يصف هذا البروتوكول عملية مبسطة ومتوافقة مع GNP لتحويل الخلايا التائية الأولية البشرية مع الجينات ذات الأهمية. تم تصميم هذه التقنية الخاصة لتكون فعالة من حيث التكلفة ومتوافقة مع الناتج القومي الإجمالي دون استخدام منصات تصنيع النظام المغلق باهظة الثمن المتوفرة حاليا في العديد من المراكز الأكاديمية. يمكن تطبيق هذه الطريقة على توليد علاجات الخلايا المعدلة جينيا ، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الخيمرية ، والتي كانت نقلة نوعية لمعالجة الأورام الخبيثة الدموية.
لعزل PBMC عن الخلايا التي تم جمعها بعد فصادة الكريات البيض في دم المتبرع ، قم بإجراء طرد مركزي متدرج الكثافة القائم على السكاريد للعينة ، مع الحفاظ على نسبة الكاشف إلى العينة 1: 2 ، عن طريق الطرد المركزي للخليط عند 800 جم لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع إيقاف تشغيل الفرامل. ثم باستخدام micropipette ، وجمع PBMCs في أنبوب 50 ملليلتر نظيفة. اغسل الخلايا مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني عن طريق الطرد المركزي.
قبل تعليق الخلايا المغسولة في وسائط المكونة للدم الكاملة. تنشيط حوالي 20 مليون خلية تم الحصول عليها عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من كاشف تحفيز الخلايا التائية لكل 2 مليون خلية. بعد ذلك ، بعد إضافة interleukin-2 البشري المؤتلف بمعدل 20 وحدة لكل ملليلتر ، امزج المحلول برفق وانقله إلى صفيحة من ستة آبار.
احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 72 ساعة قبل إجراء النقل الفيروسي. في اليوم الثالث ، انقل ثقافة الخلية إلى أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر واخلطه جيدا. جهاز طرد مركزي الأنبوب عند 300 جرام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة لإزالة كاشف التنشيط.
تخلص من المادة الطافية تماما وأعد تعليق الحبيبات في ملليلتر واحد من الوسط الكامل قبل عد الخلايا. اضبط حجم تعليق الخلية باستخدام وسيط كامل لتحقيق تركيز يسمح بطلاء 0.5 مليون خلية لكل بئر في لوحة 24 بئر. أضف إنترلوكين -7 البشري المؤتلف والإنترلوكين البشري المؤتلف -15 إلى الخلايا بتركيزات مناسبة.
في أنبوب منفصل ، أضف الكمية المطلوبة من vectofusin-1 إلى وسط Opti-MEM ، مع الأخذ في الاعتبار الحجم الفيروسي النهائي الذي سيتم استخدامه. امزج هذا الخليط مع الفيروس المركز بنسبة واحد إلى واحد ، مما يضمن الخلط الشامل. بعد ذلك ، أضف الخليط الناتج الذي يحتوي على الفيروس إلى الخلايا.
اضبط الحجم الكلي لكل بئر على 400 ميكرولتر باستخدام وسيط كامل إذا لزم الأمر. بعد تغطية اللوحة بغطاء ، أغلقها باستخدام فيلم بارافين قبل الطرد المركزي عند 1000 جرام لمدة ساعتين عند 32 درجة مئوية. احتضان اللوحة طوال الليل عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
في اليوم التالي ، اجمع الخلايا واسحبها من كل بئر إلى أنبوب سعة 50 ملليلتر. بعد ذلك ، قم بطرد الخلايا عند 400 جرام ودرجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد إزالة المادة الطافية بعناية ، أعد تعليق الحبيبات بالكامل في ملليلتر واحد من الوسط الكامل قبل عد الخلايا.
ثم اضبط تركيز الخلية مع الوسائط لتحقيق 1 مليون خلية لكل مليلتر وإضافة إنترلوكين 7 البشري المؤتلف وإنترلوكين 15 البشري المؤتلف عند 155 و 290 وحدة لكل مليلتر على التوالي قبل زراعة الخلايا. بمجرد الوصول إلى رقم الخلية المطلوب ، قم بحصاد الخلايا ونقلها إلى أنابيب سعة 50 ملليلتر وأجهزة الطرد المركزي الخاصة بها. بعد إزالة المادة الطافية ، أعد تعليق الحبيبات في 10 ملليلتر من الوسائط لحساب الخلايا.
بعد الطرد المركزي مرة أخرى ، تخلص من المادة الطافية تماما وأعد تعليق الحبيبات في محلول حفظ بالتبريد يتكون من 50٪ HSA ، و 40٪ HBSS ، بتركيز 10 ملايين خلية لكل ملليلتر لكل قارورة تبريد. انقل 0.9 ملليلتر من معلق الخلية إلى الأعداد المطلوبة من قوارير التبريد ، وأضف 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد إلى كل قارورة تبريد. ضع قوارير التبريد على الثلج وقم بتحويلها بسرعة إلى مجمد معدل متحكم فيه للحفظ بالتبريد.
ثم انقل العينات المحفوظة بالتبريد إلى خزان نيتروجين سائل مراقب للتخزين طويل الأجل. لتقييم كفاءة النقل ، أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS إلى العينة في فرز الخلايا المنشط بالفلورة أو أنبوب FACS. بعد طرد العينة عند 400 جرام ودرجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق ، تخلص من المادة الطافية تماما باستخدام ماصة.
أعد تعليق الحبيبات في محلول مخفف من واحد إلى خمسة من CD3 في المخزن المؤقت FACS. دوامة العينة واحتضانها لمدة 30 دقيقة على الجليد في الظلام قبل الطرد المركزي كما هو موضح سابقا. بعد ذلك ، بعد التخلص من المادة الطافية تماما ، أعد تعليق الحبيبات في محلول مخفف من واحد إلى 20 من 7-AAD في المخزن المؤقت FACS.
دوامة هذا الخليط قبل احتضانه لمدة 10 دقائق على الجليد في بيئة مظلمة. أخيرا ، أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS إليه وتابع تحليل العينة باستخدام مقياس التدفق الخلوي. كشف تحليل صلاحية الخلايا المحولة أنه في اليوم 14 ، كان أكثر من 95٪ من الخلايا إيجابية CD3 وحية بعد استبعاد الخلايا الإيجابية 7-AAD ، مما يشير إلى نجاح تنشيط الخلايا التائية وتوسعها.
تم قياس كفاءة النقل داخل السكان الإيجابيين CD3 لتكون 58.7٪ مقارنة بالخلايا غير المحولة ، والتي أظهرت كفاءة نقل بنسبة 0.51٪ عندما تم توسيع الخلايا المحولة من اليوم الرابع حتى اليوم 14 ، مع زراعة فرعية كل يومين ، خضعت الخلايا لتوسع 25 ضعفا. خضع المنتج لاختبارات مختلفة لمراقبة الجودة واستوفى جميع المعايير المحددة ، مما يشير إلى مدى ملاءمته للاستخدام مرة أخرى. يجب تنفيذ الإجراء بأكمله باستخدام تقنيات معقمة بدقة.
والخطوة الأكثر صعوبة هي عملية التنبيغ حيث يحتاج المرء إلى مراعاة جميع الكواشف المراد إضافتها من أجل الحفاظ على حجم إجمالي محدد.
