1. إزالة الجنين والمشيمة تشريح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتبدأ ، يجب أن تكون معزولة أول أجنة الحوامل من السدود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يصرح باستخدامها في الحيوانات وفقا للإجراءات المعتمدة -- في حالتنا نحن نذهب إلى استخدام جرعة قاتلة من مخدر isoflurane </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أولا ، مع رش بطن الإيثانول وإحداث شق صغير مع زوج من مقص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعيدا المسيل للدموع على الجلد بكلتا يديه لكشف البطن وخفض فتح البريتوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بالملقط ، والتقاط قرون الرحم وجمعها باستخدام مقص في نهاية كل القاصي. مكان القرون الرحم في طبق بتري مليئة PBS ومكان على الجليد. أيضا ، تذكر أن يغسل عدة مرات مع برنامج تلفزيوني قبل عزل المشيمة. يمكننا الآن عزل المشيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع اثنين من الملقط ، تبدأ عملية التقشير بعناية بعيدا عن الأنسجة المحيطة conceptuses بطانة الرحم الجنين. وينبغي للمرء أن يكون حريصا على عدم إلحاق ثقب أو خلاف ذلك الضرر الهيكلي للأجنة ، لأن هذا سيؤدي إلى تعقيد خطوات تشريح لاحقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع conceptuses معزولة في طبق بتري جديدة مع برنامج تلفزيوني على الجليد وتستمر حتى يتم الافراج عن جميع conceptuses من بطانة الرحم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل أحد المستكن في طبق بتري جديدة مع برنامج تلفزيوني وضعت تحت المجهر وملقط مع اثنين من قشر الساقط بعيدا عن المشيمة. إزالة أكبر قدر من الساقط ممكن الخلايا الساقط سوف تتداخل مع وحيدة الخلية التعليق والتدفق الخلوي. ينصح سلاسة الحركة تقشير المستمر لتحقيق أفضل النتائج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع الكيس المحي بعيدا من المشيمة عند تقاطع بين الجهازين وسحب الكيس بلطف صفار المحية والسفن بعيدا عن المشيمة. وينبغي الحرص على عدم تعطيل لوحة المشيمي من المشيمة ، وخصوصا مع أجنة مبكرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد بعناية لوحة المشيمي من المشيمة مع زوج واحد من الملقط والحبل السري مع آخر ، وسحب الحبل السري والجنين تعلق بعيدا عن المشيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الزائدة نسيج الخلايا العملاقة على حواف المشيمة من أجل تقليل الخلية التثاقل خلال إعداد وحيدة الخلية تعليق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع المشيمة في وعاء مناسب ، مثل انبوب فالكون 15 مل ، مع ٪ PBS FCS +5 ، وعلى الجليد. نفعل ذلك لجميع مشيمة تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند هذه النقطة ، يمكنك إما المضي قدما في إعداد تعليق وحيدة الخلية عن التدفق الخلوي ، المقايسات وظيفية ، مثل الثقافة في المختبر أو زرع ، أو إعداد المشيمة بأكملها لتثبيت الأنسجة والمجمدة كتلة ثابتة لتضمين المناعية في نهاية المطاف. </li></ol> 2. إعداد وحيدة الخلية تعليق من نسيج المشيمة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وسوف نعرض لك الآن كيفية إنشاء تعليق خلية واحدة من المشيمة للتحليل FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد تعليق خلية واحدة من المشيمة والميكانيكية والأنزيمية تفارق هو مطلوب. إعداد أول حل كولاجيناز 0.1 ٪ في برنامج تلفزيوني مع FCS 10 ٪ و 1 ٪ حل البنسلين / الستبرتوميسين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة حجم مناسب لإيجاد حل للمشيمة كولاجيناز ، اعتمادا على كيفية العديد من لديك. ينصح حدة التخزين التي هي ضعف حجم المشيمة وبين 5ml - 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام إبر 16 - G تركيبها على حقنة 5 مل لتعطيل ميكانيكيا بواسطة نسيج الركض الحل كولاجيناز والمشيمة من خلال إبرة 3 مرات. كرر بإبرة 18 - G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان العينة في 37 درجة مئوية ، و 5 ٪ CO 2 الحاضنة لمدة 45 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 45 دقيقة في الحضانة ، كولاجيناز مرور حل الخلية من خلال إبرة 20 - G ، واحتضان ل45 دقيقة إضافية ، في 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد ساعة حضانة 1.5 في مجموع ، كولاجيناز مرور حل الخلية من خلال مجموعة ال 22 والإبر 25 - G 3 مرات مع كل إبرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصفية العينة من خلال تصفية 50 ميكرومتر موصولة إلى أنبوب جديد فالكون 15 مل ، ويغسل مع FCS PBS +5 ٪ وأجهزة الطرد المركزي في 4 لمدة 5 دقائق درجة مئوية في 300 × ز </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند هذه النقطة ، لدينا تعليق خلية واحدة مناسبة لتحليل FACS أو المقايسات الفنية. </li></ol> 3. لتثبيت الأنسجة الأقسام مجمدة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مباشرة بعد عزل كل من مشيمة الجنين ، يتم وضعها في برنامج تلفزيوني 1X الباردة. عادة ما يكون لوحة 96 - جيدا يعمل على نحو أفضل للمشيمة الشباب (E8.5 - 11.5) ، ولكن مع كبار السن والمشيمة ، E12.5 وكبار السن ، لوحة 24 كذلك قد تكون أكثر ملاءمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم نقل كل جديد في المشيمة شغلها بشكل جيد مع إذابة paraformaldahyde طازجة أو 4 ٪ PFA. للمشيمة E12.5 ، يتم نقل الأنسجة لحفر بئر جديدة من جهة ، ولكن بالنسبة للE10.5 يمكنك إزالة برنامج تلفزيوني مع ماصة بعناية وإضافة PFA. من المهم أن يتم مغمورة تماما المشيمة لمدة 2-4 ساعات في 4 درجات مئوية ، اعتمادا على عمر وحجم الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الأنسجة في السكروز 30 ٪ ، أو إذا كان أنسجة صغيرة جدا وهشة ، ونضح PFA وإضافة السكروز مباشرة. في هذه المرحلة ، سوف تكون المشيمة العائمة في الحل. ترك المبيت في الأنسجة 4 درجات مئوية.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الخطوة بين عشية وضحاها في السكروز 30 ٪ ، يجب أن الأنسجة تغرق في نهاية المطاف إلى قاع البئر ، مما يدل على الحفظ بالتبريد المناسبة. إزالة نصف حل واستبدال السكروز مع حجم ومكان أكتوبر النسيج مرة أخرى في 4 درجات مئوية لمدة 1-2 ساعات. هذا يسهل أكتوبر الاختراق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الأنسجة إلى أكتوبر بنسبة 100 ٪ لمدة 1 ساعة ، وبعد ذلك يمكن أن تكون جزءا لا يتجزأ من ذلك. </li></ol> 4. تضمين الأنسجة الثابتة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قوالب من البلاستيك مع تحديد التسمية المناسبة الأنسجة (العفن تظهر مثلا). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب الأنسجة حل للخروج من أكتوبر وقطع المشيمة في النصف بحلول توجيه المشيمة على شكل قرص مع الجانب السري الحبل لأسفل وتشريح بعناية بشفرة حلاقة نظيفة مع التأكد من نقل شفرة ذهابا وإيابا قبل إطلاق الضغط لضمان خفضا أكبر. يتم قطع المشيمة في نصف لتحقيق أفضل prientation لتصور في وقت لاحق HSCs المشيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> half مكان المشيمة واحد في الجزء السفلي من العفن مع حافة قطع الاتصال مع السطح السفلي من العفن. مع تكرار قالب جديد للنصف الآخر. للمشيمة E10.5 ، قد وضعت كل شطر في القالب نفسه باستخدام نفس التقنية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما تتدفق أكتوبر في القالب ، فإنه يمكن أن يكون من الصعب الحفاظ على المشيمة في الاتجاه الصحيح. تأمين مكان المشيمة في النصف خلال عقد النسيج بالملقط. صب ببطء أكتوبر حل في القالب وتجنب إنتاج أي فقاعات. للمشيمة E10.5 ، عقد نصف بواسطة ملقط النسيج والباقي في النصف الأنسجة الأخرى ضد خارج ملقط. صب ببطء أكتوبر الحل كما هو موضح لE12.5 مشيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة يتم تعبئة القالب مع أكتوبر ، ومكان العفن بسرعة على الثلج الجاف ، سوف تتحول أكتوبر ميض أبيض تجميد الأنسجة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان القالب داخل حقيبة بلاستيكية صغيرة تحتوي على Drierite وتخزينها مباشرة في الثلاجة -80 درجة مئوية. </li></ol>

<ol>
	<li>Gekas, C., Dieterlen-Lievre, F., Orkin, S. H., Mikkola, H. K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+placenta+is+a+niche+for+hematopoietic+stem+cells.">The placenta is a niche for hematopoietic stem cells.</a> Dev Cell. 8, 365-375 (2005).</li><li>Rhodes, K. E., Gekas, C., Wang, Y., Lux, C. T., Francis, C. S., Chan, D. N., Conway, S., Orkin, S. H., Yoder, M. C., Mikkola, H. K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Emergence+of+Hematopoietic+Stem+Cells+Is+Initiated+in+the+Placental+Vasculature+in+the+Absence+of+Circulation.">The Emergence of Hematopoietic Stem Cells Is Initiated in the Placental Vasculature in the Absence of Circulation.</a> Cell Stem Cell. 2, 252-263 (2008).</li></ol>

والإجراءات التجريبية وصفها في هذا البروتوكول يسمح للعزلة والتصور من نسيج المشيمة والخلايا الجذعية المكونة للدم والسلف. للحصول على ملخص شامل عن العائد المتوقع الخليوي وعدد من HSCs في المشيمة وغيرها من الأجهزة المكونة للدم الجنين خلال مراحل تطوره الجنين نشير إلى جيكاس ، وآخرون. 200...

قائمة المواد : 100mM الجلوكوز 10MM NaN3 15 مل أنابيب مخروطية دينار بحريني () 16 - G ، G - 18 ، G - 20 ، 22 و 25 G - G - الإبر (دينار بحريني) محلول السكروز 30 ٪ 35mm أطباق بتري (دينار بحريني) 4 ٪ لامتصاص العرق 50 -- خلية م المرشحات (Celltrics) 5 مل المحاقن (دينار بحريني) الفوسفاتيز القلوية الركيزة كيت الأول (ناقلات الأحمر ، المتجهات) الفوسفاتيز القلوية الركيزة كيت الثالث (ناقلات الأزرق ، المتجهات) المضادات الحيوية (البنسلين / الستربتوميسين ، P / S) حل كولاجيناز النوع الأول (سيجما) Cryomold العينة الفينيل يعاد قوالب (10MM X 10MM × 5 ملم ، والأنسجة تيك) Cytokeratin جسم الابتدائية (DakoCytomation) ملقط تشريح ، الفولاذ المقاوم للصدأ أو التيتانيوم ، وعدد 5 أو 55 Drierite الجنين مصل البقر (FBS) Fisherbrand مجهر الشرائح البلاستيكية ميلر (فيشر) أوكسيديز الجلوكوز 1000u/ml Levamisole (ناقلات) تصاعد وسائل الإعلام ، على أساس مائي متوسطة التركيب (VectamountTM AQ) الحصان العادي المصل (ناقلات) درجة الحرارة المثلى للقطع (أكتوبر ، الأنسجة تيك) البيروكسيداز الركيزة كيت DAB (ناقلات) التخزين المؤقت المالحة الفوسفات (PBS) مع الكالسيوم / المغنيسيوم (ث + CA2 / Mg2 +) التخزين المؤقت المالحة الفوسفات (PBS) دون الكالسيوم / المغنيسيوم (ث / س + CA2 / Mg2 +) صندوق من البلاستيك الشريحة (100 يحمل شرائح) أنابيب البلاستيك (PVC Nalgene 180 Autoclavable غير سامة) البولي بروبلين أنبوب اختبار جولة القاع ، 5 مل (12x75 ملم ، BD فالكون) بروتين K 20mg/ml محلول (Amresco) المنتجات البحوث الدولية عنق الرحم سوبر كورب القلم HT علامات الشرائح * (2،5 مم ، فيشر) الأنسجة ثقافة يعامل على شكل حرف يو (ذهابا والسفلي) لوحات 96 - جيدا أو جيدا 24 دينار بحريني (فالكون) Tween20 ، SigmaUltra (سيجما) Tyramide كيت التضخيم (Invitrogen) Vectastain ABC القلوية الفوسفاتيز قياسي كيت (ناقلات) Vectastain ABC قياسي النخبة كيت (ناقلات)

isolation and analysis of hematopoietic stem cells from the placenta

الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) لديها القدرة على تجديد الذات وتوليد كل أنواع الخلايا من الدم في جميع أنحاء الأنساب عمر الفرد. جميع HSCs تظهر خلال نمو الجنين ، وبعد ذلك يتم الاحتفاظ حجمها تجمع بواسطة الذاتي تجديد الانقسامات الخلوية. تحديد المنشأ التشريحي للHSCs والأحداث الحاسمة التنموية التي تنظم عملية التنمية HSC تعقدت كمواقع تشريحية كثيرة خلال المشاركة تكون الدم في الجنين. مؤخرا ، حددنا المشيمة ، بوصفها الجهاز الرئيسي للدم حيث يتم إنشاء HSCs وتوسعت في محاريب microenvironmental فريد (جيكاس ، وآخرون 2005 ، ورودس ، وآخرون 2008). وبالتالي فإن المشيمة مصدر مهم من خلال ظهور HSCs وتوسعها الأولية. في هذه المقالة ، نعرض أساليب تشريح للعزلة المشيمة من الفئران وE10.5 E12.5 الأجنة ، المقابلة لمراحل تطور بدء HSCs والذروة في حجم تجمع HSC في المشيمة ، على التوالي. بالإضافة إلى ذلك ، فإننا نقدم بروتوكول الأمثل لتفارق الأنزيمية والميكانيكية للأنسجة المشيمة وحيدة الخلية في تعليق لاستخدامها في التدفق الخلوي أو المقايسات الفنية. لقد وجدنا أن استخدام كولاجيناز عن وحيدة الخلية تعليق المشيمة يعطي غلة كافية من HSCs. عامل مهم يؤثر HSC العائد من المشيمة هي درجة التفكك الميكانيكية قبل ، ومدتها ، ومعالجة القرنية. ونحن نقدم أيضا على بروتوكول لإعداد الثابتة المجمدة أقسام النسيج المشيمي لوضع التصور HSCs بواسطة المناعية الخلوية في مطلبهم دقيقة. كما لا يتم الاحتفاظ مستضدات محددة للدم أثناء إعداد الأبواب جزءا لا يتجزأ من البارافين ، ونحن نستخدم بشكل روتيني المجمدة أقسام ثابتة لتوطين HSCs المشيمة والأسلاف.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta at JoVE.com

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

حددنا المشيمة ، بوصفها الجهاز الرئيسي للدم خلال التنمية. وجدنا أن كلا إنشاء خلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) ، وتوسعت في المشيمة في محاريب microenvironmental فريدة من نوعها. هنا ، نحن تصف التقنيات التجريبية المطلوبة للعزلة وتصور HSCs في المشيمة الماوس.

العزلة وتحليل الخلايا الجذعية المكونة للدم من المشيمة

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

isolation-and-analysis-of-hematopoietic-stem-cells-from-the-placenta

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

A Hierarchical Stem-Cell System: Blood Cell Formation

SCIENTISTS IN ACTION

20.2K Views.  University of California, Los Angeles. حددنا المشيمة ، بوصفها الجهاز الرئيسي للدم خلال التنمية. وجدنا أن كلا إنشاء خلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) ، وتوسعت في المشيمة في محاريب microenvironmental فريدة من نوعها. هنا ، نحن تصف التقنيات التجريبية المطلوبة للعزلة وتصور HSCs في المشيمة الماوس.

Video: Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

العزلة وزرع الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs)

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

اشتقاق خلايا الجذعية المكونة للدم من الفئران خلايا الجذعية الجنينية

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Isolation of Early Hematopoietic Stem Cells from Murine Yolk Sac and AGM

In the mouse embryo, early hematopoiesis occurs simultaneously in multiple organs, which includes the yolk sac and aorta-gonad-mesonephros region. These regions are crucial in establishing the blood system in the embryos and leads to the eventual movement of stem cells into the fetal liver and then development of adult stem cells in the bonemarrow. Early hematopoietic stem cells can be isolated from these organs through microdissection of the embryo followed by flow cytometric sorting to obtain a more pure population. It remains unclear how these stem cell populations contribute to the fetal and adult stem cell pool.   Also, our lab investigates how early stem cells functionally differ from fetal and adult hematopoietic stem cells. Furthermore, our lab sorts different populations of hematopoietic stem cells and test their functional role in the context of a variety of genetic models. In this video, we demonstrate the micro-dissection procedure we commonly use and also show the results of a typical FACS plotfter isolating these rare populations, it is possible to perform a variety of functional assays including: colony assays and bone marrow transplants. 



This video shows how to micro-dissect the yolk sac and aorta-gonad-mesonephros region from embryos and use flow cytometry to sort hematopoietic stem cells.

عزل الخلايا الجذعية المكونة للدم في وقت مبكر من الكيس المحي الفئران وAGM

In the mouse embryo, early hematopoiesis occurs simultaneously in multiple organs, which includes the yolk sac and aorta-gonad-mesonephros region. These ...

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of non-pigmented inner and pigmented outer cell layers, and the clonal RSC colonies that arise from a single pigmented cell from the CE are made up of both pigmented and non-pigmented cells which can be differentiated to form all the cell types of the neural retina and the RPE. There is some controversy about whether all the cells within the spheres all contain at least some pigment4; however the cells are still capable of forming the different cell types found within the neural retina1-3. In some species, such as amphibians and fish, their eyes are capable of regeneration after injury5, however; the mammalian eye shows no such regenerative properties. We seek to identify the stem cell in vivo and to understand the mechanisms that keep the mammalian retinal stem cells quiescent6-8, even after injury as well as using them as a potential source of cells to help repair physical or genetic models of eye injury through transplantation9-12. Here we describe how to isolate the ciliary epithelial cells from the mouse eye and grow them in culture in order to form the clonal retinal stem cell spheres. Since there are no known markers of the stem cell in vivo, these spheres are the only known way to prospectively identify the stem cell population within the ciliary epithelium of the eye.

In this video, we will demonstrate how to isolate retinal stem cells from the ciliary epithelium of the mouse eye and grow them in culture to form clonal retinal spheres. The spheres that are isolated possess the cardinal properties of stem cells: self-renewal and multipotentiality.

عزل الخلايا الجذعية من شبكية العين بالعين ماوس

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells (HSCs) differentiate into oligopotent progenitors, committed precursors and mature red blood cells 1. This process is regulated for a large part at the level of gene expression, whereby specific transcription factors activate lineage-specific genes while concomitantly repressing genes that are specific to other cell types 2. Studies on transcription factors regulating erythropoiesis are often performed using human and murine cell lines that represent, to some extent, erythroid cells at given stages of differentiation 3-5. However transformed cell lines can only partially mimic erythroid cells and most importantly they do not allow one to comprehensibly study the dynamic changes that occur as cells progress through many stages towards their final erythroid fate. Therefore, a current challenge remains the development of a protocol to obtain relatively homogenous populations of primary HSCs and erythroid cells at various stages of differentiation in quantities that are sufficient to perform genomics and proteomics experiments.
Here we describe an ex vivo cell culture protocol to induce erythroid differentiation from human hematopoietic stem/progenitor cells that have been isolated from either cord blood, bone marrow, or adult peripheral blood mobilized with G-CSF (leukapheresis). This culture system, initially developed by the Douay laboratory 6, uses cytokines and co-culture on mesenchymal cells to mimic the bone marrow microenvironment. Using this ex vivo differentiation protocol, we observe a strong amplification of erythroid progenitors, an induction of differentiation exclusively towards the erythroid lineage and a complete maturation to the stage of enucleated red blood cells. Thus, this system provides an opportunity to study the molecular mechanism of transcriptional regulation as hematopoietic stem cells progress along the erythroid lineage. 
Studying erythropoiesis at the transcriptional level also requires the ability to over-express or knockdown specific factors in primary erythroid cells. For this purpose, we use a lentivirus-mediated gene delivery system that allows for the efficient infection of both dividing and non-dividing cells 7. Here we show that we are able to efficiently knockdown the transcription factor TAL1 in primary human erythroid cells. In addition, GFP expression demonstrates an efficiency of lentiviral infection close to 90%. Thus, our protocol provides a highly useful system for characterization of the regulatory network of transcription factors that control erythropoiesis.

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

An ex vivo protocol to generate mature human red blood cells from hematopoietic stem/progenitors is described. Additionally we describe an efficient lentiviral-delivery method to knockdown the transcription factor TAL1 in primary erythroid cells. The efficiency of lentivirus mediated gene delivery is demonstrated using GFP expressing viruses.

Lentiviral بوساطة خلال ضربة قاضية السابقين فيفو تكون الكريات الحمر في الإنسان خلايا الجذعية المكونة للدم

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs constitute a minute cell population of pluripotent cells capable of generating all blood cell lineages for a life-time1. The molecular dissection of HSCs homeostasis in the bone marrow has important implications in hematopoiesis, oncology and regenerative medicine. We describe the labeling protocol with fluorescent antibodies and the electronic gating procedure in flow cytometry to score hematopoietic progenitor subsets and HSCs distribution in individual mice (Fig. 1). In addition, we describe a method to extensively enrich hematopoietic progenitors as well as long-term (LT) and short term (ST) reconstituting HSCs from pooled bone marrow cell suspensions by magnetic enrichment of cells expressing c-Kit. The resulting cell preparation can be used to sort selected subsets for in vitro and in vivo functional studies (Fig. 2).
Both trabecular osteoblasts2,3 and sinusoidal endothelium4 constitute functional niches supporting HSCs in the bone marrow. Several mechanisms in the osteoblastic niche, including a subset of N-cadherin+ osteoblasts3 and interaction of the receptor tyrosine kinase Tie2 expressed in HSCs with its ligand angiopoietin-15 concur in determining HSCs quiescence. "Hibernation" in the bone marrow is crucial to protect HSCs from replication and eventual exhaustion upon excessive cycling activity6. Exogenous stimuli acting on cells of the innate immune system such as Toll-like receptor ligands7 and interferon-&alpha;6 can also induce proliferation and differentiation of HSCs into lineage committed progenitors. Recently, a population of dormant mouse HSCs within the lin- c-Kit+ Sca-1+ CD150+ CD48- CD34- population has been described8. Sorting of cells based on CD34 expression from the hematopoietic progenitors-enriched cell suspension as described here allows the isolation of both quiescent self-renewing LT-HSCs and ST-HSCs9. A similar procedure based on depletion of lineage positive cells and sorting of LT-HSC with CD48 and Flk2 antibodies has been previously described10. In the present report we provide a protocol for the phenotypic characterization and ex vivo cell cycle analysis of hematopoietic progenitors, which can be useful for monitoring hematopoiesis in different physiological and pathological conditions. Moreover, we describe a FACS sorting procedure for HSCs, which can be used to define factors and mechanisms regulating their self-renewal, expansion and differentiation in cell biology and signal transduction assays as well as for transplantation.

A method to analyse the distribution of bone marrow hematopoietic progenitors in flow cytometry as well as to efficiently isolate highly purified hematopoietic stem cells (HSCs) is described. The isolation procedure is essentially based on magnetic enrichment of c-Kit+ cells and cell sorting to purify HSCs for cellular and molecular studies.

المظهري التحليل وعزل الخلايا الجذعية المكونة للدم الفئران والأسلاف النسب، الملتزم

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

الاستقراء وتحليل الظهارية الوسيطة الانتقالية ل

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

العزلة وثقافة الأسنان طلائي الخلايا الجذعية من الكبار ماوس القاطعة

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Retroviral Infection of Murine Embryonic Stem Cell Derived Embryoid Body Cells for Analysis of Hematopoietic Differentiation

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for investigating the development of early hematopoietic progenitor cells (HPCs). Gene expression in ESCs can be manipulated by several techniques that allow the role for individual molecules in development to be determined. One difficulty is that expression of specific genes often has different phenotypic effects dependent on their temporal expression. This problem can be circumvented by the generation of ESCs that inducibly express a gene of interest using technology such as the doxycycline-inducible transgene system. However, generation of these inducible cell lines is costly and time consuming. Described here is a method for disaggregating ESC-derived embryoid bodies (EBs) into single cell suspensions, retrovirally infecting the cell suspensions, and then reforming the EBs by hanging drop. Downstream differentiation is then evaluated by flow cytometry. Using this protocol, it was demonstrated that exogenous expression of a microRNA gene at the beginning of ESC differentiation blocks HPC generation. However, when expressed in EB derived cells after nascent mesoderm is produced, the microRNA gene enhances hematopoietic differentiation. This method is useful for investigating the role of genes after specific germ layer tissue is derived.

Manipulating temporal gene expression in differentiating embryonic stem cells (ESCs) can be achieved using inducible gene systems. However, generation of these cell lines is costly and time consuming. This protocol achieves rapid expression of a transgene in differentiating ES-derived cells and subsequent analysis of downstream hematopoietic differentiation.

عدوى فيروسات الفئران الجنينية الجذعية المستمدة خلية خلايا الجسم مضغي لتحليل التمايز لدم

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for ...

Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as leukemia and lymphoma. Elucidating the mechanisms controlling HSCs self-renewal and differentiation is important for application of HSCs for research and clinical uses. However, it is not possible to obtain large quantity of HSCs due to their inability to proliferate in vitro. To overcome this hurdle, we used a mouse bone marrow derived cell line, the EML (Erythroid, Myeloid, and Lymphocytic) cell line, as a model system for this study.
RNA-sequencing (RNA-Seq) has been increasingly used to replace microarray for gene expression studies. We report here a detailed method of using RNA-Seq technology to investigate the potential key factors in regulation of EML cell self-renewal and differentiation. The protocol provided in this paper is divided into three parts. The first part explains how to culture EML cells and separate Lin-CD34+ and Lin-CD34- cells. The second part of the protocol offers detailed procedures for total RNA preparation and the subsequent library construction for high-throughput sequencing. The last part describes the method for RNA-Seq data analysis and explains how to use the data to identify differentially expressed transcription factors between Lin-CD34+ and Lin-CD34- cells. The most significantly differentially expressed transcription factors were identified to be the potential key regulators controlling EML cell self-renewal and differentiation. In the discussion section of this paper, we highlight the key steps for successful performance of this experiment.
In summary, this paper offers a method of using RNA-Seq technology to identify potential regulators of self-renewal and differentiation in EML cells. The key factors identified are subjected to downstream functional analysis in vitro and in vivo.

RNA-sequencing and bioinformatics analyses were used to identify significantly and differentially expressed transcription factors in Lin-CD34+ and Lin-CD34- subpopulations of mouse EMLcells. These transcription factors might play important roles in determining the switch between self-renewing Lin-CD34+ and partially differentiated Lin-CD34- cells.

تحديد العوامل الرئيسية تنظيم-تجديد الذات والتمايز في الخلايا المكونة للدم EML السلائف بواسطة تحليل الحمض النووي الريبي التسلسل

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as ...