقم بتحليل الخلايا على الفور باستخدام مقياس التدفق الخلوي. قم بإزالة الوسط من الخلايا السرطانية التي تعبر عن مستضد CAR على سطح الخلية. بعد غسل الخلايا باستخدام PBS ، احتضنها بمليلتر واحد من محلول EDTA 0.05٪ من التربسين لمدة دقيقة واحدة عند 37 درجة مئوية ، ثم قم بإعداد معلق خلية واحدة في وسط الاستزراع المناسب بكثافة من واحد إلى خمسة أضعاف 10 إلى قوة خمس خلايا لكل مليلتر.
بعد ذلك ، أضف 50 ميكرولترا من وسط زراعة الخلايا السرطانية الدافئة مسبقا إلى اللوحة الإلكترونية وضعها في تحليل الخلية في الوقت الفعلي ، أو أداة RTCA ، لقياس مقاومة الخلفية ، ثم أضف 100 ميكرولتر من تعليق الخلية السرطانية إلى كل بئر وقم بموازنة اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. ضع اللوحة الإلكترونية مرة أخرى في أداة RTCA وراقب مؤشر الخلية لمدة 24 ساعة ، مع أخذ القياسات كل خمس إلى 15 دقيقة. في اليوم التالي ، قم بإعداد تعليق الخلية التائية CAR.
أوقف تسجيل فهرس الخلية مؤقتا وقم بإزالة اللوحة الإلكترونية من أداة RTCA. قم بإمالة اللوحة قليلا وقم بإزالة 50 ميكرولترا من وسط المزرعة بعناية من كل بئر دون إزعاج الخلايا السرطانية ، ثم أضف 100 ميكرولتر من الخلايا التائية CAR أو الخلايا التائية للتحكم إلى كل بئر. أعد اللوحة الإلكترونية إلى أداة RTCA واستأنف مراقبة مؤشر الخلية لمدة 24 ساعة على الأقل ، مع عمليات المسح التي يتم إجراؤها كل خمس إلى 15 دقيقة.
أوقف مراقبة مؤشر الخلية وقم بتحليل نتيجة السمية الخلوية. لتحليل إفراز السيتوكين ، انقل المادة الطافية من كل بئر إلى قاع دائري أو صفيحة 96 بئرا على شكل حرف V. قم بالطرد المركزي للوحة 96 بئرا عند 300 جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة وانقل المواد الطافية بعناية إلى صفيحة جديدة مكونة من 96 بئرا.
أخيرا ، قم بقياس مستويات السيتوكين في المواد الطافية باستخدام مجموعات ELISA التجارية. تم التحقق من صحة تسلسل CAR mRNA ليكون حجمه حوالي كيلو قاعدتين عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام. أكثر من 50٪ من الخلايا التائية المنشطة عبرت عن CAR في اليوم الأول بعد التثقيب الكهربائي ، وزادت إلى أكثر من 70٪ في اليوم الثاني قبل أن تنخفض إلى حوالي 10٪ بحلول اليوم الخامس.
أظهرت خلايا CAR T سمية خلوية كبيرة ضد الخلايا السرطانية SK-OV-3 الإيجابية HER2 ، والتي يشار إليها من خلال انخفاض حاد في مقاومة الورم ، بينما أظهرت الخلايا التائية الضابطة تأثيرا ضئيلا. تم الكشف عن مستويات عالية من إفراز إنترفيرون جاما في وسط زراعة الخلايا التائية CAR ، ولكن ليس في المجموعة الضابطة.
