الخطوة 1 : ذوبان الجليد من أصل 293 لوحة والخلايا لإنتاج الفيروسة البطيئة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 9 مل من المتوسط ​​+ DMEM في أنبوب 15 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة 293 قنينة من الأسهم المجمدة من خزان النتروجين السائل ووضع القارورة في حمام ماء C ° 37 حتى يتم إذابة الخلايا معظم (ولكن ليس كلها). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الخلايا من قارورة تجميد ومكان داخل الأنبوب 15ml من الخطوة 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي في 180g لمدة 5 دقائق ، ثم تجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخلايا مع 10 مل من المتوسط ​​+ DMEM ، ونقل إلى صحن 100 ملم الجيلاتين المغلفة. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية ، و 5 ٪ CO 2 الحاضنة حتى يتم متموجة 80-90 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرور 293 من الخلايا : الخلايا يغسل مع برنامج تلفزيوني ، نضح في برنامج تلفزيوني ، وإضافة 4 مل لكل 10 سم ، وطبق من 0.05 ٪ trypsin/0.53 ملي EDTA ، واحتضان ل1 دقيقة عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل الخلايا من الأطباق من خلال استغلال ، مع resuspend DMEM مل 10 + المتوسطة ، ونقل إلى أنبوب 15 مل. الطرد المركزي في 180g لمدة 5 دقائق ، ونضح وطاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة حجم مناسب لDMEM + المتوسطة ، وتفتيت الخلايا في خلية واحدة من قبل تعليق pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب عدد الخلايا وضبط تركيز على الخلايا 8X10 في 5 مل مع FP المتوسطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا المصنف في الخلايا 6 8X10 (10 مل) في صحن الثقافة 100 ملم ، واحتضان ليلا 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2. </li></ol> الخطوة 2 : 293 Transfect الخلايا مع البلازميدات الفيروسة البطيئة وفيروس الحصاد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عن كل لوحة 10 سم ، 10 ميكروغرام من استخدام FUW - تيتو ، [كدنا] (Oct4 ، Sox2 ، أو Klf4 Myc ج) العمود الفقري لل2.5ug الفيروسة البطيئة مع PMD - G و 7.5 ميكروغرام من pPax2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وبينما aliquoting البلازميدات الثلاثة في أنبوب ، وتقديم 30μl من كاشف Fugene ترنسفكأيشن 6 في أنبوب ثانية تحتوي على 500μl DMEM من دون خلط المصل وبلطف بواسطة الإصبع التنصت واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة مزيج الحمض النووي قطرة تلو قطرة في أنبوب Fugene 6/DMEM-containing ، مزيج بلطف التنصت على اصبع واحتضان لمدة 20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة DNA / 6 Fugene قطرة قطرة المعقدة الى الطبق من 293 ، واحتضان ليلا 37 درجة مئوية ، و 5 ٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صباح اليوم التالي : نضح في ترنسفكأيشن كاشف المحتوية على المتوسط ​​، اضافة 5 مل من جديد وفاق المتوسط ​​الخلية ، والعودة إلى الخلايا الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في 48 ساعة و 72 ساعة بعد ترنسفكأيشن ، وجمع من المتوسط ​​في 293 وباستخدام 10 مل المحاقن المعقمة المتاح ، من خلال تصفية حجم المسام 0.45 ميكرون تصفية - خلات السليلوز ، ونقل في أنبوب 15 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طاف تركيز الفيروس عن طريق تنبيذ فائق. Resuspend الكرية الفيروس في الحجم المطلوب وجعل amixture من أجزاء متساوية من المتوسط ​​تحتوي على Oct-3/4- ، Sox2 ، Klf4 و- C - Myc lentiviruses. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين جعل الفيروس ، أو إعداد Oct4-neo/rtTA MEFs Oct4-GFP/rtTA (مرور &lt;3) إلى 90 ٪ confluency في 10 سم ، والأطباق (2x10 6 خلايا في طبق) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح على المديين المتوسط ​​والثقافة ، وتغسل مع 10 مل من برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل برنامج تلفزيوني ، إضافة 1 مل لكل طبق من 0.05 ٪ trypsin/0.53 ملي EDTA ، واحتضان في 37 دقيقة لمدة 10 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 9 مل من المتوسط ​​الثقافة ، ووقف الخلايا لخلية واحدة ، ونقل إلى أنبوب 15 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب عدد الخلايا ، وضبط تركيز على الخلايا 4 8X10 لكل مليلتر. نقل 10 مل من التعليق الخلية (8X10 5 خلايا) على طبق 10 سم مغلفة مع الجيلاتين. احتضان الطبق بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح المتوسط ​​من الطبق الليفية ، وإضافة 10 مل من المتوسط ​​تحتوي على الفيروس. احتضان الخلايا من 4 ساعات ليلة وضحاها إلى 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 24 نضح المتوسط ​​طبق من الخلايا الليفية ، وإضافة 10 مل من جديد وفاق متوسط ​​الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال الخلايا العادية المتوسطة وفاق مع دوكسي المتوسط ​​تحتوي على الشروع في التعبير عن الجينات الأربعة ؛ وبعبارة أخرى ، والشروع في إعادة برمجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا باستخدام مراسل Oct4 الجدد ، ثم الشروع في القسم المخدرات في أي وقت ما بين 6 و 9 أيام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير المتوسط ​​كل يوم حتى تصبح مستعمرات كبيرة بما يكفي ليتم انتقاؤها. وينبغي أن المستعمرات بهذا يصبح مرئية تقريبا بعد اسبوع من بدء إعادة برمجة. ينبغي أن تصبح كبيرة بما يكفي لتكون التقطت حوالي 20 يوما. </li></ol> الخطوة 3 : التقاط المستعمرات الجذع اليوم قبل الإلتقاط : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البذور العدد المطلوب من لوحات 24 الجيلاتين المغلفة جيدا مع MEFs DR4 γ - المشع </li></ol> قطف المستنسخون يوم 1 : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغذية المستعمرات على لوحات 1-2 قبل ساعات من حصوله. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة ميكرولتر من 15 برنامج تلفزيوني على طبق من الآبار V - 96 - القاع أيضا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الأطباق التي تحتوي على ويمكن الحصول عليها المستعمرات مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني وإضافة إلى برنامج تلفزيوني 10ML من الطبق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار المستعمرات مع نصائح الماصة 5μl الصغيرة (تعيين pipetman P20 في 4 ميكرولتر). نقل المشتركlonies إلى بئر في الصحن 96 - جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 20 ميكرولتر التربسين إلى كل من به جيدا متعدد القنوات (12) pipetor. الماصة صعودا وهبوطا 3 مرات. احتضان في 37 لمدة 4 دقائق درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من وفاق المتوسط ​​إلى المستعمرات trypsinized. الماصة صعودا ونزولا 10 مرات. 6 نقل الحيوانات المستنسخة في وقت واحد من الطبق إلى جانب 96 - 24 - طبق بشكل جيد باستخدام معلومات سرية في كل مركز آخر في مكان pipetor 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو الخلايا على لوحة ال 24 بشكل جيد في 37 درجة مئوية ، و 5 ٪ CO 2 حاضنة حتى تصل إلى 80-90 ٪ الخلايا confluency ، تغذية يومية مع وفاق متوسط ​​الخلية. وسوف يكون على الارجح خلايا جاهزة للتوسع في 3-7 أيام. </li></ol> الخطوة 4 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التوسع في خلايا الجذع <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح المتوسط ​​، وغسل الخلايا مع 1 مل من برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة PBS تماما ، إضافة 0.1 مل من 0.25 ٪ التربسين / 1 ملم واحتضان EDTA عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.4 مل من المتوسط ​​وفاق وتعليق الخلايا pipetting صعودا وهبوطا إلى تعليق خلية واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل تعليق خلية إلى جانب لوحة 6 - جيدا ، إضافة 1.5 مل الخلية ES المتوسطة واحتضان في 37 درجة مئوية ، و 5 ٪ CO 2 الخلايا الحاضنة حتى تصل 80-90 ٪ confluency في 6 لوحات جيدا. عند هذه النقطة ، إعداد الأوراق المالية المجمدة للخلايا ، كما يلي. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد تجميد الأسهم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح المتوسط ​​، وغسل الخلايا مع 2 مل من برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة PBS تماما ، إضافة 0.5 مل من 0.25 ٪ التربسين / 1 ملم واحتضان EDTA عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2 مل من المتوسط ​​وفاق وتعليق الخلايا pipetting صعودا وهبوطا إلى تعليق خلية واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعليق نقل الخلية إلى أنبوب 15 مل ، وحساب عدد الخلايا وتدور باستمرار الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف ، resuspend الخلايا مع وفاق المتوسط ​​للتركيز على الخلايا 2x10 في 6 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 إعداد تجميد الخلايا المتوسطة ES (DMSO 20 ٪ في المتوسط ​​ES) وقسامة أنه عند 0.5 مل في القارورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 0.5 مل من تعليق لتجميد الخلايا قنينات والمزيج بلطف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع قنينة في حاوية تجميد الخلايا والحفاظ عليه في -80 درجة مئوية بين عشية وضحاها ، ونقل إلى النيتروجين السائل في اليوم التالي للتخزين الطويل الأجل. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li><li>Wernig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al+.+In+vitro+reprogramming+of+fibroblasts+into+a+pluripotent+ES-cell-like+state.">et al . In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state.</a> Nature. 448, 318-324 (2007).</li><li>Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+germline-competent+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 448, 313-317 (2007).</li><li>Maherali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+epigenetic+remodeling+in+directly+reprogrammed+fibroblasts.">Global epigenetic remodeling in directly reprogrammed fibroblasts.</a> Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).</li><li>Brambrink, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+expression+of+pluripotency+markers+during+direct+reprogramming+of+somatic+cells.">Sequential expression of pluripotency markers during direct reprogramming of somatic cells.</a> Cell Stem Cell. 2, 151-159 (2008).</li></ol>

في هذا الفيديو ، ونحن لشرح كيفية استخدام محرض ، ونظام لتوليد lentiviral GFP إيجابية ، المحفزة الجذع خلايا من MEFs المستمدة من الفئران وOct4-GFP/R26-M2rtTA Nanog-GFP/R26-M2rtTA. هذا الإجراء هو وسيلة مفيدة لتوليد خلايا الجذع لأنه يسمح للتحكم في التعبير التحوير خلال عملية إعادة البرمجة. على الرغم من أن استخدام الفيروسات في توليد خلايا الجذع يعوق استخدام هذه الخلايا في عملية إعداد سريرية ، وهذا الإجراء لا تمكننا من الإجابة على بعض الأسئلة الرئيسية التي البيولوجية التأكيد على إعادة برمجة عملية محددة حتى الآن.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Doxycycline hyclate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>D9891-100G</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

generating ips cells from mefs through forced expression of sox-2, oct-4, c-myc, and klf4

يمكن أن يتسبب تعدد القدرات المتباينة في الفئران التي تنبيغ الفيروسية Oct4 ، Sox2 ، Klf4 و c - Myc (تاكاهاشي وياماناكا ، 2006 ؛ Wernig ، وآخرون ، 2007 ؛. أوكيتا ، وآخرون ، 2007 ؛. Maherali ، وآخرون ، 2007). لقد وضعنا استراتيجية إعادة برمجة التي يعبر عنها في هذه عوامل النسخ الأربعة من الدوكسيسيكلين (دوكس) - محرض ناقلات lentiviral (Brambrink وآخرون ، 2008). تستخدم هذه التركيبات محرض ، يمكننا استخلاص الجذعية المحفزة التي يسببها (آي بي إس) من الخلايا الليفية الماوس الجنينية (MEFs). في هذا الفيديو ، ونحن لشرح إجراءات لتوليد lentiviruses محرض التي تعبر عن عوامل النسخ الأربع وتظهر كيف أن تصيب هذه الفيروسات مع MEFs لانتاج خلايا الجذع. باستخدام lentiviruses محرض ، والتعبير عن العوامل الأربعة التي يسيطر عليها إضافة إلى doxycyline متوسطة الثقافة. ميزة هذا النظام أكثر من العدوى فيروسات التقليدية هي القدرة على تحويل الجينات على ذلك والتي يمكن الخروج بتحليل حركية ومتطلبات إعادة برمجة الجينات بالتفصيل.

Watch this Scientific Journal Video about Generating iPS Cells from MEFS through Forced Expression of Sox-2, Oct-4, c-Myc, and Klf4 at JoVE.com

Generating iPS Cells from MEFS through Forced Expression of Sox-2, Oct-4, c-Myc, and Klf4

هذا الفيديو يبين الداخلي الناجم عن توليد الخلايا الجذعية المحفزة باستخدام الفيروسة البطيئة التي تعبر عن محرض Oct4 ، Sox2 ، ج Myc وKlf4.

توليد خلايا الجذع من خلال التعبير MEFS القسري لل2 - سوكس ، أكتوبر 4 ، ج Myc وKlf4

Pluripotency can be induced in differentiated murine by viral transduction of Oct4, Sox2, Klf4, and c-Myc (Takahashi and Yamanaka, 2006;  Wernig, et al., ...

generating-ips-cells-from-mefs-through-forced-expression-sox-2-oct-4

Research

JoVE Journal

Biology

36.2K Views.  Whitehead Institute for Biomedical Research, Massachusetts Institute of Technology. هذا الفيديو يبين الداخلي الناجم عن توليد الخلايا الجذعية المحفزة باستخدام الفيروسة البطيئة التي تعبر عن محرض Oct4 ، Sox2 ، ج Myc وKlf4.

Video: Generating iPS Cells from MEFS through Forced Expression of Sox-2, Oct-4, c-Myc, and Klf4

From MEFs to Matrigel I: Passaging hESCs in the Presence of MEFs

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells.


This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells. Part 1 of 3.

من MEFs لMatrigel الأول : hESCs الركض في وجود MEFs

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells.
...

From MEFs to Matrigel 2: Splitting hESCs from MEFs onto Matrigel

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells, how to passage hESCs from MEF plates to feeder cell-free Matrigel plates.


This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage hESCs in feeder cell-free conditions. Confirmation of hESC pluripotency grown in feeder cell-free conditions by immunofluorescence microscopy is also demonstrated. Part 2 of 3.

من MEFs إلى 2 Matrigel : hESCs من تقسيم MEFs على Matrigel

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells, how to passage hESCs from MEF ...

From MEFs to Matrigel 3: Passaging hESCs from Matrigel onto Matrigel

This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage hESCs in feeder cell-free conditions. Confirmation of hESC pluripotency grown in feeder cell-free conditions by immunofluorescence microscopy is also demonstrated.

This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage hESCs in feeder cell-free conditions. Confirmation of hESC pluripotency grown in feeder cell-free conditions by immunofluorescence microscopy is also demonstrated. Part 3 of 3.

من MEFs لMatrigel 3 : hESCs من الركض على Matrigel Matrigel

This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

التحضير لزراعة الخلايا المكونة للدم الابتدائية من نخاع عظام الفئران لElectroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

تلطيخ من البروتينات في الهلام مع Coomassie G - 250 دون عضوي حمض الخليك والمذيبات

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

باستخدام الجينات Electroporation MXcell بولسير النظام لTransfect الخلايا الأولية ذات الكفاءة العالية

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

باستخدام خلية مكافحة الآلي لتبسيط دراسات التعبير الجيني : ضربة قاضية سيرنا من IL - 4 التعبير الجيني في الخلايا التابعة Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Cryopreserving and Recovering of Human iPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium

The discovery in 2006 that human and mouse fibroblasts could be reprogrammed to generate iPS cells 1-3 with qualities remarkably similar to embryonic stem cells has created a valuable new source of pluripotent cells for drug discovery, cell therapy, and basic research.
GIBCO media and reagents have been at the forefront of pluripotent stem cell research for years. Knockout DMEM supplemented with Knockout Serum Replacement is the media of choice for embryonic stem cell growth and now iPS cell culture 3-9. This gold standard media system can now be used for feeder-free culture with the addition of Knockout SR Growth Factor Cocktail.
Traditional human ES and iPS cell culture methods require the use of mouse or human fibroblast feeder layers, or feeder-conditioned medium. These culture methods are labor-intensive, hard to scale and it is difficult to maintain hiPS cells undifferentiated due to the undefined conditions. Invitrogen has developed Knockout SR Growth Factor Cocktail to allow you to easily transition your hiPS and hES cell cultures to feeder-free while still maintaining your use of Knockout SR.

This protocol describes the detailed procedure for cryopreserving human iPS cells in KnockOut SR cryopreservation medium and recovering these cells in complete KnockOut SR Feeder Free (KSR-FF) medium or feeder-based KnockOut SR medium.

Cryopreserving واسترداد خلايا الجذع من الإنسان الكامل باستخدام الضربة القاضية المصل الطاعم خالية استبدال متوسطة

The discovery in 2006 that human and mouse fibroblasts could be reprogrammed to generate iPS cells 1-3 with qualities remarkably similar to embryonic stem ...

A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. However, prokaryotic hosts are often not as appropriate for expression of human, viral or eukaryotic proteins due to toxicity of the foreign macromolecule, differences in the protein folding machinery, or due to the lack of particular co- or post-translational modifications in bacteria. Expression systems based on yeast (P. pastoris or S. cerevisiae) 1,2, baculovirus-infected insect (S. frugiperda or T. ni) cells 3, and cell-free in vitro translation systems 2,4 have been successfully used to produce mammalian proteins. Intuitively, the best match is to use a mammalian host to ensure the production of recombinant proteins that contain the proper post-translational modifications. A number of mammalian cell lines (Human Embryonic Kidney (HEK) 293, CV-1 cells in Origin carrying the SV40 larget T-antigen (COS), Chinese Hamster Ovary (CHO), and others) have been successfully utilized to overexpress milligram quantities of a number of human proteins 5-9. However, the advantages of using mammalian cells are often countered by higher costs, requirement of specialized laboratory equipment, lower protein yields, and lengthy times to develop stable expression cell lines. Increasing yield and producing proteins faster, while keeping costs low, are major factors for many academic and commercial laboratories.
Here, we describe a time- and cost-efficient, two-part procedure for the expression of secreted human proteins from adherent HEK 293T cells. This system is capable of producing microgram to milligram quantities of functional protein for structural, biophysical and biochemical studies. The first part, multiple constructs of the gene of interest are produced in parallel and transiently transfected into adherent HEK 293T cells in small scale. The detection and analysis of recombinant protein secreted into the cell culture medium is performed by western blot analysis using commercially available antibodies directed against a vector-encoded protein purification tag. Subsequently, suitable constructs for large-scale protein production are transiently transfected using polyethyleneimine (PEI) in 10-layer cell factories. Proteins secreted into litre-volumes of conditioned medium are concentrated into manageable amounts using tangential flow filtration, followed by purification by anti-HA affinity chromatography. The utility of this platform is proven by its ability to express milligram quantities of cytokines, cytokine receptors, cell surface receptors, intrinsic restriction factors, and viral glycoproteins. This method was also successfully used in the structural determination of the trimeric ebolavirus glycoprotein 5,10.
In conclusion, this platform offers ease of use, speed and scalability while maximizing protein quality and functionality. Moreover, no additional equipment, other than a standard humidified CO2 incubator, is required. This procedure may be rapidly expanded to systems of greater complexity, such as co-expression of protein complexes, antigens and antibodies, production of virus-like particles for vaccines, or production of adenoviruses or lentiviruses for transduction of difficult cell lines.

In the post-human genomics era, the availability of recombinant proteins in native conformations is crucial to structural, functional and therapeutic research and development. Here, we describe a test- and large-scale protein expression system in human embryonic kidney 293T cells that can be used to produce a variety of recombinant proteins.

ومنهاج عمل مريحة والتعبير العام لانتاج البروتينات يفرز من خلايا الإنسان

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

سيرنا فحص لتحديد اليوبيكويتين واليوبيكويتين مثل المنظمين نظام مقررات تمهيدية البيولوجية في خلايا الثدييات مثقف

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...