A terapia com células T CAR alcançou um sucesso sem precedentes no tratamento de certos tipos de câncer patológicos. Neste estudo, introduzimos uma abordagem não viral e de integração longa para gerar células T CAR transitórias e fornecemos procedimentos direcionados para avaliar a função das células T CAR. Nossa pesquisa visa gerar células CAR T seguras e eficazes em uma abordagem mais econômica.
As células T CAR são tipicamente geradas por transdução viral. Retrovírus e antivírus são os vetores virais mais comuns para a entrega do gene CAR. A fabricação de vetores virais é complexa e cara, e a transdução viral induz a integração aleatória e permanente do DNA codificador de CAR no genoma da célula T, o que pode causar preocupações de segurança.
Nosso protocolo oferece uma abordagem não viral para gerar células T CAR que expressam apenas transitivamente CAR. Este método usa mRNA para expressão de CAR e emprega eletroporação para entregar o mRNA em células T. Isso não tem integração genética com o genoma das células T, e os procedimentos de fabricação são mais simples e econômicos.
Para começar, linearize o DNA do plasmídeo CAR com a enzima de restrição BGL2 e execute o procedimento de extração de DNA de fenol clorofórmio isoamílico álcool. Depois de purificar o DNA linearizado, verifique o tamanho e a integridade do molde com eletroforese em gel de agarose. Para a transcrição in vitro, misturar os componentes da reação e incubar a mistura de reação a 37 graus Celsius durante pelo menos duas horas.
Após a transcrição, adicione dois microlitros de ribonuclease III, DNase I à reação. Misture delicadamente e incube por 15 minutos a 37 graus Celsius para degradar o DNA molde. Purifique o MRNA CAR transcrito com um kit de limpeza de RNA e dilua-o em água livre de nuclease.
Meça a concentração de mRNA usando um espectrofotômetro antes de armazená-lo a 80 graus Celsius negativos. Descongele a amostra de mRNA de carro transcrita e purificada in vitro no gelo. Suspenda uma vez 10 elevado a seis células mononucleares de sangue periférico humano criopreservadas em um mililitro de meio CAR T.
Para ativar as células T, adicione um número igual de esferas CD3 / CD28 do ativador T humano pré-lavadas. Cultive e expanda as células a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada com 5% de dióxido de carbono por vários dias. Adicione um mililitro de meio CAR T por poço a dois poços de uma placa de 12 poços e incube a 37 graus Celsius para equilíbrio.
Agora, transfira cinco vezes 10 elevado a seis células T para um tubo estéril. Para remover os grânulos CD3/CD28, coloque o tubo em um suporte magnético e pipete cuidadosamente a suspensão celular em um novo tubo. Centrifugar o tubo a 300 G durante cinco minutos à temperatura ambiente.
Depois de descartar o sobrenadante, ressuspenda o pellet celular em um mililitro de PBS estéril. Centrifugue o tubo novamente e ressuspenda o pellet celular em 200 microlitros de tampão Neon T.Misture cinco microgramas de CAR MNA diluído no tampão Neon T e 100 microlitros de células em um volume total de 125 microlitros. Adicione 25 microlitros de tampão Neon T aos 100 microlitros restantes de células, o que serve como um controle negativo.
Defina o sistema de eletroporação Neon para 1.800 volts, 10 milissegundos e um único pulso. Use a pipeta Neon para aspirar a mistura de mRNA CAR das células T em uma ponta Neon de 100 microlitros e eletroporar as células. Transfira imediatamente as células eletroporadas para o meio de cultura equilibrado na placa de 12 poços e devolva a placa à incubadora para expandir as células até que estejam prontas para uso.
Recupere as células T transfectadas com mRNA CAR para análise de citometria de fluxo seis horas após a eletroporação. Misture as células CAR T várias vezes com uma pipeta e transfira pelo menos uma vez 10 elevado a cinco células para um tubo de classificação de células ativadas por fluorescência de cinco mililitros, ou FACS. Adicione três mililitros de tampão de lavagem a frio ao tubo e centrifugue o tubo a 500 G por cinco minutos em temperatura ambiente.
Depois de descartar o sobrenadante, ressuspenda o pellet celular em 100 microlitros de tampão de lavagem. Adicione dois microlitros de anticorpo de detecção marcado com fluorescência e sete corantes de viabilidade AAD às células suspensas. Misture a amostra e incube-a no gelo por 30 minutos, evitando a exposição à luz, depois lave as células com três mililitros de tampão de lavagem a frio e centrifugue o tubo novamente a 500 G por cinco minutos em temperatura ambiente.
Depois de descartar o sobrenadante, ressuspenda as células em 100 microlitros de tampão de lavagem e analise imediatamente as células usando um citômetro de fluxo. Remova o meio das células tumorais que expressam o antígeno CAR na superfície celular. Depois de lavar as células com PBS, incube-as com um mililitro de solução de EDTA de tripsina a 0,05% por um minuto a 37 graus Celsius e, em seguida, prepare uma suspensão de célula única no meio de cultura apropriado a uma densidade de um a cinco vezes 10 elevado a cinco células por mililitro.
Em seguida, adicione 50 microlitros de meio de cultura de células tumorais pré-aquecido à placa E e coloque-o em uma análise celular em tempo real, ou instrumento RTCA, para medir a impedância de fundo, em seguida, adicione 100 microlitros da suspensão de células tumorais a cada poço e equilibre a placa em temperatura ambiente por 30 minutos. Coloque a placa E de volta no instrumento RTCA e monitore o índice celular por 24 horas, com medições feitas a cada cinco a 15 minutos. No dia seguinte, prepare a suspensão da célula CAR T.
Pause a gravação do índice de células e remova a placa E do instrumento RTCA. Incline ligeiramente a placa e remova cuidadosamente 50 microlitros de meio de cultura de cada poço sem perturbar as células tumorais e, em seguida, adicione 100 microlitros de células T CAR ou células T de controle a cada poço. Retorne a placa E ao instrumento RTCA e retome o monitoramento do índice celular por pelo menos 24 horas, com varreduras feitas a cada cinco a 15 minutos.
Pare o monitoramento do índice celular e analise o resultado da citotoxicidade. Para análise da secreção de citocinas, transfira o sobrenadante de cada poço para um fundo redondo ou placa de 96 poços em forma de V. Centrifugue a placa de 96 poços a 300 G por cinco minutos à temperatura ambiente e transfira cuidadosamente os sobrenadantes para uma nova placa de 96 poços.
Finalmente, meça os níveis de citocinas nos sobrenadantes usando kits ELISA comerciais. A sequência de mRNA CAR foi validada para ter aproximadamente dois quilobases de tamanho por eletroforese em gel. Mais de 50% das células T ativadas expressaram o CAR no primeiro dia após a eletroporação, aumentando para mais de 70% no segundo dia antes de diminuir para aproximadamente 10% no quinto dia.
As células T CAR mostraram citotoxicidade significativa contra células tumorais SK-OV-3 positivas para HER2, indicada por uma redução acentuada na impedância tumoral, enquanto as células T de controle demonstraram efeito mínimo. Altos níveis de secreção de interferon gama foram detectados no meio de cultura de células T CAR, mas não no grupo controle.
