يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الأساسية في مجال السمع والتوازن. وهو يصف كيفية الكشف عن جانبين هامين من وظائف خلايا الشعر الحسية، mechanotransduction والنشاط presynaptic. المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح لنا بتصور وظيفة خلايا الشعر في حي ، ودراسة كيفية اكتشاف مجموعات خلايا الشعر ونقل المعلومات الحسية.
لبدء هذا الإجراء ، استخدم ملقط غرامة وسلك التنغستن لأزياء الدبابيس لاستخدامها لشل حركة اليرقة من خلال الرأس والذيل ، على انكبسولانت تصلب. لجعل دبابيس الرأس، عقد قطعة من 0.035 ملليمتر سلك التنغستن في يد واحدة. باستخدام ملقط غرامة في اليد الأخرى، ثني السلك ملليمتر واحد من نهاية، في 90 درجة.
تبادل ملقط لمقص غرامة، وقطع ملليمتر واحد بعد الانحناء، لإنشاء دبوس. ثم استخدام ملقط لإدراج دبابيس في التغليف تصلب على الغرفة. ضع اليرقة في مركز غرفة الضخ بحيث تقع مسطحة على جانبها ضد السيليكون.
باستخدام ملقط غرامة، وجلب دبوس الرأس 0.035 ملليمتر إلى أسفل عمودي على اليرقة. إدراج دبوس الرأس بين العين والزهية otic، وإلى أسفل في encapsulant. استخدام مجموعة ثانية من ملقط لتحقيق الاستقرار اليرقة على طول الجانب الظهري والبنتينتال، في حين تعلق.
تأكد من أن الجزء الأفقي من دبوس اتصالات اليرقة ولا تضغط على طول الطريق إلى encapsulant. زاوية فيبطينا دبوس، أو مشيرا قليلا نحو الجزء الأمامي من اليرقة، لتجنب التدخل في حقن القلب اللاحقة وتصوير خلايا الشعر. باستخدام ملقط، إدراج دبوس ذيل 0.025 ملليمتر في نوتوكورد، أقرب ما يمكن إلى نهاية الذيل.
لحقن البونغاروكسيون ألفا في اليرقة، الردم ثلاثة ميكرولترات من المحلل في إبرة الحقن، وذلك باستخدام تلميح ماصة هلام التحميل. تحميل الحل بالتساوي إلى طرف، مع عدم وجود فقاعات. ثم أدخل إبرة حقن القلب في حامل ماصة مرفقة بمترجم دقيق يدوي.
تحت مجهر ستيريو، ضع الإبرة بحيث يتم محاذاتها عمودياً على محور AP لليرقة المُعامَدة، مع الإشارة إلى أسفل بزاوية 30 درجة. المقبل، ربط حامل ماصة إلى حاقن الضغط. حقن بولوس من بونغارotoxin ألفا في الحل، لاختبار ما إذا كان تلميح إبرة واضحة.
إذا لم ينظر إلى اللون الأحمر، كشط بلطف جدا تلميح إبرة ضد حافة دبوس، وحاول مرة أخرى، حتى الإبرة واضحة. في وقت لاحق، تقدم الإبرة نحو القلب، حتى تلامس الجلد خارج القلب. اضغط الإبرة في اليرقة ، وابحث عن المسافة البادئة للخلية الصباغية على الجلد أمام القلب للتأكد من وضع الإبرة في الطائرة الصحيحة ، نسبة إلى اليرقة.
ثم، تقدم الإبرة أبعد، حتى يخترق الجلد ويدخل تجويف القلب. سحب الإبرة إلى الوراء قليلا، وحقن بولوس من بونغاروكسيمين ألفا في تجويف القلب. ابحث عن تضخم تجويف القلب، أو للصبغة الحمراء التي تدخل التجويف.
شطف اليرقة بلطف ثلاث مرات ، مع ملليلتر واحد من المخزن المؤقت العصبي لإزالة MS222 المتبقية. لا تقم بإزالة كل السائل. الحفاظ على اليرقة في ما يقرب من 1 ملليلتر من العازلة العصبية في غرفة الضخ.
في هذا الإجراء الردم 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت نيرونال في إبرة مكسورة بشكل صحيح السائل النفاث باستخدام تلميح تحميل هلام. تحميل الحل بالتساوي إلى طرف دون فقاعات. ثم، أدخل الإبرة في حامل الماصات المرفقة بالمانوميبولات الآلية.
ضع غرفة التسريب في محول غرفة دائرية على مرحلة المجهر. نقل المرحلة الآلية بحيث تكون اليرقة في وسط مجال الرؤية. في وقت لاحق ، قم بتشغيل محول الغرفة الدائرية بحيث يتم محاذاة وصول AP إلى اليرقة تقريبًا مع مسار إبرة السائل النفاث.
باستخدام الضوء المنقول والتداخل التفاضلي النقيض، جعل اليرقة في التركيز ومركزها تحت الهدف 10x. ثم، رفع الهدف 10x. باستخدام micromanipulator الآلية، وجلب إبرة السائل النفاثة إلى أسفل إلى وسط مجال الرؤية، لذلك يتم مضيئة من قبل الضوء المنقول وبالكاد لمس العازلة العصبية.
خفض الهدف 10x للتركيز على اليرقة من أجل تأكيد موقعها. فووس الهدف على إبرة السائل النفاثة. حرك إبرة السائل النفاثة مع المايكرومانيبولاتور في محور س و ص حتى تكون في وضع مواز للجانب الظهري من اليرقة.
بعد ذلك ، ركز مرة أخرى على اليرقة. جلب الإبرة إلى أسفل في محور ض ووضع الإبرة على طول الجانب الظهري من الأسماك، 1 ملليمتر بعيدا عن الجسم. قم بتحريك محول الغرفة الدائري بعناية لضمان محاذاة إبرة السائل النفاثة على طول خط منتصف اليرقة AP.
بعد ذلك، انتقل إلى الهدف 60x المياه. تأكد من أن الهدف هو emersed في المخزن المؤقت العصبي. استخدام التركيز غرامة لتحديد مكان العصبية.
نقل مرحلة motarized في وقت لاحق لوضع العصبية من الفائدة في مركز مجال الرؤية. الحفاظ على تلميح إبرة نفاثة السوائل على طول الجانب الظهري من الأسماك. لا تلمس تلميح إبرة السائل النفاث إلى اليرقة أو سطح الغرفة.
ضع إبرة السائل النفاثة مع ميكرومانبولاتور بحيث تكون 100 ميكرومتر من الحافة الخارجية للstmast. ثم، والتركيز على نصائح من حزم الشعر apical. يجب أن يكون الجزء السفلي من إبرة السائل النفاثة في التركيز في هذه الطائرة.
قم بتعيين المشبك عالي السرعة من الدليل إلى الوضع الخارجي لتلقي مدخلات من برنامج التصوير. صفر المشبك الضغط عالية السرعة عن طريق الضغط على زر الصفر، واستخدام مقبض نقطة تعيين لضبط الضغط يستريح إيجابية قليلا. تأكد من إخراج الراحة من المشبك ضغط السرعة العالية باستخدام مانديوميتر PSI تعلق على إخراج مرحلة الرأس.
لتحديد الضغط اللازم لتحفيز حزم الشعر، وتطبيق التحفيز اختبار مع 0.125 و 0.25 فولت الإخراج ل200-500 ميلي ثانية. لكل حافز اختبار، وقياس المسافة من انحراف من نصائح من hairbundles، و kinocilia. اختر الضغط الذي يحرك الحزم على مسافة 5 ميكرومتر تقريبًا.
تأكد من أن نصائح kinocilia تبقى في التركيز طوال الوقت. للحصول على صور ذات مستوى واحد، حدد حافزًا لتقديمه أثناء عملية الاستحواذ على الإطارات 80، بعد الإطار 30، في 3 ثوانٍ. لقياس استجابات الكالسيوم الحساسية، والتركيز على قاعدة حزم الشعر apical والبدء في الحصول على صورة.
لقياس استجابات الكالسيوم presynaptic، والتركيز على قاعدة خلايا الشعر، والبدء في الحصول على صورة. وترد هنا الخطوات اللازمة لتصور التغيرات الزمانية في كثافة GCaMP6S، داخل نطاق عصبي أثناء المحاكاة. يتم تمثيل الوقت من اليسار إلى اليمين وفقا للطابع الزمني.
يظهر الصف العلوي خمسة من أربعة عشر صناديق الزمنية من تسلسل صورة GCaMP6S F 70 إطار. في الصف الثاني، تمت إزالة الخط الأساسي من كل صورة GCaMP6S F binned لإنشاء صور دلتا F. في الصف الثالث، تم تحويل الصور دلتا F من مقياس رمادي، إلى جدول بحث ساخن أحمر.
في الصف السفلي، تم تراكب الصف الثالث على الصور F في الصف العلوي. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن تتذكر التأكد من أن اليرقة مثبتة بشكل صحيح وأن تستخدم عناصر التحكم المناسبة، كما هو موضح في المخطوطة لاستبعاد الآثار المتحركة من بياناتك. يمكن أن يكون العمل مع البونغاروكسيسين ألفا خطرة.
من المهم اتخاذ الاحتياطات، مثل ارتداء القفازات أثناء التعامل معها.
