نعترف بدعم هذا العمل من مشروع "إنشاء بنى تحتية" لبناء القدرات "في البحوث الطبية الحيوية (BIOMED-20)" (MIS 5047236) ، والذي يتم تنفيذه في إطار عمل "تعزيز البنية التحتية للبحث والابتكار" ، بتمويل من البرنامج التشغيلي "القدرة التنافسية وريادة الأعمال والابتكار" (NSRF 2014-2020) ، وبتمويل مشترك من اليونان والاتحاد الأوروبي (الصندوق الأوروبي للتنمية الإقليمية).

تحديد تلف الحمض النووي في البويضات الموقوفة في الطور الأولي للفئران

<ol>
	<li>Wang, X., Pepling, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+meiotic+prophase+one+in+mammalian+oocytes.">Regulation of meiotic prophase one in mammalian oocytes.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 667306 (2021).</li><li>Filatov, M., Khramova, Y., Semenova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+prophase+I+meiotic+arrest+maintenance+and+meiotic+resumption+in+mammalian+oocytes.">Molecular mechanisms of prophase I meiotic arrest maintenance and meiotic resumption in mammalian oocytes.</a> Reproductive Sciences. 26 (11), 1519-1537 (2019).</li><li>Adhikari, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+phosphorylation+of+Cdk1+mediates+prolonged+prophase+I+arrest+in+female+germ+cells+and+is+essential+for+female+reproductive+lifespan.">Inhibitory phosphorylation of Cdk1 mediates prolonged prophase I arrest in female germ cells and is essential for female reproductive lifespan.</a> Cell Research. 26 (11), 1212-1225 (2016).</li><li>Sun, S. C., Kim, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+asymmetric+division+in+oocytes.">Molecular mechanisms of asymmetric division in oocytes.</a> Microscopy and Microanalysis. 19 (4), 883-897 (2013).</li><li>Jones, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+egg+activation:+From+Ca2++spiking+to+cell+cycle+progression.">Mammalian egg activation: From Ca2+ spiking to cell cycle progression.</a> Reproduction. 130 (6), 813-823 (2005).</li><li>Solc, P., Schultz, R. M., Motlik, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prophase+I+arrest+and+progression+to+metaphase+I+in+mouse+oocytes:+comparison+of+resumption+of+meiosis+and+recovery+from+G2-arrest+in+somatic+cells.">Prophase I arrest and progression to metaphase I in mouse oocytes: comparison of resumption of meiosis and recovery from G2-arrest in somatic cells.</a> Molecular Human Reproduction. 16 (9), 654-664 (2010).</li><li>Parfenov, V., Potchukalina, G., Dudina, L., Kostyuchek, D., Gruzova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+antral+follicles:+oocyte+nucleus+and+the+karyosphere+formation+(electron+microscopic+and+autoradiographic+data).">Human antral follicles: oocyte nucleus and the karyosphere formation (electron microscopic and autoradiographic data).</a> Gamete Research. 22 (2), 219-231 (1989).</li><li>Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+organization+during+mouse+oocyte+growth.">Chromatin organization during mouse oocyte growth.</a> Molecular Reproduction and Development. 41 (4), 479-485 (1995).</li><li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+analysis+of+nonsurrounded+nucleolus+and+surrounded+nucleolus+oocytes+on+chromatin+accessibility+using+ATAC-seq.">Comprehensive analysis of nonsurrounded nucleolus and surrounded nucleolus oocytes on chromatin accessibility using ATAC-seq.</a> Molecular Reproduction and Development. 90 (2), 87-97 (2023).</li><li>Zuccotti, M., Bellone, M., Longo, F., Redi, C. A., Garagna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully-mature+antral+mouse+oocytes+are+transcriptionally+silent+but+their+heterochromatin+maintains+a+transcriptional+permissive+histone+acetylation+profile.">Fully-mature antral mouse oocytes are transcriptionally silent but their heterochromatin maintains a transcriptional permissive histone acetylation profile.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 28 (12), 1193-1196 (2011).</li><li>Winship, A. L., Stringer, J. M., Liew, S. H., Hutt, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+DNA+repair+for+maintaining+oocyte+quality+in+response+to+anti-cancer+treatments,+environmental+toxins+and+maternal+ageing.">The importance of DNA repair for maintaining oocyte quality in response to anti-cancer treatments, environmental toxins and maternal ageing.</a> Human Reproduction Update. 24 (2), 119-134 (2018).</li><li>Lieber, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+human+nonhomologous+DNA+end+joining.">The mechanism of human nonhomologous DNA end joining.</a> The Journal of Biological Chemistry. 283 (1), 1-5 (2008).</li><li>Chiruvella, K. K., Liang, Z., Wilson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+double-strand+breaks+by+end+joining.">Repair of double-strand breaks by end joining.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (5), 012757 (2013).</li><li>Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-homologous+DNA+end+joining+and+alternative+pathways+to+double-strand+break+repair.">Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).</li><li>Shibata, A., Jeggo, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+for+the+DNA-PK+complex+and+53BP1+in+protecting+ends+from+resection+during+DNA+double-strand+break+repair.">Roles for the DNA-PK complex and 53BP1 in protecting ends from resection during DNA double-strand break repair.</a> Journal of Radiation Research. 61 (5), 718-726 (2020).</li><li>Mohiuddin, I. S., Kang, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-PK+as+an+emerging+therapeutic+target+in+cancer.">DNA-PK as an emerging therapeutic target in cancer.</a> Frontiers in Oncology. 9, 635 (2019).</li><li>Marangos, P., Carroll, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocytes+progress+beyond+prophase+in+the+presence+of+DNA+damage.">Oocytes progress beyond prophase in the presence of DNA damage.</a> Current Biology. 22 (11), 989-994 (2012).</li><li>Paull, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+role+for+histone+H2AX+in+recruitment+of+repair+factors+to+nuclear+foci+after+DNA+damage.">A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage.</a> Current Biology. 10 (15), 886-895 (2000).</li><li>Bakkenist, C. J., Kastan, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+activates+ATM+through+intermolecular+autophosphorylation+and+dimer+dissociation.">DNA damage activates ATM through intermolecular autophosphorylation and dimer dissociation.</a> Nature. 421 (6922), 499-506 (2003).</li><li>Marangos, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage-induced+metaphase+I+arrest+is+mediated+by+the+spindle+assembly+checkpoint+and+maternal+age.">DNA damage-induced metaphase I arrest is mediated by the spindle assembly checkpoint and maternal age.</a> Nature Communications. 6, 8706 (2015).</li><li>Lavrentyeva, E. A., Shishova, K. V., Zatsepina, O. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+nuclear+dynamics+in+mouse+GV+oocytes+with+a+diverse+chromatin+configuration.">Differences in nuclear dynamics in mouse GV oocytes with a diverse chromatin configuration.</a> Biology Bulletin Russian Academy of Sciences. 46, 332-341 (2019).</li><li>Montecucco, A., Zanetta, F., Biamonti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+etoposide.">Molecular mechanisms of etoposide.</a> EXCLI Journal. 14, 95-108 (1998).</li><li>Mayer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+response+during+mouse+oocyte+maturation.">DNA damage response during mouse oocyte maturation.</a> Cell Cycle. 15 (4), 546-558 (2016).</li><li>Olive, P., Ban&#225;th, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comet+assay:+A+method+to+measure+DNA+damage+in+individual+cells.">The comet assay: A method to measure DNA damage in individual cells.</a> Nature Protocols. 1, 23-29 (2006).</li><li>Wu, D., Dean, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EXOSC10+sculpts+the+transcriptome+during+the+growth-to-maturation+transition+in+mouse+oocytes.">EXOSC10 sculpts the transcriptome during the growth-to-maturation transition in mouse oocytes.</a> Nucleic Acids Research. 48 (10), 5349-5365 (2020).</li><li>Simon, L., Emery, B., Carrell, D., Agarwal, A., Henkel, R., Majzoub, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage:+COMET+assay.">DNA damage: COMET assay.</a> Manual of Sperm Function Testing in Human Assisted Reproduction. , 202-212 (2021).</li></ol>

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح.

باستخدام الطريقة الموضحة هنا ، اكتشفنا DSBs في بويضات الثدييات. تسمح هذه الطريقة باكتشاف ودراسة عملية إصلاح الحمض النووي في البويضات. يمكن أيضا استخدام نفس البروتوكول لتحليل البروتينات الأخرى التي تشارك في العمليات الفسيولوجية في بويضات الثدييات. من المهم دراسة كيفية استجابة البويضات لتلف الحمض النووي المحتمل من أجل فهم سبب ضعف الخصوبة لدى الإناث لدى البشر بشكل أفضل.
يمكن أن تكون دراسة استجابة تلف الحمض النووي في بويضات الثدييات صعبة بسبب حساسية البويضات. تتطلب معالجة البويضات درجات حرارة محددة وتركيزات CO 2 و O2. في الوقت نفسه ، يجب حماية البويضات من الضوء. يجب أن تتم المناولة الكاملة باستخدام ماصات زجاجية غير ضيقة ، لأن هذا قد يكون ضارا للبويضات ، ولكن أيضا ليس بعرض كبير ، لأن هذا قد يتسبب في تخفيف الوسط ، وبالتالي يؤثر سلبا على إجراء التثبيت. في كل خطوة من خطوات التثبيت ، يتم استخدام عدة قطرات من المخازن المؤقتة لتقليل تأثير التخفيف. طريقة بديلة لمراقبة DSBs هي مقايسة المذنب24. على الرغم من أن هذه التقنية أكثر حساسية ، إلا أنها أكثر تعقيدا. في الوقت نفسه ، باستخدام مقايسة المذنب ، لا يمكن اكتشاف منطقة الحمض النووي الدقيقة التي يحدث فيها الضرر ، وفي الخلايا ذات جزيئات الحمض النووي الريبي الوفيرة ، مثل البويضات في مرحلة GV25 ، يمكن زيادة الخلفية ، مما يؤدي إلى إشارة تلف الحمض النووي الخاطئة26.
باستخدام بروتوكول التألق المناعي الموصوف هنا ، يمكننا اكتشاف DSBs بدقة وتقدير تقدم الإصلاح في البويضات في مرحلة GV ، كما يتضح من انخفاض مضان γH2AX بمرور الوقت. ومع ذلك ، فإن أحد قيود هذه الطريقة هو أن بعض الأجسام المضادة قد تقدم توزيعا غير محدد في جميع أنحاء البويضة ، مما يؤدي إلى صور ذات إضاءة خلفية عالية. يتم استخدام المخزن المؤقت PFA-Tx-100 بدلا من PFA المتسلسل و Tx-100 ، حيث لاحظنا أنه يحسن عملية التثبيت من خلال السماح باكتشاف خلفية أقل ومضان غير محدد. القيد الثاني لاستخدام γH2AX للكشف عن DSB هو أنه لا يمكن تقدير الضرر بعد GVBD بسبب الفسفرة التلقائية ل γH2AX في الانقسام الاختزالي23.
في بروتوكول التألق المناعي هذا ، تظل البويضات في مخزن مؤقت سائل ولا يمكن تخزينها داخل الشرائح. هذه الحقيقة تجعل من الصعب الحفاظ على الخلايا الثابتة لعدة أيام بعد إضافة الجسم المضاد الثانوي. من أجل الحصول على صور عالية الجودة وعدم فقدان الإشارة ، يفضل إجراء التصوير في غضون ساعات قليلة بعد إضافة الجسم المضاد الثانوي. وتجدر الإشارة أيضا إلى أن مسح النوى من خلال المحور Z يمكن أن يجعل الإشارة أضعف بسبب التعرض المفرط. لهذا السبب ، يفضل خفض طاقة الليزر وزيادة سرعة المسح.
أخيرا ، هناك قيد آخر لبروتوكول التألق المناعي وهو أنه يمكن استخدامه فقط للخلايا الثابتة / غير الحية. لذلك ، يمكننا فقط تقدير وجود وغياب العوامل في نقاط زمنية محددة دون معرفة ما إذا كانت هناك أي تقلبات في تركيزها أو تغيرات في سلوكها بمرور الوقت. يمكن التغلب على هذه المشكلة باستخدام تصوير الخلايا الحية والعلامات الفلورية.

تبدأ عملية الانقسام الاختزالي في الخلايا الجرثومية الأنثوية في الثدييات في المبايض قبل الولادة. يتم إنشاء العدد الإجمالي للبويضات في المبيضين في المقام الأول أثناء التطور الجنيني. تدخل البويضات الانقسام الميوزي وتظل محتجزة في الطور التمهيديالأول 1. بعد بداية البلوغ وإنتاج وعمل الغدد الصماء للهرمون المنبه للجريب (FSH) والهرمون اللوتيني (LH) ، قد تستأنف البويضات وتكمل الانقسامالاختزالي 2. في البشر ، يمكن أن يستمر توقف الطور لمدة تصل إلى 50 عاما3. الانقسامات الخلوية بعد الدخول في الانقسام الميوزي الأول غير متماثلة ، مما يؤدي إلى إنتاج جسم قطبي صغير وخلية بويضية تحتفظ بحجمها. وبالتالي ، يتم تخزين معظم مكونات السيتوبلازم في البويضة أثناء التطور الجنينيالمبكر 4. بعد ذلك ، تدخل البويضات الانقسام الاختزالي الثاني ، دون إعادة تشكيل نواتها أو تكثيف كروموسوماتها ، وتظل محتجزة في الطور الثاني حتى الإخصاب5.
الخاصية الفريدة التي تميز البويضات عن الخلايا الجسدية هي حالة الاعتقال في الطور التمهيدي الأول ، عندما تمتلك البويضة نواة سليمة (توقف الحويصلة الجرثومية [GV]) ، يشار إليها باسم المرحلة6 من GV. بناء على تنظيم الكروماتين ، يتم تصنيف البويضات في مرحلة GV إلى فئتين: النواة غير المحاطة (NSN) والنواة المحاطة (SN) 7,8. في البويضات في مرحلة NSN GV ، ينتشر الكروماتين في جميع أنحاء المنطقة النووية بأكملها ، ويكون النسخ نشطا ، بينما في بويضات SN ، يشكل الكروماتين حلقة مضغوطة تحيط بالنواة ، ويكون النسخ صامتا9. كلا النوعين من البويضات في مرحلة GV تظهر الكفاءة الاختزالي. يدخلون الانقسام الاختزالي بنفس المعدل ، لكن بويضات NSN تقدم قدرة تنموية منخفضة ولا يمكن أن تتطور إلى ما بعد مرحلة الجنينالمكونة من خليتين 10.
تزيد الحالة المطولة للتوقف عن المرحلة الأولى من حدوث تراكم تلف الحمض النووي11. ومن ثم، فإن آليات استجابة تلف الحمض النووي (DNA) في البويضات ضرورية للسماح بإنتاج الجاميتات ذات السلامة الوراثية، ولضمان احتواء الجنين الناتج على محتوى كروموسومي فسيولوجي.
أحد الجوانب المركزية لاستجابة تلف الحمض النووي هو إصلاح الحمض النووي. تشمل المسارات الرئيسية لإصلاح DSB في الخلايا حقيقية النواة الانضمام النهائي غير المتماثل (NHEJ) ، وإعادة التركيب المتماثل (HR) ، والبديل NHEJ12،13،14،15. NHEJ هي آلية أسرع ولكنها أكثر عرضة للخطأ ، بينما تتطلب الموارد البشرية مزيدا من الوقت لإكمالها ولكنها تتمتع بدقةعالية 16.
لا توجد معرفة كافية حول الآليات التي تستخدمها البويضات لإصلاح تلف الحمض النووي. أظهرت الدراسات أن تلف الحمض النووي الناجم عن بويضات الثدييات كاملة النمو باستخدام عوامل سامة للجينات ، مثل إيتوبوسيد أو دوكسوروبيسين أو الأشعة فوق البنفسجية أو الإشعاع المؤين ، لا يؤثر على توقيت ومعدلات الخروج من الطور الأول17. يمكن أن تخضع البويضات لانهيار GV (GVBD) حتى في وجود مستويات مرتفعة من الضرر. يمكن تحديد هذا الضرر من خلال مراقبة γH2AX. هذا الشكل المفسفر من H2AX (γΗ2ΑΧ) هو علامة DSB ، والتي تقع في موقع الفواصل وتعمل كسقالة للمساعدة في إصلاح العوامل والبروتينات لتتراكم في النهايات المكسورة18.
يرجع عدم توقف دورة الخلية بعد تلف الحمض النووي إلى عدم كفاية نقطة فحص تلف الحمض النووي التي تسمح للبويضات ذات الحمض النووي غير المصلح بالعودة إلى الانقسام الاختزالي. بعد مستويات عالية من تلف الحمض النووي ، يمكن لنقطة التفتيش الحفاظ على توقف الطور من خلال تنشيط مسار يعتمد على ATM / Chk1. ترجع استجابة نقاط التفتيش المحدودة ل DSBs إلى التنشيط المحدود لأجهزة الصراف الآلي17,19. في المرحلة M من الانقسام الاختزالي الأول ، أظهرت الأبحاث أن تلف الحمض النووي قد ينشط نقطة تفتيش تجميع المغزل (SAC) التي يسببها الانقسام الاختزالي I ، مما يمنع تنشيط مركب / سيكلوزوم تعزيز الطور E3 ubiquitin ligase (APC / C) ، وبالتالي ، خروج المرحلة M. علاوة على ذلك ، فإن استئصال بروتينات SAC يتغلب على حالة توقف المرحلة M ، مما يؤكد أهمية SAC في إنشاء الانقسام الاختزالي I chekpoint20.
كما تظهر الأبحاث السابقة بوضوح ، لا يمكن ل DSBs إحداث نقطة تفتيش قوية في بويضات الفئران. إذا ترك هذا الضرر دون إصلاح ، فقد يؤدي إلى أجنة تحمل تشوهات كروموسومية. لذلك ، من المهم دراسة استجابة تلف الحمض النووي في مراحل مختلفة من تكوين الأمشاج الأنثوية لفهم المسارات الفريدة التي تستخدمها البويضات للتعامل مع الإهانات الجينية المحتملة بشكل أفضل.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3 mL Pasteur pipettes in LDPE, graduated</td>
			<td>APTACA</td>
			<td>1502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cc syringes</td>
			<td>SoftCare</td>
			<td>114.104.21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit Secondary Ab</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>20012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-phospho-H2A.X (Ser139)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>07-164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARE Heating Magnetic Stirrer</td>
			<td>VELP Scientifica</td>
			<td>F20500162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FALCON 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Microlance 3 Needles 27 G - 0.40 x 13 mm</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>300635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Fraction V</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10735078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO Anhydrous</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>90082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRAQ7 DNA dye</td>
			<td>BioStatus</td>
			<td>DR71000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4378-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMSURE MgCl2. 6H2O</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1058330250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etoposide</td>
			<td>CHEMIPHARM</td>
			<td>L01CB01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FALCON 14 mL Polystyrene Round-Bottom Tubes</td>
			<td>Corning Science</td>
			<td>532057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FALCON Tissue Culture Dishes, Easy-Grip, 35 x 10 mm Style</td>
			<td>Corning Science</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Culture Dishes (35 mm Petri dish/ 14 mm Microwell, No. 0 coverglass)</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-0-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6147-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERACELL 150i CO2 Incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>50116048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5879-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica M125 Stereo Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M16 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaN3</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>13412H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1064981000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon AX ECLIPSE Ti2 Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon SMZ800N Stereo Microscope</td>
			<td>Nikon Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pippettes, glass, long form 230 mm</td>
			<td>DURAN WHEATON KIMBLE</td>
			<td>357335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH/ORP meter&#160;</td>
			<td>Hanna Instruments Ltd</td>
			<td>HI2211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline tablets</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSG Protein Lyophilised</td>
			<td>Genway Biotech (now AVIVA Systems Biology)</td>
			<td>GWB-2AE30A (now OPPA01037)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QBD4 Dry block heater</td>
			<td>Grant Instruments (Cambridge) Ltd</td>
			<td>A25218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Puradisc 25 mm 0.2 &#956;m filters</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>6780-2502</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of dna double-stranded breaks in mouse oocytes

البويضات هي من بين أكبر الخلايا وأكثرها عمرا في جسم الأنثى. تتشكل في المبيضين أثناء التطور الجنيني وتظل محتجزة في الطور التمهيدي للانقسام الميوزي الأول. قد تستمر الحالة الهادئة لسنوات حتى تتلقى البويضات حافزا للنمو والحصول على الكفاءة لاستئناف الانقسام الميوزي. هذه الحالة المطولة من الاعتقال تجعلهم عرضة للغاية لتراكم الإهانات الضارة بالحمض النووي ، والتي تؤثر على السلامة الوراثية للأمشاج الأنثوية ، وبالتالي على السلامة الوراثية للجنين المستقبلي. 
وبالتالي ، فإن تطوير طريقة دقيقة للكشف عن تلف الحمض النووي ، وهو الخطوة الأولى لإنشاء آليات استجابة لتلف الحمض النووي ، له أهمية حيوية. تصف هذه الورقة بروتوكولا شائعا لاختبار وجود وتطور تلف الحمض النووي في البويضات الموقوفة بالطور خلال فترة 20 ساعة. على وجه التحديد ، نقوم بتشريح مبيض الفئران ، واسترداد مجمعات البويضات الركامية (COCs) ، وإزالة الخلايا الركامية من موانع الحمل الفموية ، وزراعة البويضات في وسط Μ2 الذي يحتوي على 3-isobutyl-1-methylxanthine للحفاظ على حالة الاعتقال. بعد ذلك ، يتم التعامل مع البويضات بعقار مضاد للأورام سام للخلايا ، إيتوبوسيد ، لتوليد فواصل مزدوجة الخيوط (DSBs). 
باستخدام التألق المناعي والمجهر متحد البؤر ، نقوم باكتشاف وتحديد مستويات البروتين الأساسي γH2AX ، وهو الشكل المفسفر للهيستون H2AX. يصبح H2AX مفسفرا في مواقع DSBs بعد تلف الحمض النووي. يمكن أن يؤدي عدم القدرة على استعادة سلامة الحمض النووي بعد تلف الحمض النووي في البويضات إلى العقم والعيوب الخلقية وزيادة معدلات الإجهاض التلقائي. لذلك ، فإن فهم آليات الاستجابة لتلف الحمض النووي ، وفي الوقت نفسه ، إنشاء طريقة سليمة لدراسة هذه الآليات أمر ضروري لأبحاث البيولوجيا الإنجابية.

The process of meiosis in mammalian female germ cells is initiated in the ovaries before birth. The total number of oocytes is established in the ovaries primarily during embryogenesis. Oocytes enter meiosis and remain arrested at prophase I1. After the onset of puberty and the production and endocrine action of follicle-stimulating hormone (FSH) and luteinizing hormone (LH), oocytes may reinitiate and complete meiosis2. In humans, prophase arrest can last for up to 50 years3. The cell divisions following the entry into meiosis I are asymmetric, resulting in the production of a small polar body and an oocyte that retains its size. Thus, most cytoplasmic components are stored in the ooplasm during early embryogenesis4. Then, the oocytes enter meiosis II, without reforming their nucleus or decondensing their chromosomes, and remain arrested at metaphase II until fertilisation5.
A unique characteristic that distinguishes oocytes from somatic cells is the state of arrest in prophase I, when the oocyte possesses an intact nucleus (germinal vesicle [GV] arrest), referred to as the GV stage6. Based on the chromatin organization, GV-stage oocytes are classified into two categories: non-surrounded nucleolus (NSN) and surrounded nucleolus (SN)7,8. In NSN GV-stage oocytes, the chromatin spreads throughout the whole nuclear region, and transcription is active, while in SN oocytes, the chromatin forms a compact ring that surrounds the nucleolus, and transcription is silent9. Both types of GV-stage oocytes show meiotic competence; they enter meiosis at the same rate, but the NSN oocytes present low developmental capacity and cannot develop beyond the two-cell stage embryo10.
The protracted state of prophase I arrest increases the incidence of DNA damage accumulation11. Therefore, DNA damage response mechanisms in oocytes are essential for allowing the production of gametes with genetic integrity and for ensuring that the resulting embryo has a physiological chromosomal content.
A central aspect of the DNA damage response is DNA repair. The main pathways for DSB repair in eukaryotic cells include non-homologous end joining (NHEJ), homologous recombination (HR), and alternative NHEJ12,13,14,15. NHEJ is a faster but more error-prone mechanism, while HR requires more time to be completed but has high fidelity16.
There is not enough knowledge about the mechanisms that oocytes use for DNA damage repair. Studies have shown that DNA damage induced in fully grown mammalian oocytes by the use of genotoxic agents, such as etoposide, doxorubicin, or UVB or ionizing radiation, does not affect the timing and rates of exit from prophase I arrest17. Oocytes can undergo GV breakdown (GVBD) even in the presence of elevated levels of damage. This damage can be determined by the observation of &#947;H2AX. This phosphorylated form of H2AX (&#947;&#919;2&#913;&#935;) is a DSB marker, which is located at the site of breaks and functions as a scaffold to help repair factors and proteins to accumulate at broken ends18.
The absence of cell cycle arrest following DNA damage is due to an insufficient DNA damage checkpoint that allows oocytes with unrepaired DNA to re-enter meiosis. Following high levels of DNA damage, a checkpoint can maintain prophase arrest through the activation of an ATM/ Chk1-dependent pathway. The limited checkpoint response to DSBs is due to the limited activation of ATM17,19. In the M-phase of meiosis I, research has shown that DNA damage may activate a spindle assembly checkpoint (SAC)-induced meiosis I checkpoint, which prevents the activation of the E3 ubiquitin ligase anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) and, therefore, M-phase exit. Moreover, the ablation of SAC proteins overcomes the state of M-phase arrest, thus underlining the importance of the SAC in the establishment of the meiosis I chekpoint20.
As previous research clearly shows, DSBs cannot induce a robust prophase checkpoint in mouse oocytes. If such damage is left unrepaired, it could lead to embryos carrying chromosomal abnormalities. Therefore, it is important to study the DNA damage response at different stages of female gametogenesis to better understand the unique pathways that oocytes use to cope with potential genetic insults.

تسليط الضوء على المؤلف: فهم استجابة تلف الحمض النووي في بويضات الثدييات والأجنة قبل الزرع 

الكشف عن فواصل الحمض النووي المزدوجة التي تقطعت بها السبل في بويضات الفئران

Our research aims to understand how the cell cycle is regulated in mammalian oocytes and in preimplantation embryos. A key aspect of our research involves examination of repair capacity and DNA damage response in different maturation states is in oocytes and also in preimplantation embryos. We are particularly interested in understanding how the checkpoints respond and which repair mechanisms establish after potential DNA damage.Our lab was the first to mechanistically examine the DNA damage response in mammalian oocytes. We have shown the absence of the G2 prophase DNA damage checkpoint in mammalian oocytes. And we observed the importance of the spindle assembly checkpoint in establishing metaphase arrest after damage.By using this protocol, it is possible to detect DNA double strand breaks with accuracy and to determine whether oocytes have DNA damage and whether DNA damage is being repaired. This protocol involves the use of immunofluorescence which allows us to identify the exact sites of damage to DNA.

باستخدام الإجراء الموضح هنا ، تم تشريح مبيض الفئران ، وإزالة الدهون ، وتم جمع بويضات مرحلة GV كاملة النمو. بعد ذلك ، تمت إزالة الخلايا الركامية عن طريق السحب المتكرر باستخدام ماصة ضيقة ووضعت في قطرات جديدة من وسط M2-IBMX ومغطاة بالزيت المعدني على كتلة ساخنة (37 درجة مئوية) (الشكل 1A-F). تم تحضير ثلاثة تركيزات مختلفة من الإيتوبوسيد (5 ميكروغرام / مل ، 20 ميكروغرام / مل ، و 50 ميكروغرام / مل) باستخدام تركيز إيتوبوسيد مخزون قدره 20 ملغم / مل. تم وضع البويضات في مرحلة GV في ثلاثة تركيزات إيتوبوسيد متميزة لمدة 1 ساعة في قطرات مغطاة بالزيت المعدني ومحمية من الضوء عند 37 درجة مئوية. ثم تم اتباع بروتوكول التألق المناعي ، كما هو موضح في قسم البروتوكول بالتفصيل ، وتم وضع البويضات في أطباق ذات قاع زجاجي وتمت ملاحظتها بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر (الشكل 2).
في البويضات في مرحلة SN GV ، مباشرة بعد تلف الحمض النووي ، زاد وجود γH2AX في جميع تركيزات الإيتوبوسيد (5 ميكروغرام / مل ، 20 ميكروغرام / مل ، و 50 ميكروغرام / مل) ، وتم توزيع γH2AX في جميع أنحاء منطقة الحمض النووي بأكملها (الشكل 3). تم إجراء القياس الكمي والتقدير DSB من خلال مراقبة شدة مضان γH2AX في مواقع الحمض النووي. تكثف مضان γH2AX بشكل متناسب مع زيادة تركيزات الإيتوبوسيد. علاوة على ذلك ، بعد توقف الطور المطول (20 ساعة بعد علاج إيتوبوسيد) ، أظهرت البويضات في مرحلة GV القدرة على تقليل عدد بؤر γH2AX وشدتها ، مما يعني وجود عمليات إصلاح نشطة في البويضات الموقوفة في مرحلة GV (الشكل 3E).
على عكس بويضات SN ، حيث تم توزيع مضان γH2AX من خلال الحمض النووي ، في بويضات NSN ، تم عرض γH2AX في بؤر مباشرة بعد العلاج بالإيتوبوسيد عند 20 ميكروغرام / مل. قمنا بتقدير عدد البؤر التي تزامنت مع منطقة الحمض النووي ، وحسبنا مضان كل بؤرة ، وقدمنا متوسط مضان جميع البويضات. أظهر كل من التألق وعدد البؤر اختلافات ذات دلالة إحصائية بين فئتي البويضات (الشكل 4).
يوفر الفحص المجهري متحد البؤر معلومات عن عدد وشدة البؤر في مداخن Z المختلفة ، مما يساعد على تحديد وجود تلف الحمض النووي وديناميكيات الإصلاح في نقاط زمنية مميزة. يوفر مسح Galvano مسحا ضوئيا دقيقا بخلفية منخفضة وتحليلا أفضل لصور المسح الضوئي.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65494/65494fig03.jpg"> الشكل 3: اختزال γH2AX في البويضات في مرحلة SN GV المعالجة بثلاثة تركيزات مختلفة من الإيتوبوسيد بعد توقف GV المطول. (أ) مضان γH2AX في البويضات في مرحلة SN GV 0 ساعة بعد العلاج بالإيتوبوسيد. يزداد γH2AX مباشرة بعد التعرض في جميع تركيزات الإيتوبوسيد ، وتعتمد الزيادة على التركيز (أخضر: γΗ2ΑΧ ، أرجواني: DNA). الصور عبارة عن إسقاطات Z-stack ، وقد تم ضبط السطوع / التباين لكل قناة باستخدام Fiji / ImageJ. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. (B) الرسم البياني لمضان γH2AX في بويضات مرحلة SN GV 0 ساعة بعد العلاج بتركيزات إيتوبوسيد مميزة. تمثل البيانات متوسط ± SEM. تمثل كل نقطة بويضة واحدة (يظهر عدد البويضات في الرسم البياني) ، (ns = غير معنوي ، ** p < 0.005 ، **** p < 0.0001 ، ANOVA أحادي الاتجاه مع اختبار مقارنات Tukey المتعددة). (C) مضان γH2AX في بويضات مرحلة SN GV بعد 20 ساعة من العلاج بالإيتوبوسيد. γH2AX يقلل 20 ساعة بعد التعرض في جميع تركيزات إيتوبوسيد (الأخضر: γΗ2ΑΧ ، أرجواني: DNA). الصور عبارة عن إسقاطات Z-stack ، وقد تم ضبط السطوع / التباين لكل قناة باستخدام Fiji / ImageJ. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. (د) الرسم البياني لفلورة γH2AX في بويضات المرحلة SN GV بعد 20 ساعة من العلاج بتركيزات إيتوبوسيد متميزة. تمثل البيانات متوسط ± SEM. تمثل كل نقطة بويضة واحدة (يظهر عدد البويضات في الرسم البياني) ، (ns = غير معنوي ، * p < 0.05 ، ** p < 0.005 ، *** p < 0.0005 ، **** p < 0.0001 ، ANOVA أحادي الاتجاه مع اختبار مقارنات Tukey المتعددة).  (ه) الرسم البياني الشريطي لتقليل مضان γH2AX في الخلايا البيضية في مرحلة SN GV بعد توقف الطور الأولي في البويضات المعالجة بالإيتوبوسيد. يشير الرقم الموجود أعلى كل عمود إلى النسبة المئوية للانخفاض في مضان γH2AX. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65494/65494fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65494/65494fig04.jpg"> الشكل 4: فسفرة Η2ΑΧ في البويضات في مرحلة NSN GV بعد العلاج بالإيتوبوسيد عند 20 ميكروغرام / مل. (أ) صور تمثيلية متحدة البؤر لبويضة واحدة من مرحلة NSN GV (أخضر: γΗ2ΑΧ ، أرجواني: DNA). الصور عبارة عن إسقاطات Z-stack ، وقد تم ضبط السطوع / التباين لكل قناة باستخدام Fiji / ImageJ. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. (B) صور تمثيلية متحدة البؤر لخلية بويضية NSN GV في المرحلة المعالجة بالإيتوبوسيد (أخضر: γΗ2ΑΧ ، أرجواني: DNA). تم تثبيت البويضات 0 ساعة بعد علاج إيتوبوسيد. الصور عبارة عن إسقاطات Z-stack ، وقد تم ضبط السطوع / التباين لكل قناة باستخدام Fiji / ImageJ. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. (ج) مضان γΗ2ΑΧ الطبيعي في البويضات في مرحلة NSN GV بعد معالجة إيتوبوسيد 20 ميكروغرام / مل. تمثل البيانات متوسط ± SEM. تمثل كل نقطة بويضة واحدة (يظهر عدد البويضات في الرسم البياني) ، مأخوذة من تجربتين مستقلتين (**** p < 0.0001 ، اختبار t غير المزاوج غير المصاحب ، اختبار Mann-Whitney U). (د) عدد بؤر γΗ2ΑΧ في البويضات في مرحلة NSN GV بعد معالجة إيتوبوسيد 20 ميكروغرام / مل. تمثل البيانات متوسط ± SEM. تمثل كل نقطة بويضة واحدة (يظهر عدد البويضات في الرسم البياني) ، مأخوذة من تجربتين مستقلتين (**** p < 0.0001 ، اختبار t غير المزاوج غير المصاحب ، اختبار Mann-Whitney U). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65494/65494fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Understanding DNA Damage Response in Mammalian Oocytes and Preimplantation Embryos at JoVE.com

يعد الحفاظ على سلامة جينوم البويضة أمرا ضروريا لضمان الإخلاص الجيني في الجنين الناتج. هنا ، نقدم بروتوكولا دقيقا للكشف عن فواصل الحمض النووي المزدوجة في الخلايا الجرثومية الأنثوية للثدييات.

Oocytes are amongst the biggest and most long-lived cells in the female body. They are formed in the ovaries during embryonic development and remain ...

يهدف بحثنا إلى فهم كيفية تنظيم دورة الخلية في بويضات الثدييات وفي أجنة ما قبل الزرع. يتضمن أحد الجوانب الرئيسية لبحثنا فحص القدرة على الإصلاح والاستجابة لتلف الحمض النووي في حالات النضج المختلفة في البويضات وكذلك في الأجنة قبل الزرع. نحن مهتمون بشكل خاص بفهم كيفية استجابة نقاط التفتيش وآليات الإصلاح التي تنشأ بعد تلف الحمض النووي المحتمل.كان مختبرنا أول من فحص ميكانيكيا استجابة تلف الحمض النووي في بويضات الثدييات. لقد أظهرنا عدم وجود نقطة تفتيش تلف الحمض النووي للطور G2 في بويضات الثدييات. ولاحظنا أهمية نقطة تفتيش تجميع المغزل في إنشاء توقف الطور بعد التلف.باستخدام هذا البروتوكول ، من الممكن اكتشاف فواصل الشريط المزدوج للحمض النووي بدقة وتحديد ما إذا كانت البويضات تعاني من تلف الحمض النووي وما إذا كان يتم إصلاح تلف الحمض النووي. يتضمن هذا البروتوكول استخدام التألق المناعي الذي يسمح لنا بتحديد المواقع الدقيقة لتلف الحمض النووي.

detection-of-dna-double-stranded-breaks-in-mouse-oocytes

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Detection of DNA Double-Stranded Breaks in Mouse Oocytes

1.3K Views.  University of Ioannina. يهدف بحثنا إلى فهم كيفية تنظيم دورة الخلية في بويضات الثدييات وفي أجنة ما قبل الزرع. يتضمن أحد الجوانب الرئيسية لبحثنا فحص القدرة على الإصلاح والاستجابة لتلف الحمض النووي في حالات النضج المختلفة في البويضات وكذلك في الأجنة قبل الزرع. نحن مهتمون بشكل خاص بفهم كيفية استجابة ...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: فهم استجابة تلف الحمض النووي في بويضات الثدييات والأجنة قبل الزرع 

Oocytes are amongst the biggest and most long-lived cells in the female body. They are formed in the ovaries during embryonic development and remain arrested at the prophase of meiosis I. The quiescent state may last for years until the oocytes receive a stimulus to grow and obtain the competency to resume meiosis. This protracted state of arrest makes them extremely susceptible to accumulating DNA-damaging insults, which affect the genetic integrity of the female gametes and, therefore, the genetic integrity of the future embryo. 
Consequently, the development of an accurate method to detect DNA damage, which is the first step for the establishment of DNA damage response mechanisms, is of vital importance. This paper describes a common protocol to test the presence and progress of DNA damage in prophase-arrested oocytes during a period of 20 h. Specifically, we dissect mouse ovaries, retrieve the cumulus-oocyte complexes (COCs), remove the cumulus cells from the COCs, and culture the oocytes in &#924;2 medium containing 3-isobutyl-1-methylxanthine to maintain the state of arrest. Thereafter, the oocytes are treated with the cytotoxic, antineoplasmic drug, etoposide, to engender double-strand breaks (DSBs). 
By using immunofluorescence and confocal microscopy, we detect and quantify the levels of the core protein &#947;H2AX, which is the phosphorylated form of the histone H2AX. H2AX becomes phosphorylated at the sites of DSBs after DNA damage. The inability to restore DNA integrity following DNA damage in oocytes can lead to infertility, birth defects, and increased rates of spontaneous abortions. Therefore, the understanding of DNA damage response mechanisms and, at the same time, the establishment of an intact method for studying these mechanisms are essential for reproductive biology research.

Maintaining oocyte genome integrity is necessary to ensure the genetic fidelity in the resulting embryo. Here, we present an accurate protocol for detecting DNA double-strand breaks in mammalian female germ cells.

Collection of Germinal Vesicle Oocytes from the Ovaries of CD-1 Mice and Induction of DNA Double-Strand Breaks

To begin, prepare drops of M2 IBMX Medium in a plastic tissue culture dish, and place the dish on a hot block at 37 degrees Celsius for at least 30 minutes before oocyte isolation. Dissect the ovaries of the euthanized mice and place them in a five milliliter round bottom tube with M2 IBMX. Transfer the ovaries to a plastic lid containing 1.5 milliliters of M2 IBMX.Remove any peri-ovarian adipose tissue, or fallopian tube segments, and release the cumulus oocyte complexes by mechanical perforation of the ovaries with a 27-gauge needle. Transfer the cumulus oocyte complexes to a culture dish with drops of M2 IBMX. And remove the cumulus cells by repeated pipetting using a narrow bore glass pasture pipette.Select the surrounded nucleus germinal vesicle or GV stage oocytes, and transfer them in a drop of M2 IBMX medium on hot block at 37 degrees Celsius protected from light. After inducing double strand breaks using etoposide, place the GV stage oocytes in drops of the genotoxic agent for one hour on the hot block in the dark. Add drops of M16 culture medium supplemented with 400 micromolar IBMX to the oocytes to keep them arrested for a prolonged period.Place the oocytes in an incubator at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide.

مجموعة من بويضات الحويصلة الجرثومية من مبيض الفئران CD-1 وتحريض فواصل الحمض النووي المزدوجة

Fixation and Confocal Imaging of Germinal Vesicle-Oocyte Collected from CD-1 Mice

Place the control and etoposide-treated germinal vesicle, or GV, oocytes in different plastic tissue culture dishes with PFA-Tx 100 buffer for 40 minutes at room temperature. Rinse the oocytes in three distinct 50-microliter washing buffers at room temperature and place them in 25 microliters of blocking buffer on a hot block for one hour. Next, prepare the primary antibody that recognizes gamma H2AX.Dilute the primary antibody with the blocking buffer at a one to 200 ratio and immerse the oocytes in 15-microliter drops at four degrees Celsius overnight. Wash the oocytes in three different 50-microliter washing buffers. Prepare the Alexa Fluor 488 conjugated growth anti-rabbit secondary antibody.After diluting it with the blocking buffer, immerse the oocytes in 15-microliter drops of the antibody for one hour on a 37 degrees Celsius hot block protected from light. Take a far-red fluorescent DNA dye DRAQ7 and transfer the oocytes to it for 10 minutes at room temperature in the dark before washing them with three different washing buffers. Add small drops of washing buffer to the oocytes in a 35-millimeter glass-bottom Petri dish for confocal microscopy.Switch on the laser controller and the lasers in the confocal system. After turning on the microscope controller and the lamps, open the confocal software and choose the 40X oil lens. Place the dish with the oocytes into the specimen holder and try to focus on the oocytes by moving the stage on X, Y, and Z axes using the joystick.Set the laser power, the gain, and the pinhole size independently for each experiment to minimize any saturation. For each oocyte, set the area of interest specifically in the nucleus at the DNA area. Define the borders of the DNA area and adjust the Z-step size to three micrometers.Then start the scanning. Save the images for each cell in the selected folder. Open the ImageJ software and click on image, followed by color, and split channels.To split all the channels. Click on lookup table and choose the preferred colors for each channel Click on image, color, and merge channels to merge the channels for gamma H2AX and DNA. In the surrounded nucleolus oocytes with high levels of DNA damage, click on image, stacks, Z-project, and with the freehand selections command, select the entire DNA area.Click on analyze, followed by measure to measure the gamma H2AX fluorescence and copy the measurements into an Excel file. The gamma H2AX fluorescence in the surrounded nucleolus GV stage oocytes zero hours after the etoposide treatment is shown in this figure. The gamma H2AX increases immediately after the exposure at all the etoposide concentrations, and the increase is concentration-dependent.The gamma H2AX fluorescence in the surrounded nucleolus GV stage oocytes 20 hours after the etoposide treatment is shown here. Gamma H2AX reduces 20 hours after the exposure at all the etoposide concentrations. After protracted prophase arrest, the GV stage oocytes showed the capacity to reduce the gamma H2AX foci number and intensity, implying the presence of active repair processes in the GV stage arrested oocytes.