يستخدم مختبرنا ذبابة الفاكهة ككائن حي نموذجي لدراسة كيفية معالجة معلومات الذوق من خلال الدوائر العصبية من الكشف عن المواد الكيميائية إلى التأثير على السلوك. نحن نستخدم بروتوكول التصوير هذا لتحديد خلايا التذوق التي تستجيب للأحماض الأمينية وتحديد ما إذا كانت الحالات الداخلية المختلفة تعدل كيفية استجابة خلايا التذوق لهذه العناصر الغذائية الأساسية. تتمثل إحدى مزايا نهج تصوير الكالسيوم هذا في أنه يسمح بتسجيل الاستجابات العصبية الناجمة عن الذوق من خلايا معينة في المستيقظة حيث تظل الحالات الداخلية سليمة.
يمكننا الآن تحديد دوائر التذوق المفترضة في ذبابة الفاكهة الجديدة العصبية الدماغية الكاملة والتحقق من ديناميكيات الخلايا العصبية الوظيفية في الجسم الحي باستخدام نهج تصوير الكالسيوم هذا. للبدء ، ضع الذبابة المخدرة تحت مجهر التشريح. باستخدام مقص التشريح ، قم بإزالة الساقين الوسطى والخلفية في مفصل الظنوب الفخذي والأرجل الأربعة عند المدور.
التقط الذبابة من الأجنحة باستخدام ملقط غير حاد لوضعها مع الرأس فوق فتحة عنق الرحم المستهدفة في غرفة التصوير مع إبقاء الجسم أدناه. باستخدام الجانب الحاد من المقص والملقط غير الحاد ، ادفع الرأس والصدر برفق في وقت واحد في الفتحة. بمجرد أن تصبح الذبابة داخل الفتحة بإحكام ، ادفعها إلى الخلف وأعد وضعها برفق بحيث تواجه مقدمة الغرفة.
اجمع قطرة صغيرة من طلاء الأظافر في نهاية عود الأسنان وقم بتطبيق طبقة رقيقة لتثبيت رأس الذبابة في غرفة التصوير. التقط الشمع بيد واحدة واجمع قطرة صغيرة من الشمع على الحافة. باستخدام ملقط شبه حاد ، من ناحية أخرى ، أمسك بلمس الفك العلوي واسحب خرطوم برفق وأمسك بالخرطوم في امتداد كامل.
المس طرف الشمع بالغرفة بالقرب من قاعدة خرطوم حتى يبدأ الشمع في التدفق. تحرك للتلامس مع قاعدة خرطوم والشمع في منتصف الطريق أسفل العمود ، وتجنب ملامسة الملصقات sensilli. ثم قم بتمديد خرطوم بالكامل بشكل مستقيم قدر الإمكان.
الآن ضع الذباب المركب في غرفة الرطوبة لمدة 60 دقيقة للتعافي. قم بإزالة الذباب من غرفة الرطوبة. باستخدام ملقط حاد جدا ، قم بقرص كل من الهوائيات ، واضغط على البشرة لإنشاء ثقب ، وأدخل جانبا واحدا من الملقط الحاد.
مرر الملقط أسفل البشرة لإزالتها من المنطقة التي تغطي منطقة الدماغ التي تهمك. لغسل الدماغ المكشوف ، أضف ما يقرب من 100 ميكرولتر من محلول الهيموليمف الاصطناعي ، أو AHL ، إلى الرأس. بعد الغسيل ، قم بإزالة AHL ، مع ترك طبقة رقيقة لمنع الدماغ من الجفاف.
باستخدام ملقط حاد ، قم بإزالة أكياس الهواء وأي حطام كبير يغطي الدماغ. لتصوير المنطقة تحت المريء على وجه التحديد ، قم بقطع المريء في القاعدة بالقرب من خرطوم وعند النقطة التي يمر فيها عبر الدماغ ، باستخدام ملقط حاد جدا. قم بإزالة هذه القطعة لفضح المنطقة الاقتصادية الخاصة.
تحت مجهر التشريح ، ضع زلة الغطاء مقاس 10 × 20 ملم في الفتحة الزاوية لغرفة التصوير. قم بتحميل ما يقرب من ميكرولتر من الماء ، أو عنصر تحكم سلبي آخر ، في الأنبوب الشعري. حدد موقع الذبابة التي تم تشريحها وركز على الملصق باستخدام هدف المجال الساطع بالغمر في الهواء بمقدار 10x.
قم بمحاذاة الشعيرات الدموية مع العلامة تحت عرض 10x. اترك الوضع الشعري مباشرة أمام الملصق مع التأكد من أنه قريب ولكن ليس ملامسا. حرك المسرح لتوسيط منطقة الدماغ التي تهمك.
قم بالتبديل إلى هدف الغمر في الماء مع التكبير الأعلى، مثل الهدف 40x. أضف ما يقرب من 200 ميكرولتر من AHL أعلى الدماغ لضمان ملامسة هدف الغمر. قم بالتبديل إلى طاقة ليزر 488 نانومتر لتحديد تعبير GCaMP في مجال الاهتمام.
بعد جمع خمس ثوان على الأقل من التألق الأساسي ، حرك المحفز يدويا بحيث يغطي الشعيرات الدموية الملصق لمدة خمس ثوان. قم بإزالة الحافز واستمر في الالتقاط طالما رغبت في ذلك. بعد ذلك ، قم بإزالة AHL والعودة إلى الحقل الساطع 10x للتأكد من أن زلة الغطاء والمحفز والملصق تظل في الموضع الصحيح.
ثم قم بإزالة حجرة التصوير واستخدم منديلا خاليا من النسالة لإزالة المحلول الأول من الشعيرات الدموية. اغسل الماصة بالماء، وقم بتحويل الماصة إلى ما يقرب من ميكرولترين من الطعم التالي في الأنبوب الشعري. كان التغير الفلوري النسبي في ذباب Gr64f GCaMP أعلى بكثير لتحفيز السكروز مقارنة بالماء ، مما يدل على استجابة قوية ومستدامة للخلايا العصبية المستقبلة الذوقية الحلوة.
كانت ذروة التألق النسبية لتحفيز السكروز أكبر بكثير من تلك الموجودة في الماء. كان التغير الفلوري في ذباب Gr66a GCaMP أعلى بكثير لتحفيز الكافيين منه بالنسبة للماء ، مما أظهر استجابة لظهور الكافيين وإزالته. كان نمط الإسقاط لأطراف المحور العصبي في ذباب Gr66a مختلفا عن نمط Gr64f ، مما يدل على الفصل التشريحي للخلايا العصبية المستقبلة الذوقية المستشعرة للمر والسكر.
